4D-Mikroskopie: Entschlüsselung der Caenorhabditis elegans Embryonalentwicklung mittels Nomarski-Mikroskopie

Die 4D-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug, um die vollständige Zelllinie eines C.elegans-Embryos oder einer anderen Probe auf der Ebene einer einzelnen Zelle zu rekonstruieren. Nomarski-Optiken können verwendet werden, um Veränderungen der Zellform während der Entwicklung mit einem Standardmikroskop und Durchlicht hervorzuheben, ohne dass transgene Tiere oder Fluoreszenzmikroskopie erforderlich sind. Das 4D-Mikroskop ermöglicht die Untersuchung des Zellzyklus, der Proliferation, der Differenzierung und der Apoptose in C.elegans und in anderen Systemen wie Säugetieren oder Gewebezellkulturen.

Die Abstammungsverfolgung von Zellen auf DIC-Bildern wird manuell durchgeführt. Es ist zeitaufwändig und erfordert etwas Übung, um eine vollständige Embryonenanalyse durchzuführen. Das Verfahren wird von Begona Ezcurra, einer Technikerin in unserem Labor, vorgeführt.

Stellen Sie vor der Vorbereitung der Embryonen die Aufnahmetemperatur des 4D-Mikroskops auf 15, 20 oder 25 Grad Celsius ein und stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es 1.500, 30 Z-Stapel in der Brennebene im Abstand von einem Mikrometer mit einem Abstand von 30 Sekunden zwischen den Anfängen jedes Stapels aufzeichnet. Als nächstes aliquotieren Sie 500 bis 1000 Mikroliter flüssiges 4,5%-Agar in drei Millimeter große Glasröhrchen und versiegeln die Röhrchen sorgfältig mit Wachsfilm, um ein Austrocknen zu vermeiden. Um ein dünnes, homogenes Agar-Pad für die Aufnahme vorzubereiten, erhitzen und aliquotieren Sie den Agar vorsichtig über einem Alkoholbrenner, bis der Agar geschmolzen ist, und legen Sie das Röhrchen in einen 80 Grad Celsius heißen Block.

Legen Sie einen Glasobjektträger auf ein Stück Plastik und verwenden Sie eine Weidepipette in einer Hand, um einen kleinen Tropfen geschmolzenen Agar in die Mitte des Objektträgers zu geben, dann verwenden Sie sofort die andere Hand, um einen zweiten Objektträger auf den Agartropfen zu legen, um ein sehr dünnes Agarpad zu erzeugen. Um die Embryonen zu montieren, werden zunächst mit einem Picker 5 bis 10 trächtige Hermaphroditen unter einem Stereomikroskop in ein mit Wasser gefülltes Uhrmacherglas überführt. Schneiden Sie mit einem Skalpell die hermaphroditischen Nematoden auf und extrahieren Sie ein bis vier frühe Eizellen aus der Gebärmutter.

Schieben Sie den oberen Schieber vorsichtig vom Agar-Pad ab und verwenden Sie ein Kapillarröhrchen, um ein frühes Ei in die Mitte des Pads zu legen. Verwenden Sie eine Wimper, die auf das Ende eines Zahnstochers geklebt ist, um die Position des Eies nach Bedarf anzupassen, und verwenden Sie die Kapillarpipette, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Verwenden Sie ein Skalpell, um den Deckglas langsam und schräg über das Präparat zu legen, bevor Sie mit einer Mikropipette 3/4 des Raumes um das Agarpad mit Wasser füllen.

Verschließen Sie dann den Deckglas mit Vaseline, um ein Austrocknen bei langen Aufnahmezeiträumen zu vermeiden. Legen Sie den Objektträger nach dem Versiegeln auf den 4D-Mikroskoptisch und verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, um den Embryo in den Fokus zu bringen. Wählen Sie das 100-fache Immersionsobjektiv und fokussieren Sie den Kondensor.

Öffnen Sie die Apertur des Kondensors vollständig und schließen Sie die Feldblende, um eine höhere numerische Apertur und eine höhere Auflösung zu erzielen. Drehen Sie das Wollaston-Prisma, um ein dreidimensionales Bild des Embryos zu erhalten, das auf einer Seite beleuchtet ist, und drehen Sie dann das Prisma in die andere Richtung, um den Effekt zu erzielen, dass der Embryo auf der anderen Seite beleuchtet wird, und beginnen Sie mit der 4D-Aufnahme. Um die Zelllinie eines in 4D-Filmen aufgezeichneten Embryos zu rekonstruieren, öffnen Sie die Abstammungsverfolgungssoftware und wählen Sie Datei und Neues Projekt.

Wählen Sie je nach Aufzeichnungstemperatur die entsprechende Vorlage für die Zelllinie aus und stellen Sie die Scananzahl auf 1500 ein. Die Zeit zwischen den Scans beträgt 30 Sekunden, die Anzahl der Pegel bis 30 und der Abstand zwischen den Pegeln einen Mikrometer. Wählen Sie die Bilddatei, das Format und das Verzeichnis aus, in dem die Bilder gespeichert wurden.

Wählen Sie aus, ob die Bilder als Einzelbilder oder als Z-Stapel mit mehreren Bildern gespeichert wurden, und legen Sie die Dateibenennung und die Bildformate fest. Klicken Sie dann auf Kanalverarbeitung aktiviert, um die entsprechenden Lichtkanäle des 4D-Films zu erkennen und einzustellen. Initiieren Sie für die Nachverfolgung der Zellabstammung die Software zur Nachverfolgung der Zellabstammung.

Ein Videofenster und ein Fenster mit der Zellenabstammung werden angezeigt. Wählen Sie im Abstammungsfenster den Abstammungszweig aus und klicken Sie im Videofenster auf den Zellkern, der dieser Zelle entspricht. Spielen Sie den 4D-Film vorwärts, rückwärts oder eine Ebene nach oben oder unten ab, um der interessierenden Zelle räumlich über die Zeit zu folgen.

Klicken Sie regelmäßig auf den Zellkern, um einen Punkt im Linienzweig zu generieren und die Raumkoordinaten der Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt zu registrieren. Dadurch sind Zelllinienverläufe und 3D-Rekonstruktionen des Embryos möglich. Drücken Sie dann die Eingabetaste, um die Mitose zu markieren, und wählen Sie eine der Tochterzellen aus, um die Zellprogression wie gerade gezeigt zu verfolgen.

Wiederholen Sie die Analyse für den Rest der embryonalen Zellen, um die gesamte Zelllinie zu verfolgen oder um bestimmte Zellen von Interesse zu verfolgen, z. B. solche, die sich einer Apoptose unterziehen. Um den Vergleich von mutierten Abstammungslinien von Interesse mit der stereotypen Wildtyp-Zelllinie von C.elegans zu ermöglichen. Wurmplatten werden in Kartons inkubiert, um Kondensation zu vermeiden.

Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, kann die Zelllinie mit Hilfe einer Abstammungsverfolgungssoftware rekonstruiert werden, wie gezeigt. Zum Beispiel wurde in dieser repräsentativen Analyse die verfolgte gsr-1-mutierte Embryozelllinie mit der C.elegans-Wildtyp-Linie verglichen. Und es wurde der Nachweis einer fortschreitenden Verzögerung des Zellzyklus während der Embryonalentwicklung festgestellt

In der Folge verharrten mutierte Embryonen in Zwischenstadien, während Wildtyp-Embryonen fortschritten und schließlich als Larven schlüpften. Darüber hinaus können weitere wichtige Merkmale der Embryonalentwicklung, wie z.B. die Apoptose, mittels 4D-Mikroskopie dynamisch sichtbar gemacht werden. Die Herkunftsverfolgung der DIC-Bilder muss manuell verarbeitet werden.

Eine Softwareverarbeitung von unmarkierten Zellen im sichtbaren Licht in frühen Entwicklungsstadien ist für die Embryoanalyse nicht genau. Die Anwendung des Bilderkennungssystems auf dem Gebiet der Mikroskopie des sichtbaren Lichts wird einen großen Fortschritt auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie bringen.