Name: Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Erfahren Sie ein modifiziertes photothrombotisches Schlaganfallmodell mit Thrombin und Rose Bengal zur Erzeugung fibrinreicher Blutgerinnsel bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präklinische Studien zur Thrombolyse mit tPA.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse unterstützt (NS108763, NS100419, NS095064 und HD080429 an C.Y. K. und NS106592 an Y.Y.S.).

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt und folgt der Richtlinie der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Abbildung 1A zeigt die Abfolge der chirurgischen Eingriffe dieses Protokolls.
1. Aufbau der Chirurgie
<ol><li>Legen Sie mindestens 15 Minuten vor der Operation ein Wärmekissen mit einer Temperatureinstellung von 37 °C auf den Kleintieradapter. Bereiten Sie eine Nasenklammerrolle für den Adapter vor, die die Drehung des Tierkopfes ermöglicht. Bereiten Sie die Anästhetika Ketamin (60 mg/kg)/ Xylazin (10 mg/kg) vor.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente, einschließlich Scheren, Pinzetten, Mikronadelhalter, Hämostaten, Wattestäbchen und Nähte, mit einem Autoklaven (121 °C bei 15 psi für 60 Minuten). Bereiten Sie Gewebekleber und Augensalbe vor. Bereiten Sie die 532-nm-Laserschutzbrille für Chirurgen vor. HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt ein wichtiges Verfahren zur Überlebenschirurgie und sollte mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.</li>
	<li>Richten Sie das Beleuchtungssystem mit einer 532-nm-Laserquelle ein. Bereite einen Zahnarztbohrer vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Rosenbengalenlösung in Kochsalzlösung (10 mg/ml) zu. Ein aliquotes Rinderthrombin (0,1 U/μl) auf einen Eiskübel geben.</li>
	<li>Injizieren Sie der Maus Ketoprofen (4,0 mg/kg) 30 Minuten vor der Operation subkutan als Analgesie oder verwenden Sie das von den lokalen institutionellen Richtlinien empfohlene Analgetikum-Schema.</li>
</ol>2. Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis
<ol><li>10-14 Wochen alte männliche C57BL/6NCrl-Mäuse mit einem Gewicht von 22 bis 30 g durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (60 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesieren. HINWEIS: Der gesamte chirurgische Eingriff, der die Ligatur der ipsilateralen Arteria carotis communis durch die Überwachung des zerebralen Blutflusses umfasst, wird voraussichtlich ~120 Minuten dauern. Das Anästhesieschema ist in der Regel für die gesamte Dauer wirksam, aber die Anästhesietiefe sollte mindestens alle 15 Minuten neu beurteilt werden. Beim Erlernen dieser Verfahren kann es notwendig sein, die Anästhesie neu zu dosieren.</li>
	<li>Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist. Entfernen Sie die Haare am linken Hals für die CCA-Ligatur und den Kopf für die Schädelausdünnung mit der Haarentfernungscreme.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Kleintieradapter. Sterilisieren Sie den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Povidon-Jod und 70%igem Ethanol abwischen.</li>
	<li>Befestigen Sie den Mauskopf mit Ohrbügeln. Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen 0,5 cm langen Schnitt der linken Halswirbelsäule mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette etwa 0,2 cm seitlich der Mittellinie.</li>
	<li>Verwenden Sie eine feine gezackte Pinzette, um das Weichgewebe und die Faszie auseinander zu ziehen, um die linke Halsschlagader (LCCA) freizulegen. Trennen Sie vorsichtig den linken CCA vom Vagusnerv mit einer feinen, glatten Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie eine permanente Doppelknotennaht um die LCCA mit 5-0-Seidennaht, die in 20-mm-Segmente geschnitten wird, und verschließen Sie die Wunde dann mit sterilen Wundclips.</li>
</ol>3. Ausdünnung des Schädels über dem MCA-Ast und Photoaktivierung
<ol><li>Drehen Sie die Maus in die Bauchlage des Kleintieradapters. Drehen Sie die Nasenbügelrolle um 15°. Sterilisieren Sie den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Betadin und 70%igem Ethanol abwischen.</li>
	<li>Machen Sie einen 0,8 cm langen Schnitt in der Kopfhaut mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette entlang des linken Auges und Ohrs, um den Schläfenmuskel freizulegen, der sich zwischen Auge und Ohr befindet (Abbildung 1B).</li>
	<li>Unter dem Präpariermikroskop wird mit einer feinen gezackten Zange ein 0,5 cm langer Schnitt entlang des Randes des Schläfenmuskels am linken Scheitelbein gemacht. Machen Sie einen zweiten 0,3 cm langen vertikalen Schnitt am Schläfenmuskel mit einer Mikroschere. Ziehen Sie den Schläfenmuskel zurück, um den Rand des Scheitelknochens und des Plattenepithelknochens freizulegen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Markierung der koronalen Naht zwischen dem Stirn- und dem Scheitelbein visualisieren (Abbildung 1B,C).</li>
	<li>Befeuchten Sie den Schädel, indem Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um das linke MCA freizulegen. Markieren Sie den proximalen MCA-Ast auf dem Plattenepithelknochen mit einem Markerstift. Zeichnen Sie mit dem pneumatischen Dentalbohrer vorsichtig einen Kreis mit einem Durchmesser von etwa 1 mm, der den markierten Bereich umgibt (Gratgeschwindigkeitseinstellung auf 50 % des Drehzahlreglers), und verdünnen Sie dann den Schädel etwa 0,2 mm tief, ohne die darunter liegende Dura zu berühren. Stoppen Sie das Bohren, bis eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt.</li>
	<li>Mischen Sie die Thrombin- (T, 0,1 U/μl, 80 U/kg) und Rosenbengalenlösung (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) basierend auf dem Körpergewicht der Maus. Bei einer Maus mit einem Körpergewicht von 25 g mischen Sie beispielsweise 20 μl Thrombin (0,1 U/μl) und 125 μl RB (10 mg/ml).</li>
	<li>T+RB-Lösung (145 μl pro 25 g Körpergewicht) langsam mit einer Insulinspritze (#31G Nadel) in den Retroorbitalsinus injizieren. ANMERKUNG: In Pilotexperimenten wurde die Mortalitätsrate bei steigenden Dosen von Thrombin gemischt mit der Standarddosis des RB-Farbstoffs (50 mg/kg) auf Photoaktivierung untersucht. Die Mortalität betrug 0 % für 80 U/kg Thrombin (n=13), 43 % für 120 U/kg Thrombin (n=7) und 100 % für 160 U/kg (n=5) und 200 U/kg Thrombin (n=5). Für dieses Modell wurde daher eine Dosis von 80 U/kg Thrombin gewählt. Die Laser-Speckle-Kontrakt-Bildgebung wurde auch verwendet, um die Möglichkeit einer zügellosen Blutgerinnung in der Nähe der Orbitalhöhle nach retroorbitaler Sinusinjektion von T+RB auszuschließen (Ergänzende Abbildung 1) sowie eine ausgedehnte Fibrinablagerung in der kontralateralen Hemisphäre, die keiner Laserbeleuchtung ausgesetzt war (Ergänzende Abbildung 2).</li>
	<li>Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.</li>
	<li>Bringen Sie den Strahler mit einem 532 nm Laserlicht (mit 0,5 mW Energie) 20 Minuten lang auf die gebohrte Stelle mit einem Abstand von 2 Zoll auf. Visualisieren Sie die Beleuchtung auf dem proximalen Ast des MCA durch eine Laserschutzbrille (Abbildung 1C,D). HINWEIS: Der MCA mit 532 nm Beleuchtung zeigt rote Fluoreszenz unter der Brille. Das distale MCA verschwindet nach 10 Minuten Beleuchtung. Schließen Sie das Tier aus, wenn der distale MCA-Fluss nach 20-minütiger Beleuchtung immer noch vorhanden ist.</li>
	<li>Stoppen Sie die Laserbeleuchtung nach 20 Minuten. Verschließen Sie die Wunde mit sterilen Wundklammern.</li>
</ol>4. Intravitale Bildgebung (optional)
ANMERKUNG: Um die Thrombusbildung in-vivo zu charakterisieren, ist die intravirale Bildgebung durch ein konfokales Spin-Scheiben-Photoaktivierungssystem23 zu verwenden.
<ol><li>Machen Sie ein Schädelfenster mit einem Durchmesser von ~3 mm auf dem Scheitelbein des Schädels.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Deckglas auf dem Schädelfenster und lokalisieren Sie den distalen MCA (~50 μm Durchmesser) unter einem 20-fachen Wasserimmersionsobjektiv.</li>
	<li>Markierung der zirkulierenden Blutplättchen durch Injektion der Schwanzvene mit DyLight488-konjugiertem Anti-GPIbβ-Antikörper (0,1 mg/kg) 5 Minuten vor der Bildgebung.</li>
	<li>Die Mischungslösung aus Thrombin (80 U/kg) und Rosenbengalen (50 mg/kg) wird 5 Minuten vor der Bildgebung retroorbital injiziert.</li>
	<li>Photoaktivieren Sie das MCA mit einem 561 nm Lasersystem mit einem Laserstrahl von 10 μm Durchmesser und zeichnen Sie das Bild bis zur Thrombusbildung auf.</li>
</ol>5. tPA-Verabreichung
<ol><li>Legen Sie das betäubte Tier auf eine 37 °C warme Unterlage. Befeuchten Sie zum gewählten Zeitpunkt nach der Photoaktivierung eine Gaze mit ~45 °C warmem Wasser und wickeln Sie sie 1 Minute lang um den Schwanz.</li>
	<li>Rekombinantes humanes tPA (10 mg/kg) durch die Schwanzvene mit einem 50%igen Bolus und 50% über 30 min mittels Infusionspumpe injizieren. HINWEIS: Obwohl die klinische Dosis von rekombinantem humanem tPA für die Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls 0,9 mg/kg beträgt, wird bei Nagetieren üblicherweise eine höhere Dosis (10 mg/kg) verwendet, um die reduzierte tPA-Reaktivität zwischen verschiedenen Spezies auszugleichen. Wir folgten auch dem Standardprotokoll der tPA-Verabreichung in präklinischen Schlaganfallmodellen, wobei 50 % als Bolus und 50 % über die Schwanzvene über 30 Minuten infundiert wurden.24</li>
</ol>6. Überwachung des zerebralen Blutflusses (CBF)
HINWEIS: Um die CBF-Erholung nach einer tPA-Behandlung zu bestätigen, verwenden Sie ein zweidimensionales Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebungssystem15 und zeichnen Sie unmittelbar nach der Photothrombose (Schritt 3.9) oder 24 Stunden nach der tPA-Behandlung auf.
<ol><li>Legen Sie das betäubte Tier in die Bauchlage und machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut, wobei der Schädel freiliegt.</li>
	<li>Befeuchten Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie das Ultraschallgel sanft auf den Schädel auf. Vermeiden Sie Haare und Blasen im Gel, die das CBF-Signal stören.</li>
	<li>Überwachen Sie die CBF in beiden Gehirnhälften unter einem Laser-Speckle-Kontrast-Imager für 10 Minuten.</li>
	<li>Verschließen Sie nach der Aufnahme des CBF-Bildes die Kopfhaut mit Gewebekleber und setzen Sie das Tier wieder in den Käfig ein.</li>
	<li>Analysieren Sie CBF in den ausgewählten Regionen und berechnen Sie den Prozentsatz der CBF-Rückgewinnung im Vergleich zur kontralateralen Region.</li>
	<li>Setzen Sie das Tier dann wieder in einen warmen Käfig, um sich zu erholen. Beobachten Sie die Mäuse 5-10 Minuten lang, bis sie sich von der Narkose erholt haben. Legen Sie das angefeuchtete Futter in den Käfig und geben Sie es an die Tierpflegeeinrichtung zurück. HINWEIS: Bieten Sie eine postoperative Analgesie an, wie von den lokalen institutionellen Richtlinien empfohlen.</li>
</ol>7. Infarktvolumenmessung durch Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung
<ol><li>Vierundzwanzig Stunden nach der Photothrombose ist das Tier gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien für Nicht-Überlebensoperationen tief zu betäuben. HINWEIS: Wir verabreichen Tribromethanol (Avertin) 250 mg/kg als intraperitoneale (IP) Injektion.</li>
	<li>Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit PBS durch, sammeln Sie frisches Gehirn und betten Sie es in 3% Agar-Gel ein.</li>
	<li>Den 1 mm dicken Hirnschnitt mit einem Vibratom durchtrennen und 10 min in 2%iger TTC-Lösung inkubieren.</li>
	<li>Quantifizieren Sie das gesamte Infarktvolumen aus 6 Gehirnschnitten als absolutes Volumen mit der ImageJ-Software. HINWEIS: Das Hirnödem wurde aus zwei Gründen nicht als Ergebnismessung verwendet. Erstens misst die TTC-Färbung die Lebensfähigkeit des Gewebes (über die mitochondriale Reduktionsaktivität), was eine schwerwiegendere Folge als ein Ödem ist. Zweitens treten im Verlauf des Infarkts sowohl vasogene als auch zytotoxische Ödeme auf, die mit den Standard-Hirnödem-Messmethoden nicht leicht unterschieden werden können. Wir haben jedoch die Anti-Immunglobin-Markierung (IgG) verwendet, um die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu beurteilen, und haben eine vergleichbare IgG-Extravasation 6 h nach der Photoaktivierung sowohl in RB- als auch in T+RB-Schlaganfallmodellen gefunden (ergänzende Abbildung 3).</li>
</ol>8. Messung der Thrombusbildung
HINWEIS: Um die Thrombusbildung zu messen, entnehmen Sie das Gehirn 1 h und 2 h nach der Photothrombose zur Thrombusmessung bei MCA mittels Immunchemie (IHC) bzw. zur Fibrinmessung in der Gehirnhälfte mittels Immunoblot.
<ol><li>Führen Sie die IHC zur Charakterisierung der Gerinnselzusammensetzung durch. Fixieren Sie das Gehirn über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd und dehydrieren Sie das Gehirn dann mit 30 % Saccharose für die OCT-Einbettung.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn mit sagittaler Ausrichtung in 20 μm Dicke und führen Sie die IHC mit spezifischen Antikörpern gegen Fibrinogen, Blutplättchen (Glykoprotein IIb), rote Blutkörperchen (TER119) und Blutgefäße (Isolektin GS-IB4) durch.</li>
	<li>Führen Sie die Messung von Fibrin in der Gehirnhälfte durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen Fibrinogen durch.</li>
</ol>

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<li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+crculation+in+ischemic+stroke%3A+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li>
<li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombsis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der traditionelle photothrombotische RB-Schlaganfall, der 1985 eingeführt wurde, ist ein attraktives Modell der fokalen zerebralen Ischämie für einfache chirurgische Eingriffe, niedrige Mortalität und hohe Reproduzierbarkeit des Hirninfarkts. 5 In diesem Modell aktiviert der photodynamische Farbstoff RB die Blutplättchen bei Lichtanregung schnell, was zu dichten Aggregaten führt, die das Blutgefäß verschließen 5,8,23.</su...

Die endovaskuläre Thrombektomie und die tPA-vermittelte Thrombolyse sind die einzigen beiden von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls, von dem in den Vereinigten Staaten jährlich ~700.000 Patienten betroffen sind1. Da die Anwendung der Thrombektomie auf den Verschluss großer Gefäße (LVO) beschränkt ist, während die tPA-Thrombolyse Verschlüsse kleiner Gefäße lindern kann, sind beide wertvolle Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls2. Darüber hinaus verbessert die Kombination beider Therapien (z.B. Einleitung einer tPA-Thrombolyse innerhalb von 4,5 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls, gefolgt von einer Thrombektomie) die Reperfusion und die funktionellen Ergebnisse3. So bleibt die Optimierung der Thrombolyse auch im Zeitalter der Thrombektomie ein wichtiges Ziel für die Schlaganfallforschung.
Thromboembolische Modelle sind ein wesentliches Werkzeug für die präklinische Schlaganfallforschung mit dem Ziel, thrombolytische Therapien zu verbessern. Dies liegt daran, dass mechanische Gefäßverschlussmodelle (z. B. intraluminaler Naht-MCA-Verschluss) keine Blutgerinnsel erzeugen und die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach der Entfernung des mechanischen Verschlusses übermäßig idealisiert ist 4,5. Zu den wichtigsten thromboembolischen Modellen gehören bisher die Photothrombose 6,7,8, die topische Anwendung von Eisenchlorid (FeCl3)9, die Mikroinjektion von Thrombin in den MCA-Zweig 10,11, die Injektion von ex vivo (Mikro-)Embolien in das MCA oder die Arteria carotis communis (CCA)12,13,14 und die transiente Hypoxie-Ischämie (tHI)15,16, 17,18. Diese Schlaganfallmodelle unterscheiden sich in der histologischen Zusammensetzung der nachfolgenden Gerinnsel und der Sensitivität gegenüber tPA-vermittelten lytischen Therapien (Tabelle 1). Sie unterscheiden sich auch in den chirurgischen Anforderungen der Kraniotomie (erforderlich für die In-situ-Thrombininjektion und die topische Anwendung von FeCl3), der Konsistenz der Infarktgröße und -lokalisation (z. B. führt die CCA-Infusion von Mikroembolien zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen) und den globalen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System (z. B. erhöht tHI die Herzfrequenz und das Herzzeitvolumen, um die Hypoxie-induzierte periphere Vasodilatation zu kompensieren).
Das RB-Farbstoff-basierte photothrombotische Schlaganfallmodell (PTS) hat viele attraktive Merkmale, darunter einfache kraniotomiefreie chirurgische Eingriffe, eine niedrige Mortalität (typischerweise < 5 %) und eine vorhersagbare Größe und Lokalisation des Infarkts (im MCA-liefernden Bereich), aber es hat zwei wesentliche Einschränkungen. 8 Der erste Vorbehalt ist das schwache bis Null-Ansprechen auf eine tPA-vermittelte thrombolytische Behandlung, was auch ein Nachteil des FeCl-3-Modells ist 7,19,20. Der zweite Vorbehalt von PTS- und FeCl-3-Schlaganfallmodellen besteht darin, dass die nachfolgenden Thromben aus dicht gepackten Thrombozytenaggregaten mit einer geringen Menge Fibrin bestehen, was nicht nur zu ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber der tPA-lytischen Therapie führt, sondern auch vom Muster der gemischten Thrombozyten:Fibrin-Thromben bei akuten ischämischen Schlaganfallpatienten abweicht 21,22. Im Gegensatz dazu besteht das in situ Thrombin-Mikroinjektionsmodell hauptsächlich aus polymerisiertem Fibrin und einem unsicheren Gehalt an Thrombozyten10.
Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass die Beimischung von RB und einer subthrombotischen Dosis Thrombin zur MCA-gezielten Photoaktivierung durch einen ausgedünnten Schädel die Fibrinkomponente in der resultierenden Thrombe erhöhen und die Empfindlichkeit gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung erhöhen kann. Wir haben diese Hypothese bestätigt,23 und hier beschreiben wir detaillierte Prozeduren des modifizierten (T+RB) photothrombotischen Schlaganfallmodells.

<table><tbody><tr><td>2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>Infarkt</td></tr><tr><td>4-0 Nylon monofile Naht</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>chirurgisches Zubehör</td></tr><tr><td>5-0 Seidennaht</td><td>Harvard Apparat</td><td>624143</td><td>chirurgisches Zubehör</td></tr><tr><td>543nm Laserstrahl</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>Photothrombose</td></tr><tr><td>erwachsene männliche Mäuse</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10~14 Wochen alt (22~30 g)</td></tr><tr><td>Anästhesiestange für Mausadapter</td><td>Maschinenwerkstatt, UVA</td><td></td><td>chirurgische Einrichtung</td></tr><tr><td>Avertin (2, 2, 2-Tribromethanol)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Euthanasie</td></tr><tr><td>Zahnbohrer</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>chirurgische Einrichtung</td></tr><tr><td>Digitalmikroskop</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>Bildgebung des Gehirns</td></tr><tr><td>Präparieren Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>chirurgischer Aufbau</td></tr><tr><td>Fein gekrümmte Pinzette (gezackt)</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td>chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Fein gebogene Pinzette (glatt)</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Immunhistochemie</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito-Hämostaten</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Wärmepumpe mit Wärmekissen</td><td>Gaymar</td><td>TP700</td><td>chirurgische Einrichtung</td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td><td>KD Scientific</td><td>200</td><td>Thrombolysebehandlung</td></tr><tr><td>Insulinspritze mit 31G-Nadel</td><td>BD</td><td>328291</td><td>Photothrombose</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>CCM, UVA-Anästhesie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserschutz Google 532nm</td><td>Thorlabs</td><td>LG3</td><td>Photothrombose</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>NSAID Analgesie</td></tr><tr><td>Mikronadelhalter</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>chirurgisches</td></tr><tr><td>Instrument MoorFLPI-2 Blutfluss-Imager</td><td>Moor</td><td>780-nm Laserquelle</td><td>Laser Speckle Contrast Imaging</td></tr><tr><td>Mausadapter</td><td>RWD</td><td>68014</td><td>chirurgischer Aufbau</td></tr><tr><td>Puralube Vet Salbe</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>Vorbeugung von Augentrockenheit</td></tr><tr><td>Retraktor-Tipps</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td><td>chirurgischer Aufbau</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>Photothrombose</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td>Photothrombose</td></tr><tr><td>Gewebekleber</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>chirurgisches Zubehör</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo Aktivase 2mg</td><td>thrombolytische Behandlung</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC infacrt</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>CCM, UVA-Anästhesie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein mit fibrin angereichertes und tpa-sensitives photothrombotisches schlaganfallmodell

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Ein ideales thromboembolisches Schlaganfallmodell erfordert bestimmte Eigenschaften, darunter relativ einfache chirurgische Eingriffe mit geringer Mortalität, eine konsistente Infarktgröße und -lokalisation, Ausfällung von Blutplättchen-Fibrin-gemischten Blutgerinnseln, die denen bei Patienten ähneln, und eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber fibrinolytischer Behandlung. Das photothrombotische Schlaganfallmodell auf Basis von Rosen-Bengalen (RB) erfüllt die ersten beiden Anforderungen, ist aber sehr refraktär gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung, vermutlich aufgrund seiner plättchenreichen, aber fibrinarmen Gerinnselzusammensetzung. Wir gehen davon aus, dass die Kombination von RB-Farbstoff (50 mg/kg) und einer subthrombotischen Dosis Thrombin (80 U/kg) zur Photoaktivierung auf den proximalen Ast der mittleren Hirnarterie (MCA) fibrinangereicherte und tPA-empfindliche Gerinnsel erzeugen kann. In der Tat löste das kombinierte Photothrombosemodell von Thrombin und RB (T+RB) gemischte Blutgerinnsel aus Thrombozyten und Fibrin aus, wie durch Immunfärbung und Immunablots gezeigt wurde, und behielt konsistente Infarktgrößen und -lokalisationen sowie eine niedrige Mortalität bei. Darüber hinaus verringerte die intravenöse Injektion von tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innerhalb von 2 h nach der Photoaktivierung die Infarktgröße bei T+RB-Photothrombose signifikant. Daher könnte das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell ein nützliches experimentelles Modell sein, um neuartige thrombolytische Therapien zu testen.

Zunächst verglichen wir den Fibringehalt in RB mit T+RB-Photothrombose-induzierten Blutgerinnseln. Die Mäuse wurden 2 Stunden nach der Photoaktivierung durch transkardiale Perfusion von Fixiermitteln getötet, und die Gehirne wurden für die Immunfluoreszenzfärbung des MCA-Zweiges in der Längs- und Transversalebene entfernt. Bei der RB-Photothrombose war der MCA-Zweig dicht gepackt mit CD41+-Thrombozyten und wenig Fibrin (Abbildung 2A,C). Im Gegensatz dazu war der M...

Traditionelle photothrombotische Schlaganfallmodelle (PTS) induzieren hauptsächlich dichte Thrombozytenaggregate mit einer hohen Resistenz gegen eine lytische Behandlung mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA). Hier wird ein modifiziertes murines PTS-Modell durch Co-Injektion von Thrombin und lichtempfindlichem Farbstoff zur Photoaktivierung eingeführt. Das Thrombin-verstärkte PTS-Modell erzeugt gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel und ist hochempfindlich gegenüber tPA-Thrombolyse.

Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Wir wollen ein Schlaganfallmodell erstellen, das ein Blutgerinnsel erzeugt, das Patientenproben ähnelt und auf die klinisch relevante thrombolytische Therapie anspricht. Daher modifizieren wir das klassische photothrombotische Schlaganfallmodell und mischen Thrombin und den photodynamischen Farbstoff Rose Bengal vor der Photoaktivierung. Wir freuen uns, dass dieses Verfahren tatsächlich Blutgerinnsel erzeugt, die sehr empfindlich auf die tPA-vermittelte Thrombolyse reagieren.Dieses modifizierte photothrombotische Schlaganfallmodell verwendet sehr einfache chirurgische Eingriffe mit einer niedrigen Mortalitätsrate und führt zu einer sehr konsistenten Infarktgröße und -lokalisation. Sie produzieren auch ein gemischtes Blutgerinnsel aus Fibrin und Blutplättchen, das denen des akuten Schlaganfallpatienten ähnelt. Daher halten wir es für die präklinische Schlaganfallforschung für sinnvoll, effektivere thrombolytische Therapien zu entwickeln.Wir hoffen, dass mehr Menschen unser Modell nutzen. Das Verfahren wird von Dr. Yu-Yo Sun, unserem wissenschaftlichen Assistenzprofessor in unserer Gruppe, demonstriert. Bereiten Sie die Maus 30 Minuten vor der Operation vor, indem Sie ein Analgetikum injizieren.Nachdem Sie die Maus betäubt haben, kneifen Sie die Zehen zusammen, um sicherzustellen, dass sie vollständig betäubt ist. Anschließend die Haare am linken Hals und Kopf mit Haarentfernungscreme entfernen. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Kleintieradapter und sterilisieren Sie den chirurgischen Hautbereich, indem Sie ihn mit drei abwechselnden Streichen von Povidon-Jod und 70%igem Ethanol abwischen.Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen 0,5 Zentimeter langen linken Halsschnitt mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette etwa 0,2 Zentimeter seitlich der Mittellinie. Ziehen Sie dann mit einer feinen gezackten Pinzette das Weichgewebe und die Faszie auseinander, um die LCCA freizulegen. Trennen Sie dann mit einer feinen, glatten Pinzette vorsichtig den LCCA vom Vagusnerv.Legen Sie eine permanente Doppelknotennaht mit einer 5-0-Seidennaht um die LCCA. Drehen Sie die Maus in eine Bauchlage und drehen Sie die Nasenklammerrolle um 15 Grad. Sterilisieren Sie dann den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Betadin und 70%igem Ethanol abwischen.Machen Sie einen 0,8 Zentimeter langen Schnitt in die Kopfhaut mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette entlang des linken Auges und Ohrs, um den Schläfenmuskel freizulegen. Als nächstes machen Sie einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt entlang der Kante des Schläfenmuskels am linken Scheitelknochen. Machen Sie dann einen zweiten 0,3 Zentimeter langen vertikalen Schnitt am Schläfenmuskel und ziehen Sie den Muskel zurück, um den Rand des Scheitelknochens und des Plattenepithelknochens freizulegen.Stellen Sie sicher, dass Sie die Landmarke der koronalen Naht zwischen Frontal- und Scheitelknochen visualisieren. Als nächstes befeuchten Sie den Schädel, indem Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um das linke MCA freizulegen, und markieren Sie den proximalen MCA-Ast auf dem Plattenepithelknochen mit einem Marker. Zeichnen Sie vorsichtig mit einem pneumatischen Zahnbohrer einen Kreis mit einem Durchmesser von einem Millimeter, der diesen markierten Bereich umgibt.Dann dünnen Sie den Schädel etwa 0,2 Millimeter tief aus, ohne die darunter liegende Dura zu berühren. Stoppen Sie das Bohren, wenn eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt. Als nächstes mischen Sie die Thrombin- und Rosenbengalenlösung basierend auf dem Körpergewicht der Maus und injizieren die Mischung langsam mit einer 31-Gauge-Nadel in den retroorbitalen Sinus.Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Tragen Sie den Strahler mit einem 532-Nanometer-Laserlicht 20 Minuten lang in einem Abstand von zwei Zoll auf die gebohrte Stelle auf. Visualisieren Sie die Beleuchtung am proximalen Ast des MCA durch eine Laserprojektionsbrille.Stoppen Sie nach 20 Minuten die Laserbeleuchtung. Machen Sie ein Schädelfenster von drei Millimetern Durchmesser auf das Scheitelbein des Schädels und setzen Sie ein Deckglas darauf. Platzieren Sie dann das distale MCA unter einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse.Markierung des zirkulierenden Blutplättchens durch Injektion des Schwanzvenen-Antikörpers DyLight 488 gegen GP1b-beta fünf Minuten vor der Bildgebung. Injizieren Sie dann retroorbital die Mischung aus Thrombin und Rosenbengalenlösung. Photoaktivieren Sie den MCA mit einem 532-Nanometer-Lasersystem mit einem Laserstrahl von 10 Mikrometern Durchmesser und zeichnen Sie das Bild bis zur Thrombusbildung auf.Für die tPA-Verabreichung wird das betäubte Tier auf eine 37 Grad Celsius warme Unterlage gelegt. Wickeln Sie seinen Schwanz mit einer 45 Grad Celsius warmen, nassen Gaze für eine Minute zum ausgewählten Zeitpunkt nach der Photoaktivierung um. Als nächstes injizieren Sie das rekombinante humane tPA durch die Schwanzvene.Injizieren Sie 50 % als Bolus und lassen Sie die restlichen 50 % über 30 Minuten mit einer Infusionspumpe infundieren. Um den zerebralen Blutfluss zu überwachen, machen Sie einen Mittellinienschnitt auf der Kopfhaut, wobei der Schädel freiliegt. Befeuchten Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie das Ultraschallgel sanft darauf auf, wobei Sie darauf achten sollten, Haare oder Luftblasen im Gel zu vermeiden.Überwachen Sie den zerebralen Blutfluss in beiden Gehirnhälften unter dem Laser-Speckle-Kontrast-Imager für 10 Minuten. Die Immunfluoreszenzmarkierung zeigt, dass bei der Photothrombose auf Basis des Rosen-Bengalenfarbstoffs der MCA-Zweig dicht mit CD41-positiven Thrombozyten und wenig Fibrin gefüllt war. Im Gegensatz dazu war der MCA-Zweig bei der Thrombin plus Rosenbengalen-Photothrombose durch zufällig gemischte Thrombozyten- und Fibringerinnsel verschlossen.Die Immunoblotting-Analyse zeigte eine mehr als doppelt so hohe Fibrinablagerung in der ipsilateralen Hemisphäre bei der Photothrombin plus Rosenbengalen im Vergleich zur Rosenbengalen-Photombose allein. Die konfokalmikroskopische intravitale Bildgebung zeigte, dass eine intravenöse Thrombininjektion auch unter Laserbeleuchtung keine Thrombozytenaggregate induzierte. Die Thrombozyten bildeten homogene Gerinnsel im Rose-Bengal-Photothrombose-Modell, aber ungleichmäßige Aggregate mit mehreren schwachen Regionen im Thrombin-plus-Rose-Bengal-Modell.Der CBF derselben Maus vor und 24 Stunden nach der tPA-Behandlung im Vergleich zur Vehikelbehandlung wurde mittels Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung gemessen und auf die kontralaterale Hemisphäre normalisiert. Bei der Rosenbengalen-Photothrombose führte die tPA-Behandlung zu einem Trend der CBF-Erholung, insbesondere im ischämischen Grenzbereich im Vergleich zu den mit Vehikeln behandelten Mäusen. Bei der Thrombin-plus-Rosenbengal-Photothrombose war die Erholung von CBF bei tPA-behandelten Mäusen ausgeprägter, und die proximalen MCA-Äste wurden oft nach 24 Stunden sichtbar.Bei der Rosenbengalen-Photothrombose wurde eine ähnliche Infarktgröße bei Vehikel-behandelten und tPA-behandelten Mäusen festgestellt. Im Gegensatz dazu reduzierte die lytische tPA-Behandlung bei Thrombin plus Rosenbengal-Photothrombose den Infarkt signifikant nach 0,5, einer oder zwei Stunden, aber nicht sechs Stunden nach der Photoaktivierung im Vergleich zu vehikelbehandelten Mäusen. Diese Methode kann zur Untersuchung der Gerinnselzusammensetzung und zur weiteren Untersuchung thrombolytischer Behandlungen verwendet werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden der Thrombolysetherapie angewendet und die spätere Wirksamkeit bestimmt werden. Die Zugabe von Thrombin ermöglicht es, die Gerinnselzusammensetzung von fibrinarm auf fibrinreich einzustellen, so dass Forscher klinisch relevante therapeutische Strategien entwickeln können.

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Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung eines photothrombotischen Schlaganfalls in einem Mausmodell durch Laserbeleuchtung eines intakten Schädels nach Verabreichung von lichtempfindlichem Farbstoff.

Modellierung eines photothrombotischen Schlaganfalls im Mausmodell: Eine Laserbeleuchtungstechnik durch den Schädel der Maus nach Verabreichung von lichtempfindlichem Farbstoff zur Induktion von Photothrombose

Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies

Hier beschreiben wir einen semi-invasiven optischen Mikroskopie-Ansatz zur Induktion eines photothrombotischen Gerinnsels in der somatosensorischen Hirnrinde einer Maus in vivo.  Es werden die technischen Aspekte des bildgebenden Verfahrens von der Induktion eines photothrombotischen Ereignisses über die Anwendung bis hin zur Datenerhebung beschrieben.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

Thromboembolische Schlaganfallmodelle sind wichtige Werkzeuge zur Optimierung der Rekanalisationstherapie. In dieser Arbeit berichten wir über ein murines thrombotisches Schlaganfallmodell, das auf einem transitorischen zerebralen hypoxisch-ischämischen (tHI) Insult basiert, der Thrombose und Infarkt auslöst und positiv auf die durch Gewebeplasminogenaktivator (tPA) vermittelte Fibrinolyse in einem therapeutischen Fenster ähnlich wie bei Schlaganfallpatienten anspricht.

A thrombotischer Schlaganfall Modell basierend auf Transient zerebrale Hypoxie-Ischämie

Photothrombose ist ein minimalinvasives und hochgradig reproduzierbares Verfahren zur Induktion einer fokalen Ischämie im Rückenmark und dient als Modell für Rückenmarksverletzungen bei Mäusen.

Photothrombosis induzierte fokale Ischämie als ein Modell der Rückenmarksverletzungen in Mäusen

Wir berichten über ein raffiniertes Verfahren des Eisenchlorid (FeCl 3) induzierte Thrombose - Modelle auf carotis und A. mesenterica sowie Vene, dadurch effizient Intravitalmikroskopie unter Verwendung von Zeit zu überwachen Thrombenbildung zu okklusiv.

Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models

Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

Unter Verwendung eines rein optischen Ansatzes wird ein ischämischer Schlaganfall induziert, während gleichzeitig die neuronaleCa2+ -Aktivität mit einem fluoreszierenden Biosensor im entstehenden Schlaganfallkern einer wachen, sich verhaltenden Maus aufgezeichnet wird.

Gleichzeitige Photothrombose und Faserphotometrie zur Induktion und Überwachung eines ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen, die sich verhalten

Zur Simulation eines thromboembolischen Schlaganfalls wurden Embolien, die aus heterologem Rattenblut hergestellt wurden, in die mittlere Großhirnarterie injiziert, gefolgt von der Verabreichung einer systemischen Thrombolyse zur Rekanalisation. Diese Version des Modells ist für den Einsatz in einem Multilabornetzwerk optimiert und unterstützt das Testen mehrerer Kandidatentherapien.

Das Stroke Preclinical Assessment Network Multi-Labormodell des thromboembolischen Schlaganfalls mit Thrombolyse: TE-MCAo

Dieses Protokoll bietet eine integrierte Methode, die virale Abgabe, Optrodenimplantation, photothrombotische Induktion, gleichzeitige Aufzeichnung der Astrozyten- und neuronalen Aktivität sowie optogenetische Stimulation von Astrozyten umfasst. Diese integrierte Methode zielt darauf ab, eine parallele Untersuchung der Astrozyten-Neuron-Beziehung über die akuten bis chronischen Stadien des ischämischen Schlaganfalls zu ermöglichen.

Eine integrierte Methode zur photothrombotischen Schlaganfallmodellierung und zur in-vivo-Optrodenerfassung neuronaler und astrozytischer Aktivität bei sich wirkenden Mäusen

Erfahren Sie ein modifiziertes photothrombotisches Schlaganfallmodell mit Thrombin und Rose Bengal zur Erzeugung fibrinreicher Blutgerinnsel bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präklinische Studien zur Thrombolyse mit tPA.

Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell

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