Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software

Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es einen einfachen und reproduzierbaren Rahmen für die Quantifizierung von in vitro Biofilmstrukturen unter unterschiedlichen antimikrobiellen Bedingungen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dazu beiträgt, subjektive Variationen zu eliminieren, die mit der manuellen Bedienung von COMSTAT verbunden sind, was letztendlich die Standardisierung und Transparenz von Experimenten in Forschungszentren erleichtert. Um die Pseudomonas aeruginosa-Kulturen abzubilden, stellen Sie die Platte auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops, das mit den entsprechenden Laseranregungswellenlängen und Filtersets ausgestattet ist.

Und verwenden Sie eine 20- bis 25-fache Wasserimmersionslinse, um mindestens sechs geschichtete Z-Stapel-Bilder vom Substrat bis zur Spitze jedes Biofilmsegments in Schritten von 0,3 Mikrometern aufzunehmen. Speichern Sie dann die Bilder als OME-TIFFs für die COMSTAT-Analyse. Wenn alle Bilder abgerufen wurden, öffnen Sie das COMSTAT2 Paket in ImageJ und erstellen Sie einen Quellordner auf dem Desktop.

Fügen Sie dem Ordner eine einzelne OME-TIFF-Datei hinzu, und öffnen Sie die OME-TIFF-Datei aus dem Quellordner. Löschen Sie alle leeren Schichten, die keine Biomasse enthalten. Wählen Sie Datei, Importieren und Bildsequenz aus, um die Datei in ImageJ zu importieren.

Suchen und markieren Sie den Quellordner, ohne ihn zu öffnen, und klicken Sie auf Auswählen. Ein Fenster mit den Sequenzoptionen wird angezeigt, klicken Sie auf OK. Wählen Sie Bild, Transformieren und Z umkehren, um die Ausrichtung des Biofilms so umzudrehen, dass sich das Substrat am oberen Rand des Stapels befindet. Um die Bildeigenschaften zu definieren, wählen Sie Bild und Eigenschaften, ein Quellfenster wird angezeigt.

Geben Sie die Längeneinheit als Mikrometer an, definieren Sie die Voxeltiefe als 0,3 und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus. Um den Bildschwellenwert im Schwellenwertfenster anzupassen, positionieren Sie den unteren Schieberegler ganz rechts, um den maximalen Schwellenwert manuell festzulegen, und verwenden Sie den oberen Schieberegler, um den minimalen Schwellenwert festzulegen. Verwenden Sie dann den Schieberegler im Bildfenster, um durch die einzelnen Ebenen zu scrollen, um sicherzustellen, dass das Hintergrundrauschen im gesamten Stapel ausreichend entfernt wird, und wählen Sie Festlegen aus, um den unteren Schwellenwert festzulegen.

Wählen Sie im Fenster "Schwellenwerte festlegen" die Option "OK" aus, und legen Sie den maximalen Schwellenwert auf ähnliche Weise fest und korrigieren Sie ihn. Wählen Sie Anwenden aus, klicken Sie im angezeigten Fenster Stack in Binär konvertieren auf OK und schließen Sie das Schwellenwertfenster. Wählen Sie Plugins, Bio-Formate und Bio-Formate-Exporter, um die Datei unter einem neuen Dateinamen im Quellordner zu speichern.

Das Fenster "Bio-Formats Exporter für mehrere Dateien" wird angezeigt, wählen Sie OK. Ein Optionsfenster für den Bioformat-Exporter wird angezeigt, wählen Sie erneut OK aus. Um COMSTAT auszuführen, wählen Sie Plugins und COMSTAT2 aus, ein Info-Fenster wird angezeigt, wählen Sie OK.In Fenster Beobachtete Verzeichnisse aus, wählen Sie Hinzufügen, suchen und markieren Sie den Quellordner, markieren Sie ihn und klicken Sie auf Auswählen. Es erscheint das Fenster Bilder in Verzeichnissen, in dem die zu analysierenden OME-TIFFs aufgelistet sind.

Deaktivieren Sie im COMSTAT2.1-Fenster die Option Automatische Schwellenwertbestimmung für die Otsu-Methode und die Filterung des verbundenen Volumens, um sicherzustellen, dass die Software voreingestellte Schwellenwerte für einzelne OME-TIFFs verwendet. Wählen Sie im Fenster COMSTAT2.1 die Option Biomasse, Dickenverteilung und Oberfläche aus, und klicken Sie auf Los, um das Programm auszuführen. Die Ausgabedaten werden im Protokollfenster angezeigt.

Die Messungen werden automatisch als TXT-Dateien im Quellordner gespeichert. In dieser repräsentativen Analyse wurde ein Pseudomonas aeruginosa-Isolat verwendet, das von einem infizierten Mukoviszidose-Patienten kultiviert wurde, um die Stärken dieses Ansatzes zu demonstrieren und antimikrobiell induzierte Veränderungen in der in vitro Biofilmarchitektur ungenau zu quantifizieren. Die Bildgebung von lebenden Zellen kann auch Veränderungen in der Biofilmstruktur von Pseudomonas aeruginosa vor und nach einer biofilmspezifischen monoklonalen und Tobramycin-Behandlung sichtbar machen.

Die COMSTAT-Datenanalyse ergab signifikante Unterschiede zwischen den behandelten Biofilmstrukturen im Vergleich zu Kontrollkulturen. In mit Tobramycin behandelten Kulturen wurde eine deutliche Verringerung der durchschnittlichen Dicke und Biomasse beobachtet. In Gegenwart von Antikörpern war der P.aeruginosa-Biofilm jedoch resistent gegen diese Tobramycin-induzierten Strukturveränderungen.

Bei der Untersuchung des Verhältnisses von Oberfläche zu Biovolumen wurde eine signifikante Verringerung des Vorhandenseins von Antikörpern sowohl in Tobramycin-exponierten als auch in unexponierten Biofilmen beobachtet, was auf die Bildung von Aggregaten in mit Antikörpern behandelten Kulturen hinweist. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden, um die Wirkungen verschiedener antimikrobieller Mittel, die zur Störung von Biofilmmatrizen verwendet werden, quantitativ zu bewerten oder zu vergleichen. Mit dieser Technik als allgemeinem Rahmen können Forscher verschiedene Möglichkeiten erkunden, das Protokoll zu verfeinern, um neue mathematische Modelle und algorithmische Plugins in ImageJ aufzunehmen, um die Heterogenität von Biofilmen besser darzustellen.