Name: Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie man Biofilmarchitekturen von Pseudomonas aeruginosa unter antimikrobiellen Bedingungen mit COMSTAT-Software quantifiziert. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Analysen und eliminiert subjektive Variationen in der Biofilmforschung.

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Die Autoren danken der Cystic Fibrosis Foundation für die Finanzierung dieser Forschung.

1. Entnahme von Bakterienisolat
<ol><li>Beziehen Sie P. aeruginosa-Isolate aus einer Kohorte von pädiatrischen Patienten mit Mukoviszidose, die sich einer Eradikationsbehandlung mit inhalativem Tobramycin bei SickKids (Toronto) unterziehen. Frieren Sie die Isolate vor der Verwendung mindestens dreimal bei -80 °C in Glycerincitrat und Subkultur ein.</li>
</ol>2. Bildung von In-vitro-Biofilmen
HINWEIS: Verwenden Sie eine Kammer-Deckglasmethode1 für die In-vitro-Biofilmbildung mit Modifikationen. Der gesamte Arbeitsablauf dieses Modells ist in Abbildung 1 dargestellt.
<ol><li>P. aeruginosa-Isolat über Nacht bei 37 °C auf Blutagar züchten, das mit tryptischem Sojaagar und 5 % Schafsblut hergestellt wurde (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Impfen Sie 1–2 Bakterienkolonien aus dem Blutagar in 4 ml Lysogenese-Bouillon (LB). Anbau über Nacht bei 37 °C auf einem Shaker mit 225 U/min.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Verdünnung des Overnight-Inokulums von 1:100 vor, indem Sie 40 μl der Kultur in 4 mL frisches LB geben. Wachsen Sie 3–4 Stunden lang bei 37 °C auf einem Shaker mit 225 U/min, um eine optische Dichte von ca. 0,1 bei 600 nm (OD600) zu erreichen (frühe logarithmische Phase).</li>
	<li>Übertragen Sie 220 μl des Inokulums in jede Vertiefung eines 8-Kammer-Deckglasobjektträgers. Ungestört bei 37 °C für 24 h inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium langsam aus jeder Vertiefung, um zu verhindern, dass sich die Biofilme an der Basis ablösen. HINWEIS: Kippen Sie den Schieber in einem Winkel von 45° nach vorne und saugen Sie das Medium aus den unteren Ecken jeder Vertiefung an, ohne die Basis mit der Pipettenspitze zu berühren.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 μl 56 μg/ml fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper (mAb) vor und geben Sie ihn langsam an die Seite der dafür vorgesehenen Kammer-Wells. 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, um die Bindung von Antikörpern an das bakterielle Antigenepitop zu ermöglichen. HINWEIS: Verdünnen Sie vor der Verwendung den fluoreszierend markierten (roten) mAb, Psl0096, in LB, um eine Endkonzentration von 56 μg/ml zu erhalten. Psl0096 ist ein Anti-Psl-mAb (optimiertes Affinitätsderivat von Cam003), das an das Klasse-I-Psl-Epitop bindet – eine wichtige EPS-Matrixkomponente von P. aeruginosa-Biofilmen, die an der anfänglichen Zelladhäsion und der strukturellen Integrität beteiligt sind15.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 μl einer 1000 μg/ml Antibiotikalösung vor und geben Sie sie langsam an die Seite der dafür vorgesehenen Vertiefungen. Ungestört bei 37 °C für 24 h inkubieren. HINWEIS: Verdünnen Sie vor der Anwendung eine Brühe von 50 mg/ml Tobramycin-Antibiotikum in LB, um eine Endkonzentration von 1000 μg/ml zu erhalten.</li>
</ol>3. Fluoreszenzfärbung von Biofilmen
<ol><li>Bereiten Sie eine 0,01 mM Lösung eines lebendzellfärbenden Fluoreszenzfarbstoffs vor. Entfernen Sie das Medium langsam aus den gekammerten Vertiefungen und geben Sie 200 μl der Farbstoffmischung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie bei RT im Dunkeln für 45 min. HINWEIS: Bereiten Sie vor der Verwendung den Fluoreszenzfarbstoff für die Lebendzellfärbung (grün) vor, indem Sie 4 μl eines 5 mM-Stammmaterials zu 2 mL LB hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie langsam das Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es 2x mit 200 μl frischem LB.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl frisches LB in jede Vertiefung und fahren Sie mit der Untersuchung durch konfokale Mikroskopie fort.</li>
</ol>4. Bildaufnahme durch konfokale Mikroskopie
HINWEIS: Das Verfahren zur Bildverarbeitung und COMSTAT-Analyse ist in Abbildung 2 dargestellt. Erfassen Sie Bilder von Vertiefungen am selben Tag, an dem der Biofilm gefärbt wurde. Wenn die Verzögerung bei der Visualisierung 1 h überschreitet, kühlen Sie das Deckglas bis zur weiteren Verarbeitung im Dunkeln.
<ol><li>Erfassen Sie Bilder von Vertiefungen mit einem konfokalen Mikroskopsystem (siehe Materialtabelle) mit geeigneten Laseranregungswellenlängen und Filtersätzen für die Erfassung. HINWEIS: Stimulieren Sie hier die fluoreszenzmarkierte (rote) mAb-Färbung und die Lebendzellfärbung (grün) mit Anregungswellenlängen von 561 nm bzw. 491 nm.</li>
	<li>Erfassen Sie geschichtete Z-Stapel-Bilder (vom Substrat bis zur Spitze jedes Biofilmsegments) in Schritten von 0,3 μm mit einer 20- bis 25-fachen Wasserimmersionslinse. Nehmen Sie mindestens 6 Bildstapel pro Well. HINWEIS: Visualisieren Sie hier die Bilder mit einer hochauflösenden Kamera mit einer 25-fachen Wasserimmersionslinse und bearbeiten Sie sie mit einer Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Parameter für die Softwareeinrichtung und die digitale Bildgebung (d. h. Helligkeit und Empfindlichkeit) für alle Aufnahmen in einem einzigen Experiment konstant.</li>
	<li>Speichern Sie Bilder als OME-TIFFs für die COMSTAT-Analyse. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass OME-TIFFs für jeden Kanal separat gespeichert werden (d. h. rot und grün). Dieser Schritt variiert je nach verwendeter Bildanalysesoftware.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 4.3, um Bilder von insgesamt 3 biologischen Replikaten (d. h. 3 unabhängigen Experimenten) pro Bakterienisolat aufzunehmen.</li>
</ol>5. COMSTAT-Analyse
HINWEIS: Analysieren Sie Bilder quantitativ mit dem frei verfügbaren Computerprogramm COMSTAT 16,17, das als Plugin (Comstat2) in ImageJ umgeschrieben wurde. Lesen Sie die allgemeinen Anweisungen zur Analyse von Bildstapeln von Biofilmen innerhalb des heruntergeladenen Pakets. Dieser Beitrag enthält ein zusammengefasstes Protokoll mit ausgewählten ImageJ-Verarbeitungsschritten und COMSTAT-Funktionen, die zur Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die Biofilmbildung empfohlen werden.
<ol><li>Laden Sie das Comstat2-Paket von http://www.comstat.dk/ herunter. Suchen Sie im installierten Ordner ImageJ und führen Sie es aus.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Quellordner auf dem Desktop, und fügen Sie dem Ordner ein einzelnes OME-TIFF hinzu.</li>
	<li>Öffnen Sie OME-TIFF aus dem Quellordner, und löschen Sie alle leeren Layer, die keine Biomasse enthalten. Bei diesen Layern handelt es sich entweder um die ersten oder die letzten Layer des Z-Stapels. HINWEIS: Mikroskopdefinierte Z-Stapel-Grenzen werden von Benutzern manchmal überschätzt. Durch das Löschen dieser leeren Layer wird eine verfeinerte Z-Stapel-Grenze für die COMSTAT-Analyse erstellt.</li>
	<li>Importieren Sie OME-TIFF in ImageJ, indem Sie Datei | Importieren | Bildsequenz. Suchen Sie den Quellordner, markieren Sie ihn, ohne ihn zu öffnen, und klicken Sie auf Auswählen. Das Fenster "Sequenzoptionen" wird angezeigt. Wählen Sie OK aus. HINWEIS: Um weitere Bilder in ImageJ zu importieren, entfernen Sie zuerst das vorherige OME-TIFF aus dem Quellordner, fügen Sie dann das neue OME-TIFF zum Ordner hinzu und wiederholen Sie die Schritte 5.3 und 5.4.</li>
	<li>Kehren Sie die Ausrichtung des Biofilms um, indem Sie Bild | Transformieren | Drehen Sie Z um, um das Substrat als ersten (obersten) Stapel zu positionieren. HINWEIS: COMSTAT-Algorithmen lesen Biofilme in z-Richtung von oben (Stapel 1) nach unten. Je nach verwendetem konfokalem Mikroskopsystem kann die OME-TIFF-Ausgabe invertiert werden. Daher ist es wichtig, die Reihenfolge der Slices umzukehren, indem das Substrat als Bildstapel 1 positioniert wird, um zu verhindern, dass die Ausgabedaten fehlerhaft werden.</li>
	<li>Definieren Sie Bildeigenschaften, indem Sie Bild | Eigenschaften. Das Fenster "Quelle" wird angezeigt.<ol><li>Geben Sie "Längeneinheit" als "Mikrometer" an.</li>
		<li>Bestimmen Sie mathematisch "Pixelbreite" und "Pixelhöhe" mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61759/61759equ01.jpg"> (1) Hier sind "Pixelbreite" und "Pixelhöhe" definiert als 0,427, wobei die physikalische Länge eines Pixels auf dem ladungsgekoppelten Bauelement (CCD) 16 μm beträgt; Die Gesamtvergrößerung beträgt das 25-fache; und die Position der Lupe ist 1,5x. HINWEIS: Die Gleichung, die zur Berechnung der Zellengröße pro Pixel verwendet wird, kann je nach Hersteller der Mikroskopkamera variieren. Alternativ können "Pixelbreite" und "Pixelhöhe" durch räumliche Kalibrierung definiert werden (siehe https://imagej.net/Spatial_Calibration).</li>
		<li>Definieren Sie "Voxeltiefe" als 0,3 (d. h. inkrementellen Abstand zwischen den einzelnen Z-Stack-Schichten). Wählen Sie OK im Fenster "Quelle".</li>
	</ol></li>
	<li>Passen Sie den Bildschwellenwert an, indem Sie Bild | Anpassen | Schwelle. Das Fenster "Schwellenwert" wird angezeigt. HINWEIS: Objekte im Bild werden rot mit einem Graustufenhintergrund angezeigt. Alternativ kann der Schwellenwert in Schwarzweiß eingestellt werden, indem Sie das Dropdown-Menü im Fenster "Schwellenwert" verwenden, um "Rot" in "S/W" zu ändern.<ol><li>Stellen Sie den Schieberegler im Bildfenster ganz nach rechts ein (d. h. auf die oberste Schicht des Biofilms). Um Hintergrundgeräusche zu entfernen, verwenden Sie das Fenster "Schwellenwert", in dem ein Histogramm des Bildes angezeigt wird, um die maximalen und minimalen Schwellenwerte manuell festzulegen. Stellen Sie zunächst den maximalen Schwellenwert ein, indem Sie den unteren Schieberegler so weit wie möglich nach rechts stellen. Zweitens verwenden Sie den oberen Schieberegler, um den minimalen Schwellenwert anzupassen, der das Bild in zwei separate Phasen unterteilt: rote Biomasse und Graustufenhintergrund (Abbildung 3). HINWEIS: Das hierin beschriebene In-vitro-Biofilmbildungs- und Fluoreszenzmikroskopieverfahren erzeugt im Idealfall OME-TIFFs, was die Segmentierung von Bildern in zwei verschiedene Phasen mittels einer einfachen Histogramm-Schwellenmethode ermöglicht. In einigen Fällen ist die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Phasen im Histogramm jedoch nicht so klar. Dies kann auf das Vorhandensein von starkem Hintergrundrauschen, unterschiedlichen Hintergrundintensitäten oder einen geringen Intensitätskontrast zwischen Biomasse und Hintergrund zurückzuführen sein. In solchen Fällen sollten die Nutzer ein erweitertes Segmentierungsverfahren anwenden18,19.<ol><li>Alternativ können Sie die Schwellenwerte für einzelne Bilder algorithmisch anpassen, indem Sie das linke Dropdown-Menü verwenden, das im Fenster "Schwellenwert" auf "Standard" eingestellt ist. Diese Funktion bietet 17 verschiedene algorithmische Schwellenwertoptionen zur Auswahl (siehe https://imagej.net/Auto_Threshold). Wählen Sie die am besten zutreffende Option und dann "Auto", um den Schwellenwert festzulegen.</li>
		</ol></li>
		<li>Wenn die Schwellenwerte angepasst sind, verwenden Sie den Schieberegler im Bildfenster, um durch die einzelnen Ebenen zu scrollen, um sicherzustellen, dass Hintergrundgeräusche durchgehend ausreichend entfernt werden.</li>
		<li>Wählen Sie im Fenster "Schwellenwert" die Option "Festlegen ", um zuerst den unteren Schwellenwert festzulegen. Das Fenster "Schwellenwerte festlegen" wird angezeigt. Wählen Sie OK aus. Wählen Sie erneut Festlegen aus, und wiederholen Sie diesen Schritt, um den maximalen Schwellenwert festzulegen. HINWEIS: Jedes Mal, wenn "Einstellen" ausgewählt wird, kann sich der untere Schieberegler automatisch anpassen. Stellen Sie in solchen Fällen den Schieberegler manuell neu ein (oder wählen Sie "Auto", wenn Sie einen der algorithmischen Schwellenwerte verwenden) und wiederholen Sie die Schritte 5.6.2 bis 5.6.3. Die Grundidee ist, dass bei jeder automatischen Neueinstellung der Schieberegler "Setzen" danach zwei weitere Male gewählt werden sollte, um sicherzustellen, dass sowohl der obere als auch der untere Schwellenwert fest sind.</li>
		<li>Wählen Sie Anwenden aus, und das Fenster "Stack in Binary konvertieren" wird angezeigt. Wählen Sie OK und schließen Sie dann das Fenster "Schwellenwert".</li>
		<li>Speichern Sie das neu angepasste OME-TIFF, indem Sie Plugins | Bio-Formate | Exporteur von Bioformaten|. Geben Sie einen neuen Dateinamen ein und speichern Sie sie als OME-TIFF im Quellordner. Das Fenster "Bio-Formats Exporter – Mehrere Dateien" wird angezeigt. Wählen Sie OK aus. Das Fenster "Optionen für den Export von Bioformaten" wird angezeigt. Wählen Sie OK aus. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nur die neu angepassten Schwarzweiß-OME-TIFFs im Quellordner gespeichert werden, bevor Sie mit der COMSTAT-Analyse fortfahren. Entfernen Sie alle ursprünglichen OME-TIFFs aus dem Ordner.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie COMSTAT aus, indem Sie Plugins | Comstat2 |. Es erscheint ein "Info"-Fenster. Wählen Sie OK aus. Es werden drei Fenster angezeigt.<ol><li>Wählen Sie im Fenster "Beobachtete Verzeichnisse" (oben rechts) die Option "Hinzufügen" aus. Suchen Sie den Quellordner, markieren Sie ihn, ohne ihn zu öffnen, und wählen Sie Auswählen. Es erscheint ein Fenster 'Bilder in Verzeichnissen' (oben links), in dem die OME-TIFFs aufgelistet sind, die über COMSTAT analysiert werden sollen.</li>
		<li>Deaktivieren Sie im Fenster "Comstat 2.1" (unten rechts) die Option "Automatische Schwellenwerte (Otsu-Methode)", um sicherzustellen, dass die Software Schwellenwerte verwendet, die zuvor für einzelne OME-TIFFs eingerichtet wurden. Deaktivieren Sie außerdem den Connected Volume Filtering (CVF), um sicherzustellen, dass sehr dünne Teile des Biofilms sowie frei schwebende Zellen oder Biomasse, die sich in Hohlräumen der Biofilmstruktur befinden, in die Analyse einbezogen werden. HINWEIS: Deaktivieren Sie hier CVF, da die COMSTAT-Analyse an sehr frühen Biofilmen (24 h anfängliches Wachstum) und verbleibenden planktonischen Zellen/Kolonien nach antimikrobieller Behandlung durchgeführt wird. Für reife Biofilme wählen Sie CVF, um sicherzustellen, dass nur Biomasse, die mit der Biofilmstruktur verbunden ist, quantifiziert wird.</li>
		<li>Wählen Sie im Fenster "Comstat 2.1" (unten rechts) die gewünschten Merkmale für die quantitative Analyse aus. Wählen Sie hier Biomasse, Dickenverteilung und Oberfläche aus. Wählen Sie Gehe zu , um das Programm auszuführen. Im 'Log'-Fenster (unten links) werden die Ausgabedaten in Bearbeitung angezeigt, bis 'Fertig mit ausgewählten Funktionen/Bildern!' erscheint. Zeichnen Sie die COMSTAT-Messungen auf. Diese Messungen werden auch automatisch als TXT-Dateien im Quellordner gespeichert.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+biofilm+structure+using+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying biofilm structure using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).</li>
<li>Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biofilm+image+thresholding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biofilm image thresholding methods.</a> Water Research. 35, 1149-1158 (2001).</li>
<li>Ross, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+confocal+images+of+biofilms+grown+on+irregular+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces.</a> Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+development+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> PLoS Pathogens. 5, (2009).</li>
<li>Mah, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrients+determine+the+spatial+architecture+of+Paracoccus+sp.+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm.</a> Biofouling. 26, 449-459 (2010).</li>
<li>Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenazines+affect+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+similar+ways+at+various+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales.</a> Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).</li>
<li>Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+conditional+psl+variants+reveals+roles+for+the+psl+polysaccharide+in+adhesion+and+maintaining+biofilm+structure+postattachment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.</a> Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).</li>
</ol>

Es gibt keine vorgeschriebene Methode zum quantitativen Vergleich von dreidimensionalen Bildern von in vitro Biofilmstrukturen, und die in diesem Zusammenhang beschriebenen Verfahren sind aufgrund der Variabilität zwischen den Betreibern oft schwer zu standardisieren20. Somit bietet dieses Protokoll einen einfachen und reproduzierbaren Rahmen für COMSTAT-Anwendungen, die darauf abzielen, Veränderungen in der In-vitro-Biofilmarchitektur unter unterschiedlichen antimikrobiellen Bed...

Biofilme sind Aggregate von Mikroorganismen, die in einer Matrix aus selbst produzierten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) orientiert sind. Die EPS-Matrix ist sehr komplex und besteht hauptsächlich aus Bakterienzellen, Wasser, Proteinen, Polysacchariden, Lipiden und Nukleinsäuren1, die sich alle deutlich von freilebenden Planktonzellen unterscheiden. Biofilm-EPS haften aneinander und an verschiedenen Oberflächen. Die EPS-Matrix hat Eigenschaften, die den Zell-zu-Zell-Austausch von Metaboliten, genetischem Material und Verbindungen, die für die interzelluläre Signalübertragung und Abwehr verwendet werden, vermitteln2. Diese Eigenschaften bieten zusammen die strukturelle Integrität der Biofilme und Schutz vor äußeren Stressoren und tragen zur Immunevasion und antimikrobiellen Resistenz bei3.
Pseudomonas aeruginosa ist ein anerkannter nosokomialer Krankheitserreger, der dafür bekannt ist, als Reaktion auf antimikrobielle Mittel eine ausweichende Biofilmwachstumsstrategie zu verfolgen. Ein Paradebeispiel dafür ist bei Patienten mit der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose (CF). Biofilme spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von antimikrobiell resistenten P. aeruginosa4 und ermöglichen die Etablierung einer chronischen Lungeninfektion bei Patienten mit Mukoviszidose, was zu einer beschleunigten Verschlechterung der Lungenfunktion und vorzeitiger Mortalität führt5. Daher werden In-vitro-Biofilmstudien durchgeführt, um die Wirksamkeit von Antibiotika und neuen Antiinfektiva gegen P. aeruginosa-Isolate von Patienten mit CF 6,7 zu testen. Nach der Biofilmbildung werden antimikrobielle Mittel extern auf die Struktur aufgebracht, und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) wird verwendet, um hochauflösende, dreidimensionale Rekonstruktionen von Biofilmsegmenten zu erzeugen. Es ist üblich, dann die Computersoftware COMSTAT als Plugin für ImageJ zu verwenden, um Veränderungen in der Biofilmarchitekturzu quantifizieren 8,9,10,11.
Obwohl COMSTAT für die Quantifizierung der Biofilmstruktur nützlich ist, wird die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Bildanalyse weniger häufig angesprochen. So ist z. B. die Bildverarbeitung, die vor dem Ausführen von COMSTAT durchgeführt wurde, objektiv, enthält aber ein Element der Subjektivität bei der Festlegung der Bildschwellenwerte12,13. In ähnlicher Weise ermöglicht das COMSTAT-Programm dem Bediener, zwischen grundlegenden und erweiterten Bedingungen und Parametern für die Bildsegmentierung sowie zwischen zehn quantitativen Analysefunktionen (z. B. Dickenverteilung, Oberfläche, Biomasse, dimensionsloser Rauheitskoeffizient) zu wählen. Die Vielzahl der Benutzeroptionen, kombiniert mit unterschiedlichen Fachkenntnissen der Bediener, kann zu einer fehlgeleiteten Berichterstattung über das Verhalten von Biofilmen führen.
Das Ziel dieses Protokolls ist es daher, eine relativ einfache Methode zum quantitativen Vergleich von in vitro Biofilmstrukturen mit COMSTAT vorzustellen. Hierin werden dreidimensionale Bilder von Biofilmsegmenten aus einem CF P. aeruginosa-Isolat mittels CLSM unter Verwendung des kammerförmigen Deckglasmodells14 aufgenommen – einer etablierten Technik, die zur Durchführung reproduzierbarer In-vitro-Biofilmexperimente verwendet wird. Durch die Verwendung von COMSTAT als Plugin für ImageJ ermöglicht diese Methode den Forschern, Veränderungen in der Biofilmarchitektur in Gegenwart von antimikrobiellen Mitteln unter verschiedenen Bedingungen quantitativ zu identifizieren. Insgesamt zielt diese Methode darauf ab, subjektive Variationen, die mit der manuellen Bedienung von COMSTAT verbunden sind, zu eliminieren und so die Standardisierung von Protokollen über Zentren hinweg zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>Anti-Psl mAb, Psl0096</td><td>Medimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blut-Agar (TSA mit 5 % Schafblut) Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>Acht-Well-Kammer-Deckglas mit nicht abnehmbaren Vertiefungen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SYTO 9 Grün fluoreszierender Nukleinsäure-Fleck</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>LB BRON (LENNOX), Flüssigautoklav sterilisiert</td><td>BioShop Canada</td><td>LBL666</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin, 900 & Mikro; g/mg</td><td>Alfa Aesar von Thermo Fisher Scientific</td><td>J66040</td><td>Es wird empfohlen, für jede hergestellte Charge einen Test der minimalen Hemmkonzentration (MIC) durchzuführen, um die Qualitätskontrolle der antimikrobiellen Wirksamkeit</td></tr><tr><td>zu gewährleisten Quorum Volocity 6.3</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der auswirkungen von antibiotika auf die in-vitro-biofilmarchitektur mit der comstat-software

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilme sind Aggregate von Mikroorganismen, die auf einer selbst produzierten Matrix aus extrazellulärer Polymersubstanz zum Schutz und zur strukturellen Integrität beruhen. Es ist bekannt, dass der nosokomiale Erreger Pseudomonas aeruginosa einen Biofilm-Wachstumsmodus annimmt, der bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) eine chronische Lungeninfektion verursacht. Das Computerprogramm COMSTAT ist ein nützliches Werkzeug zur Quantifizierung antimikrobiell induzierter Veränderungen in der Biofilmarchitektur von P. aeruginosa , indem Daten aus dreidimensionalen konfokalen Bildern extrahiert werden. Die standardisierte Bedienung der Software wird jedoch weniger häufig angesprochen, was für eine optimale Berichterstattung über das Biofilmverhalten und einen zentrumsübergreifenden Vergleich wichtig ist. Ziel dieses Protokolls ist es daher, einen einfachen und reproduzierbaren Rahmen für die Quantifizierung von In-vitro-Biofilmstrukturen unter unterschiedlichen antimikrobiellen Bedingungen über COMSTAT bereitzustellen. Die Technik wird unter Verwendung eines CF P. aeruginosa-Isolats modelliert, das in Form von Biofilmreplikaten gezüchtet und Tobramycin und dem monoklonalen Anti-Psl-Antikörper Psl0096 ausgesetzt wurde. Der Schritt-für-Schritt-Ansatz zielt darauf ab, die Mehrdeutigkeit der Benutzer zu reduzieren und die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, wichtige Bildverarbeitungsschritte zu übersehen. Insbesondere betont das Protokoll die Eliminierung subjektiver Variationen, die mit der manuellen Bedienung von COMSTAT verbunden sind, einschließlich der Bildsegmentierung und der Auswahl geeigneter quantitativer Analysefunktionen. Obwohl diese Methode erfordert, dass Benutzer zusätzliche Zeit für die Verarbeitung konfokaler Bilder aufwenden, bevor sie COMSTAT ausführen, hilft sie, falsch dargestellte Biofilmheterogenität in automatisierten Ausgaben zu minimieren.

Ein P. aeruginosa-Isolat , das von einem infizierten Patienten mit CF kultiviert wurde, wird verwendet, um die Stärken dieses Ansatzes bei der genauen Quantifizierung von antimikrobiell induzierten Veränderungen in der In-vitro-Biofilmarchitektur zu demonstrieren. Der gesamte Arbeitsablauf dieses Modells ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Bildverarbeitungs- und COMSTAT-Analyseverfahren in ImageJ ist in Abbildung 2 dargestellt. <strong class="x...

Antimikrobiell induzierte Veränderungen der Biofilmarchitektur von Pseudomonas aeruginosa unterscheiden sich zwischen klinischen Isolaten, die von Patienten mit Mukoviszidose und chronischer Lungeninfektion kultiviert wurden. Nach der konfokalen Mikroskopie kann die COMSTAT-Software verwendet werden, um Variationen in der Biofilmarchitektur (z. B. Oberfläche, Dicke, Biomasse) für einzelne Isolate zu quantifizieren und so die Wirksamkeit von Antiinfektiva zu bewerten.

Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural ...

Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es einen einfachen und reproduzierbaren Rahmen für die Quantifizierung von in vitro Biofilmstrukturen unter unterschiedlichen antimikrobiellen Bedingungen bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dazu beiträgt, subjektive Variationen zu eliminieren, die mit der manuellen Bedienung von COMSTAT verbunden sind, was letztendlich die Standardisierung und Transparenz von Experimenten in Forschungszentren erleichtert. Um die Pseudomonas aeruginosa-Kulturen abzubilden, stellen Sie die Platte auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops, das mit den entsprechenden Laseranregungswellenlängen und Filtersets ausgestattet ist.Und verwenden Sie eine 20- bis 25-fache Wasserimmersionslinse, um mindestens sechs geschichtete Z-Stapel-Bilder vom Substrat bis zur Spitze jedes Biofilmsegments in Schritten von 0,3 Mikrometern aufzunehmen. Speichern Sie dann die Bilder als OME-TIFFs für die COMSTAT-Analyse. Wenn alle Bilder abgerufen wurden, öffnen Sie das COMSTAT2 Paket in ImageJ und erstellen Sie einen Quellordner auf dem Desktop.Fügen Sie dem Ordner eine einzelne OME-TIFF-Datei hinzu, und öffnen Sie die OME-TIFF-Datei aus dem Quellordner. Löschen Sie alle leeren Schichten, die keine Biomasse enthalten. Wählen Sie Datei, Importieren und Bildsequenz aus, um die Datei in ImageJ zu importieren.Suchen und markieren Sie den Quellordner, ohne ihn zu öffnen, und klicken Sie auf Auswählen. Ein Fenster mit den Sequenzoptionen wird angezeigt, klicken Sie auf OK. Wählen Sie Bild, Transformieren und Z umkehren, um die Ausrichtung des Biofilms so umzudrehen, dass sich das Substrat am oberen Rand des Stapels befindet. Um die Bildeigenschaften zu definieren, wählen Sie Bild und Eigenschaften, ein Quellfenster wird angezeigt.Geben Sie die Längeneinheit als Mikrometer an, definieren Sie die Voxeltiefe als 0,3 und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus. Um den Bildschwellenwert im Schwellenwertfenster anzupassen, positionieren Sie den unteren Schieberegler ganz rechts, um den maximalen Schwellenwert manuell festzulegen, und verwenden Sie den oberen Schieberegler, um den minimalen Schwellenwert festzulegen. Verwenden Sie dann den Schieberegler im Bildfenster, um durch die einzelnen Ebenen zu scrollen, um sicherzustellen, dass das Hintergrundrauschen im gesamten Stapel ausreichend entfernt wird, und wählen Sie Festlegen aus, um den unteren Schwellenwert festzulegen.Wählen Sie im Fenster "Schwellenwerte festlegen" die Option "OK" aus, und legen Sie den maximalen Schwellenwert auf ähnliche Weise fest und korrigieren Sie ihn. Wählen Sie Anwenden aus, klicken Sie im angezeigten Fenster Stack in Binär konvertieren auf OK und schließen Sie das Schwellenwertfenster. Wählen Sie Plugins, Bio-Formate und Bio-Formate-Exporter, um die Datei unter einem neuen Dateinamen im Quellordner zu speichern.Das Fenster "Bio-Formats Exporter für mehrere Dateien" wird angezeigt, wählen Sie OK. Ein Optionsfenster für den Bioformat-Exporter wird angezeigt, wählen Sie erneut OK aus. Um COMSTAT auszuführen, wählen Sie Plugins und COMSTAT2 aus, ein Info-Fenster wird angezeigt, wählen Sie OK.In Fenster Beobachtete Verzeichnisse aus, wählen Sie Hinzufügen, suchen und markieren Sie den Quellordner, markieren Sie ihn und klicken Sie auf Auswählen. Es erscheint das Fenster Bilder in Verzeichnissen, in dem die zu analysierenden OME-TIFFs aufgelistet sind.Deaktivieren Sie im COMSTAT2.1-Fenster die Option Automatische Schwellenwertbestimmung für die Otsu-Methode und die Filterung des verbundenen Volumens, um sicherzustellen, dass die Software voreingestellte Schwellenwerte für einzelne OME-TIFFs verwendet. Wählen Sie im Fenster COMSTAT2.1 die Option Biomasse, Dickenverteilung und Oberfläche aus, und klicken Sie auf Los, um das Programm auszuführen. Die Ausgabedaten werden im Protokollfenster angezeigt.Die Messungen werden automatisch als TXT-Dateien im Quellordner gespeichert. In dieser repräsentativen Analyse wurde ein Pseudomonas aeruginosa-Isolat verwendet, das von einem infizierten Mukoviszidose-Patienten kultiviert wurde, um die Stärken dieses Ansatzes zu demonstrieren und antimikrobiell induzierte Veränderungen in der in vitro Biofilmarchitektur ungenau zu quantifizieren. Die Bildgebung von lebenden Zellen kann auch Veränderungen in der Biofilmstruktur von Pseudomonas aeruginosa vor und nach einer biofilmspezifischen monoklonalen und Tobramycin-Behandlung sichtbar machen.Die COMSTAT-Datenanalyse ergab signifikante Unterschiede zwischen den behandelten Biofilmstrukturen im Vergleich zu Kontrollkulturen. In mit Tobramycin behandelten Kulturen wurde eine deutliche Verringerung der durchschnittlichen Dicke und Biomasse beobachtet. In Gegenwart von Antikörpern war der P.aeruginosa-Biofilm jedoch resistent gegen diese Tobramycin-induzierten Strukturveränderungen.Bei der Untersuchung des Verhältnisses von Oberfläche zu Biovolumen wurde eine signifikante Verringerung des Vorhandenseins von Antikörpern sowohl in Tobramycin-exponierten als auch in unexponierten Biofilmen beobachtet, was auf die Bildung von Aggregaten in mit Antikörpern behandelten Kulturen hinweist. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden, um die Wirkungen verschiedener antimikrobieller Mittel, die zur Störung von Biofilmmatrizen verwendet werden, quantitativ zu bewerten oder zu vergleichen. Mit dieser Technik als allgemeinem Rahmen können Forscher verschiedene Möglichkeiten erkunden, das Protokoll zu verfeinern, um neue mathematische Modelle und algorithmische Plugins in ImageJ aufzunehmen, um die Heterogenität von Biofilmen besser darzustellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Biofilme auf der Zahnoberfläche gebildet sind sehr komplex und in denen konstante angeborenen und exogene ökologischen Herausforderungen, die ihre Architektur modulieren, Physiologie und Transkriptom. Wir entwickelten eine Toolbox, um die Zusammensetzung, die strukturelle Organisation und Genexpression von oralen Biofilmen, die auf andere Bereiche der Biofilm-Forschung angepasst werden können zu prüfen.

Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Quelle: Tay, S. B., et al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen.  J. Vis. Exp. (2016)Das Video demonstriert eine Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse in einem pathogenen Bakterium, indem unbehandelte Kontrollen mit Proben verglichen werden, die mit einem Quorum-Abschreckungsenzym behandelt wurden. Das Enzym stört die bakterielle Signalübertragung während der frühen Inkubation und verringert so die Zelladhäsion. Nach dem Waschen und...

Quantifizierung enzyminduzierter Biofilmsuppression bei pathogenen Bakterien

Quelle: Tay, S. B., et.al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen.  J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert den Prozess der Hemmung der Biofilmbildung, indem ein Enzym eingeführt wird, das die Signalübertragung der bakteriellen Zellen stört. Das Enzym verhindert, dass die Bakterien extrazelluläre polymere Substanzen produzieren, wodurch die Biofilmentwicklung auf einer Glasboden-Mikroschüssel reduziert wird. Abschließend wird die...

Mikroskopische Bewertung der enzymvermittelten Hemmung der Biofilmbildung

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Diese Studie präsentiert die Entwicklung reproduzierbarer Methoden zur Untersuchung von Biofilm-Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bacillus subtilis-Vielzelligkeit.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Biofilminfektionen zeigen eine hohe Toleranz gegenüber Chemotherapien. Kein einzelner Assay erfasst die Komplexität von Biofilmen. Stattdessen werden komplementäre Assays benötigt. Wir präsentieren eine Screening-Plattform (entwickelt für S. aureus), die Assays für Viabilität, Biomasse und Biofilmmatrix kombiniert. Es ermöglicht die Entdeckung von Anti-Biofilm-Medikamenten, einschließlich der Bewertung langfristiger chemotherapeutischer Wirkungen.

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, der statische und dynamische Methoden kombiniert, um die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen in der Milchindustrie zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer biologischer oder chemischer Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen zu testen.

Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.

Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Diese Methodik ermöglicht die Etablierung eines polymikrobiellen Biofilmmodells bei Mukoviszidose für antimikrobielle Sensitivitätstests in Forschungs- und klinischen Laboratorien. Dieses Modell liefert genaue und zuverlässige Ergebnisse über einen Bereich von Ausgaben.

Entwicklung eines polymikrobiellen Kolonie-Biofilmmodells zur Erprobung von Antibiotika bei Mukoviszidose

Erfahren Sie, wie man Biofilmarchitekturen von Pseudomonas aeruginosa unter antimikrobiellen Bedingungen mit COMSTAT-Software quantifiziert. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Analysen und eliminiert subjektive Variationen in der Biofilmforschung.

Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software

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