Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

Die Empfindlichkeit der DNP-assistierten MAS-NMR-Spektroskopie ermöglicht es uns, Proteine in intakten Zellen in ihrer endogenen Konzentration zu charakterisieren. Diese Anwendung erfordert eine sorgfältige Probenhandhabung. Einige Morphologien bleiben erhalten und Zellen sind lebensfähig, wenn sie mit diesem Protokoll kryogen in das Spektrometer überführt werden.

Das Einführen des kalten Rotors kann zu Feuchtigkeits- und Eisbildung führen, die mechanisch verhindern kann, dass sich die Probe hochdreht. Diese Demonstration wird Experimente leiten, um den kryogenen Transfer mit Zuversicht durchzuführen. Legen Sie zunächst ein Kissen aus einem Stück Taschentuch oder Papiertuch unter den Deckel und auf den Boden des Kryofläschchens.

Setzen Sie den 3,2 Millimeter großen Saphirrotor in das mit dem Seidenpapier gepolsterte Kryofläschchen ein, wobei das markierte Ende zum Boden des Fläschchens zeigt. Frieren Sie den Rotor langsam ein, indem Sie das Fläschchen in einen Kühlbehälter mit kontrollierter Rate stellen und den Behälter für mindestens drei Stunden in einen Gefrierschrank mit 80 Grad Celsius stellen. Das kryogene Fläschchen mit dem gefrorenen Rotor wird in einen kleinen Vakuumkolben gegeben, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist.

Verwenden Sie die Isolierflasche, um die Probe zum Spektrometer zu transportieren. Füllen Sie eine trockene, wärmeisolierte Weithalsschaum-Isolierflasche mit 500 Millilitern bis einem Liter flüssigem Stickstoff. Nehmen Sie das kryogene Fläschchen aus dem Transferkolben und halten Sie es knapp über die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs, um es vor der Atmosphäre zu schützen.

Während Sie das kryogene Fläschchen mit der Öffnung des Fläschchens leicht nach unten halten, schrauben Sie die Kappe ab und lassen Sie den Rotor in das Flüssigstickstoffbad gleiten. Kühle ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem du es in den flüssigen Stickstoff tauchst. Übertragen Sie den Rotor unter der Oberfläche des Flüssigstickstoffbads mit einer Pinzette in das Mikrozentrifugenröhrchen, wobei die Antriebsspitze zum Boden des Röhrchens und die Markierungen zur Öffnung zeigen.

Halten Sie das Rohr mit dem Rotor unter flüssigem Stickstoff mit einer Pinzette am Hals fest. Halten Sie den NMR-Probenfänger mit einer zweiten Pinzette über die Oberfläche des flüssigen Stickstoffs, die in einem spitzen Winkel zum Mikrozentrifugenröhrchen geneigt ist. Um den Rotor vom NMR-Probenfänger auf das NMR-Spektrometer zu übertragen, versetzen Sie den Kryoschrank durch Drücken des Auswurfs in den Auswurfmodus.

Führen Sie das offene Ende des NMR-Probenfängers in das Mikrozentrifugenröhrchen ein, während es sich noch unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs befindet. Heben Sie sowohl das Mikrozentrifugenröhrchen als auch den NMR-Probenfänger an, damit der Rotor in den Probenfänger fallen kann. Schütteln Sie den Probenfänger und das Röhrchen, wenn der Rotor an der Felge hängen bleibt.

Lassen Sie das leere Mikrozentrifugenröhrchen auf dem NMR-Probenfänger, um den Rotor vor Luft zu schützen. Nehmen Sie den anderen leeren Probenfänger von der Sonde und legen Sie ihn auf den Boden. Übertragen Sie den NMR-Probenfänger mit dem Rotor in die andere Hand.

Entfernen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen und setzen Sie es sofort in die Sonde ein. Geben Sie der Person, die den Kryoschrank bedient, ein Zeichen, um Stopp, Auswerfen und Einsetzen zu drücken. Drehen Sie die Probe auf die gewünschte Schleudergeschwindigkeit, indem Sie den Lager- und Antriebsströmungsdruck einstellen.

Gießen Sie 500 Milliliter bis einen Liter flüssigen Stickstoff in eine Weithalsschaum-Isolierflasche und stellen Sie das Bad unter das Spektrometer. Tauchen Sie das leere Kryofläschchen mit einem Stück Seidenpapier in das Flüssigstickstoffbad. Reduzieren Sie die Schleudergeschwindigkeit auf null Kilohertz, indem Sie den Antriebs- und Lagergasfluss herunterfahren, und werfen Sie den Rotor aus, indem Sie in den Auswerfermodus wechseln.

Bei eingeschaltetem Auswurfmodus den Probenfänger von der Sonde entfernen und den Rotor direkt in den Weithalsschaumkolben mit flüssigem Stickstoff fallen lassen. Übertragen Sie den Rotor mit einer vorgekühlten Pinzette in das vorgekühlte Kryofläschchen unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs. Kühle den Deckel des Kryofläschchens vor, indem du ihn in flüssigen Stickstoff tauchst.

Nehmen Sie das Fläschchen mit dem Rotor und flüssigem Stickstoff aus dem Bad und verschließen Sie das Röhrchen mit der vorgekühlten Kappe. Tauchen Sie das kryogene Fläschchen wieder in flüssigen Stickstoff. Die Probe kann für die weitere Analyse in ein längerfristiges Flüssigstickstofflager überführt oder sofort ausgepackt werden.

Das kryogene Einsetzen von vorgefrorenen Proben von Säugetierzellen in das NMR-Spektrometer unterstützt die Lebensfähigkeit während des gesamten NMR-Experiments. Unter Verwendung dieses Protokolls ist die Trypanblau-Permeabilität von Säugetierzellen nach MAS-NMR ähnlich wie die von Zellen, die keiner Temperaturänderung ausgesetzt sind. Wenn Zellen langsam eingefroren und dann vor dem Einsetzen auf Raumtemperatur erwärmt werden, sinkt die zelluläre Lebensfähigkeit auf weniger als 10 %Währenddessen unterstützt das kryogene Einfügen von gefrorenen Proben von Säugetierzellen die Lebensfähigkeit der Zellen während des gesamten NMR-Experiments.

Wenn Sie versuchen, ein Protokoll durchzuführen, bitten Sie um Hilfe beim Drücken, Auswerfen und Hochdrehen der Probe, damit die Probe in die Sonde eingeführt werden kann, bevor sie sich erwärmt, und stellen Sie sicher, dass keine Feuchtigkeit in die Sonde eingebracht wird, um sicherzustellen, dass das Spektrometer viele Wochen lang kalt läuft. Dieses Protokoll ist auf alle Systeme anwendbar, bei denen Temperaturschwankungen die Integrität der Probe beeinträchtigen könnten, wie z. B. Gefrierreaktionen oder die Charakterisierung von Zwischenprodukten mit gefangenen Reaktionen, die Enzymologie und die Proteinfaltung.