Name: Transuterine Fetal Tracheal Okklusion Modell bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Lernen Sie die fetale Trachealokklusion bei Mäusen zur Untersuchung der Lungenentwicklung und Pathophysiologie der angeborenen Zwerchfellhernie. Diese reversible Technik ermöglicht genetische Analysen mit reduzierter Tiersterblichkeit.

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Diese Forschung erhielt keine spezifischen Zuschüsse von Förderstellen in den Bereichen öffentliche, kommerzielle oder gemeinnützige Zwecke. Alle Autoren haben wesentliche Beiträge zur Konzeption und Gestaltung der Studie, des Erwerbs, der Analyse und der Interpretation von Daten geleistet, den Artikel verfasst und für wichtige intellektuelle Inhalte und die endgültige Genehmigung der einzureichenden Fassung überarbeitet. Die Autoren danken Can Sabuncuo-lu für seine freundlichen Bemühungen bei der Herstellung des Kunstwerks der chirurgischen Technik.

Alle Experimente entsprechen dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, revidiert 1978). Das Verfahren wurde mit dem IACUC-Protokoll #2016-0068 vom Ausschuss für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Cincinnati Children es Research Foundation genehmigt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Um altersgerechte Wildtyp (WT) C57BL/6 Mäuse zu paaren, legen Sie sie um 18:00 uhr .m. in denselben Käfig und trennen Sie sie am nächsten Tag um 9:00 .m.</li>
	<li>Um den embryonalen Tag 0 (E0) zu bestimmen, schauen Sie sich den Vaginalstecker an, der eine homogene äußere Zone an der Scheidenwand und eine innere Zone hat, die faserig ist und einige Spermatozoen enthält, die verschränkte Massen bilden, die mit den Fasern des Steckermaterials vermischt sind.</li>
	<li>Zeichnen Sie das Gewicht der Mäuse zum Zeitpunkt der Paarung auf.</li>
	<li>Wiegen Sie die Mäuse auf E10 erneut, um eine laufende Schwangerschaft zu gewährleisten.</li>
	<li>Führen Sie die Operation an E16.5 (frühe simkuläre Stufe) durch.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Instrumente, die während der Operation verwendet werden: Schere, Nadelhalter, Zange, Klammern und chirurgische Messer und Griffe.</li>
	<li>Die Operationsplattform auf 24 °C vorheizen und vor der Operation warme Saline (24 °C) vorbereiten.</li>
	<li>Schaffen Sie eine warme Umgebung für die Erholung, und lassen Sie nasse Nahrung im Käfig für die frühe Fütterung.</li>
	<li>Bleiben Sie bei den operierten Tieren, bis sie sich selbst ernähren können.</li>
	<li>Halten Sie die operierten Mäuse nach der Operation allein in ihren einzelnen Käfigen.</li>
</ol>2. Anästhesie
<ol><li>Subkutane 0,1 mg/kg Buprenorphin auf die trächtigen Muttermütter 1 h vor dem Eingriff auftragen.</li>
	<li>Verwenden Sie inhalierte 5 ml/h Isofluran zur Induktion und 2 ml/h kontinuierlich während des Anästhesieverfahrens.</li>
	<li>Überwachen Sie die Bewegungen der Kinn der trächtigen Mäuse.</li>
</ol>3. Laparotomie
<ol><li>Reinigen Sie die Bauchoberfläche mit Alkohol und Povidon-Jod. Halten Sie die sterilen Bedingungen während des gesamten Betriebs aufrecht.</li>
	<li>Führen Sie einen vertikalen Schnitt für die Laparotomie von schwangeren Muttertieren durch. Schneiden Sie alle Ebenen separat.</li>
	<li>Identifizieren Sie Uterushörner auf jeder Seite.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Kandidaten Föten für die Operation. HINWEIS: Betreiben Sie nicht an den Föten, die der Vagina am nächsten sind.</li>
	<li>Betreiben Sie auf zwei Föten in jedem Gebärmutterhorn, wenn es eine gerade Anzahl von Föten auf jeder Seite (4 die meiste Zeit), und auf 1 Fötus in jedem Gebärmutterhorn, wenn es eine ungerade Anzahl der Gebärmutter (3 die meiste Zeit).</li>
</ol>4. Trachealverschluss
<ol><li>Verwenden Sie 2,5-fache Vergrößerungsgläser für die Visualisierung.</li>
	<li>Positionieren Sie das Gebärmutterhorn quer.</li>
	<li>Nehmen Sie die Welpen, nach oben gerichtet, zwischen zwei Fingern mit den Augen der Welpen und dem Schwanz als Leitfaden, um den Fötus zu positionieren.</li>
	<li>Tragen Sie sanften Druck auf den Kopf des Welpen, um eine Verlängerung des Kopfes und damit die Visualisierung des Halses zu ermöglichen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 6,0-Polypropylen-Nähte mit einer atraumatischen Nadel, um TO durchzuführen (Abbildung 1). Halten Sie die Plazenta auf der Seite und weit von den Ein- und Ausstiegspunkten der Nadel.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel quer durch die Seite der Gebärmutter weg von der Plazenta durch den 1/3rd vorderen Teil des Halses.</li>
	<li>Bewegen Sie die Nadel sanft bis zur Mittellinie des Halses und lenken Sie sie zum vorderen Teil, dann verlassen Sie den Hals zwischen der Luftröhre und gegenüber der Karotisscheide und Gebärmutter.</li>
	<li>Knoten Sie die Naht, achten Sie darauf, die Integrität der Membranen und Der Gebärmutterwand zu erhalten, und halten Sie die Nabelschnur während des Knotens sicher.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61772/61772fig01.jpg"> Abbildung 1: Trachealverschluss. (A) Die transuterine Naht, die durch den Hals geht. (B) Schematische Darstellung der Strukturen nach der Naht durchundgeht und vor dem Knoten. Abkürzungen: C = Halsschlagader; J = Jugularvene; T =Trachea; E = Speiseröhre; V = Wirbel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61772/61772fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
5. Bauchwandverschluss
<ol><li>Ersetzen Sie das Gebärmutterhorn im Bauch.</li>
	<li>Vor verschluss 2 ml warmsterile Saline in die Peritonealhöhle geben.</li>
	<li>Legen Sie eine laufende 5/0 Polyglactin Naht, um die Bauchwand zu schließen, und schließen Sie die Haut mit einer nicht laufenden Seidennaht.</li>
	<li>0,1 mg/kg Buprenorphin intraperitoneal für Analgesie auftragen und die Rückgewinnung des Damms in einem warmen Inkubator ermöglichen.</li>
</ol>6. Ernte
<ol><li>Anästhesie auf die schwangere Mutter auftragen und alle Föten bei E18.5 per Kaiserschnitt ernten.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Föten, indem Sie die Bewegungen der Föten beobachten.</li>
	<li>Verwenden Sie mindestens zwei verschiedene Techniken für die Euthanasie: Kohlendioxid-Insufflation und zervikale Dislokation.</li>
	<li>Entfernen Sie die Stellen gemäß der Verordnung des Veterinärlabors.</li>
	<li>Wiegen Sie alle Föten.</li>
	<li>Führen Sie einen vertikalen Schnitt am Thorax für Thorakotomie, um die Lunge zu entfernen.</li>
	<li>Sezieren Sie die Lunge von Embryonen und wiegen Sie sie, um das Gesamtgewicht von Lunge zu Körper zu berechnen (LBWR = (linkes Lungengewicht + rechtes Lungengewicht)/Körpergewicht x100).</li>
</ol>7. Histologie
<ol><li>Fangen Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff, optimaler Schnitttemperaturverbindung und Trockeneis ein.</li>
	<li>Schneiden Sie die Proben in 10 m Abschnitte mit einem Kryostat und montieren Sie sie auf polylysinbeschichteten Dias.</li>
	<li>Backen Sie die Dias bei 60 °C über Nacht und färben Sie die gebackenen Dias mit Hämatoxylin und Eosin, bevor Sie sie zur Bildaufnahme bei 10-20-facher Vergrößerung mit einem Weitfeldmikroskop montieren.</li>
</ol>8. Gewebeverarbeitung für Protein- und DNA-Analysen
<ol><li>Die sezierten fetalen Lungen einfrieren und in 300 L Radioimmunopräzipitations-Assay-Puffer homogenisieren. Zentrifuge bei 4 °C für 5 min bei 18.000 × g.</li>
	<li>Extrahieren und quantifizieren Sie Protein, DNA und RNA10,12.</li>
</ol>

<ol><li>Wright, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+PaedSurg+Research+Collaboration.+Management+and+outcomes+of+gastrointestinal+congenital+anomalies+in+low%2C+middle+and+high+income+countries%3A+protocol+for+a+multicentre%2C+international%2C+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study.</a> BMJ Open. 9, 030452(2019).</li>
<li>Aydin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approach+for+prenatally+diagnosed+congenital+anomalies+that+requires+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Clinics+Journal+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery.</a> Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).</li>
<li>Nolan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorrhage+after+on-ECMO+repair+of+CDH+is+equivalent+for+muscle+flap+and+prosthetic+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).</li>
<li>Aydin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+diaphragmatic+hernia%3A+the+good%2C+the+bad%2C+and+the+tough%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough.</a> Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+congenital+diaphragmatic+hernia-associated+musculoskeletal+deformities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities.</a> Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).</li>
<li>Aydın, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+primary+repair+is+not+enough%3A+a+comparison+of+synthetic+patch+and+muscle+flap+closure+in+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia.</a> Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).</li>
<li>Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+fetal+tracheal+ligation+prevents+the+pulmonary+hypoplasia+associated+with+fetal+nephrectomy%3A+Possible+application+for+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).</li>
<li>Mudri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tracheal+occlusion+on+Wnt+signaling+in+a+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).</li>
<li>Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+occlusion%3A+a+review+of+obstructing+fetal+lungs+to+make+them+grow+and+mature%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+C%2C+Seminars+in+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li>
<li>Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+animal+models+to+human+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).</li>
<li>Varisco, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+reversal+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+ephrin+signaling+following+tracheal+occlusion+in+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Methode beschreibt einen chirurgischen Eingriff der fetalen Trachealverschlussbeiklusion bei Mäusen und seine Auswirkungen auf die Lungenentwicklung. Es gibt einige wichtige Schritte im Protokoll, die sorgfältig ausgeführt werden sollten, um erfolgreicheTO durchzuführen. Die Wärme der Plattform, auf der die Operation stattfindet und die in die Peritonealhöhle eingeführte Saline ist entscheidend für das Fortschreiten der Schwangerschaft. Darüber hinaus muss ein leichter Druck auf den Kopf der Welpen ausgeübt werden,...

Angeborene Zwerchfellhernie (CDH) tritt in 1:2500 Schwangerschaften auf und führt zu pulmonaler Hypoplasie und neonataler pulmonaler Hypertonie1,2,3,4,5,6. Fetale Trachealverschluss (TO) ist eine etablierte pränatale Therapie bei schweren CDH-Patienten mit Fetoskopie in der 26-30. Schwangerschaftswoche, in der ein Ballon knapp über der Karina platziert und dann in der32. Schwangerschaftswoche entfernt wird. Diese vorübergehende TO induziert fetales Lungenwachstum und verbessert das Überleben. Das angeborene High Airway Obstruction Syndrom ist eine tödliche Erkrankung im Zusammenhang mit Lungenhyperplasie, die Chirurgen dazu inspirierte, künstliche Okklusion der Luftröhre durchzuführen, um die Retention der abgesonderten Epithelflüssigkeit zu fördern. Diese Okklusion erhöhte den Luminaldruck und induzierte Lungenwachstum7. Die Okklusion sollte jedoch umgekehrt werden, um die Epithelzellreifung zu ermöglichen.
Verschiedene Tiermodelle von CDH und TO - Schafe, Kaninchen, Ratten und Mäuse - wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von CDH und TO zu verstehen. Alle haben ihre eigenen Vor- und Nachteile wie die Schwierigkeit der Technik, die Größe des Tieres, die Kosten, die hohen Sterblichkeitsraten und die Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge. Obwohl die chirurgische Technik, die für das Schafmodell verwendet wird, der beim Menschen verwendeten sehr ähnlich ist und umgekehrt werden könnte, sind die Hauptnachteile dieses Modells die Kosten des Tieres, die lange Schwangerschaftszeit und die begrenzte Anzahl von Operationen möglich. Das Kaninchenmodell hat eine kürzere Trächtigkeitszeit und ist kostengünstiger als das Schafmodell. Das Kaninchenmodell ist jedoch irreversibel8,9. Das murine Modell hat die niedrigsten Kosten, die höchste Anzahl von Föten pro Schwangerschaft, das am besten charakterisierte Genom und weit verbreitete Werkzeuge für zelluläre und molekulare Analysen. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch die fehlende Reversibilität des TO, wodurch ein vollständiges Verständnis der Auswirkungen von TO verhindert wird. Hierin wird eine Methode vorgestellt, die alle Vorteile der oben genannten Modelle vereint und ein einfaches, potenziell reversibles und minimalinvasives Nagetier-TO-Modell schafft.

<table><tbody><tr><td>Buprenorphin&nbsp;</td><td>von Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Für Regionalanästhesie</td></tr><tr><td>Isofluran&nbsp;</td><td>&nbsp; Halogenkohlensäure Life Sciences</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>Für die Allgemeinanästhesie</td></tr><tr><td>Vergrößerungsbrille</td><td>USA Medizinisch-chirurgisch</td><td>SLR-250LBLK</td><td>Mindestens 2,5x</td></tr><tr><td>Nikon 90i Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>3417</td><td>Motorisierte Fluoreszenz</td></tr><tr><td>Nukleospin Gewebe Kit&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel, D&uuml; ren, Deutschland</td><td>740952.5</td><td>DNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher, IL, USA</td><td>23225</td><td>Proteinquantifizierung</td></tr><tr><td>Polyglactin-Naht</td><td>Ethicon</td><td>VCP451H</td><td>4-0, 24 mm, Schneiden</td></tr><tr><td>von Polylysin-Objektträgern&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>48382-117</td><td>Adhäsionsobjektträger</td></tr><tr><td>Polypropylen-Nahtmaterial</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint</td></tr><tr><td>RIPA-Puffer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>R0278-50ml</td><td>Proteinisolierung</td></tr><tr><td>Seidennaht</td><td>Ethicon</td><td>VCP682G</td><td>4-0, 24 mm, Schneiden</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15596026 RNA-Isolierung</td><td></td></tr></tbody></table>

transuterine fetal tracheal okklusion modell bei mäusen

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Fetale Trachealverschluss (TO), eine etablierte Behandlungsmodalität, fördert das fetale Lungenwachstum und das Überleben bei schwerer angeborener Zwerchfellhernie (CDH). Nach TO erhöht die Retention der abgesonderten Epithelflüssigkeit den Luminaldruck und induziert Lungenwachstum. Verschiedene Tiermodelle wurden definiert, um die Pathophysiologie von CDH und TO zu verstehen. Alle haben ihre eigenen Vor- und Nachteile wie die Schwierigkeit der Technik, die Größe des Tieres, die Kosten, die hohen Sterblichkeitsraten und die Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge. Hierin wird ein neuartiges transuterines Modell des murinen fetalen TO beschrieben. Schwangere Mäuse wurden anästhesisiert und die Gebärmutter über eine Mittellinien-Laparotomie exponiert. Die Luftröhre ausgewählter Föten wurde mit einer einzigen transuteren Naht hinter der Luftröhre, einer Karotisarterie und einer jugularen Vene ligiert. Der Damm wurde geschlossen und konnte sich erholen. Fetusen wurden kurz vor der Teilnahme gesammelt. Lungen-Körper-Gewicht-Verhältnis bei To Föten war höher als bei der Kontrolle Föten. Dieses Modell bietet Forschern ein neues Werkzeug, um die Auswirkungen von TO und erhöhtem Luminaldruck auf die Lungenentwicklung zu untersuchen.

Diese Studie untersuchte 37 Föten: 20 (54,1%) wie TO vs. 17 (45,9%) als Kontrolle. Da die Luftröhre nicht in 4 Föten der TO-Gruppe verfeinert werden konnte, wurden sie von der Studie ausgeschlossen. In beiden Gruppen gab es keinen signifikanten Unterschied in der Sterblichkeit: 4 Föten (25%) in der TO-Gruppe und 2 Föten (12%) in der Kontrollgruppe (p=0,334, Odds Ratio (OR) 2,5, 95% Konfidenzintervall (CI) 0,39-16,05). Das mittlere Körpergewicht, das Lungengewicht und das Verhältnis von Lu...

Verschiedene Tiermodelle der angeborenen zwerchmatischen Hernie und fetalen Trachealverschluss stellen Vor- und Nachteile in Bezug auf ethische Fragen, Kosten, chirurgische Schwierigkeiten, Größe, Überlebensraten und Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge dar. Dieses Modell bietet ein neues Werkzeug, um die Auswirkungen von Trachealokklusion und erhöhtem Luminaldruck auf die Lungenentwicklung zu untersuchen.

Transuterine Fetal Tracheal Okklusion Modell bei Mäusen

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind Reversibilität, Senkung der Kosten der Tiere und Wartung, und eine kürzere Schwangerschaftszeit. Darüber hinaus wird die Tiersterblichkeit reduziert, weil keine Hysterektomie erforderlich ist. Und es gibt breitere Möglichkeiten für genetische Aufarbeitung.Diese Technik kann zur Untersuchung der Pathophysiologie der angeborenen Zwerchfellhernie verwendet werden. Es kann auch angewendet werden, um andere Krankheiten in der Lunge zu verstehen, wie Kühe und Lungenhypoplasie. Beginnen Sie damit, dass sich die Mäuse von 18:00 Uhr bis 21:00 Uhr am nächsten Tag im selben Käfig paaren können.Um E0 zu bestimmen, beobachten Sie den Vaginalstecker, der eine homogene, äußere Zone an der Scheidenwand und eine innere Zone, die faserig ist, hat und einige Spermatozoen enthält, die verschränkte Massen bilden, die mit den Fasern des Steckermaterials vermischt sind. Zeichnen Sie das Gewicht der Mäuse zum Zeitpunkt der Paarung und auf E10 auf, um eine laufende Schwangerschaft zu gewährleisten und führen Sie die Operation bei E16.5 durch. Sterilisieren Sie die Instrumente, die während der Operation verwendet werden.Die Operationsplattform auf 24 Grad Celsius vorheizen und vor der Operation warme Saline vorbereiten. Schaffen Sie eine warme Umgebung für die Erholung und lassen Sie nasse Nahrung im Käfig für die frühe Fütterung. Reinigen Sie die Bauchoberfläche mit Alkohol und Povidon Jod und halten Sie während der gesamten Operation sterile Bedingungen.Führen Sie einen vertikalen Schnitt für die Laparotomie von trächtigen Muttertieren durch und schneiden Sie alle Schichten getrennt. Identifizieren Sie die Uterushörner auf jeder Seite und bestimmen Sie die Kandidaten Föten für die Operation. Betreiben Sie an zwei Föten in jedem Gebärmutterhorn, wenn es eine gerade Anzahl von Föten auf jeder Seite.Und auf einem Fötus in jedem Gebärmutterhorn, wenn es eine ungerade Zahl gibt. Positionieren Sie das Gebärmutterhorn mit 2X Vergrößerungsgläsern zur Visualisierung quer. Positionieren Sie die Welpen nach oben zwischen zwei Fingern mit den Augen und dem Schwanz als Leitfaden.Tragen Sie sanften Druck auf den Kopf des Welpen, um eine Verlängerung des Kopfes und eine Visualisierung des Halses zu ermöglichen. Führen Sie Trachealverschluss oder TO mit einer atraumatischen Nadel und einer 6 mal 0 Polypropylen-Nähte durch. Halten Sie die Plazenta auf der Seite und weit von den Ein- und Ausstiegspunkten der Nadel.Legen Sie die Nadel quer durch die Seite der Gebärmutter, weg von der Plazenta durch den ein Drittel vorderen Teil des Halses. Dann bewegen Sie die Nadel sanft an die Mittellinie des Halses. Richten Sie es auf den vorderen Teil.Dann verlassen Sie den Hals zwischen der Luftröhre und gegenüber der Karotisscheide und Gebärmutter. Knoten Sie die Naht, unter Behutsam, um die Integrität der Membranen und Gebärmutterwand zu erhalten. Ersetzen Sie das Gebärmutterhorn im Bauch und injizieren Sie zwei Milliliter warme sterile Saline in die Peritonealhöhle vor dem Verschluss.Legen Sie eine laufende 5 von 0 Polyglactin Naht, um die Bauchwand zu schließen. Und schließen Sie die Haut mit einer nicht laufenden Seidennaht. 0,1 Mikrogramm pro Kilogramm Buprenorphin intraperitoneal für Analgesie auftragen und den Damm in einem warmen Inkubator erholen lassen.Beachten Sie, dass sich das operierte Tier selbst ernähren und in seinem individuellen Käfig allein halten kann. Ernten Sie alle Föten von E18.5 durch Ceasarean Abschnitt und überprüfen Sie ihre Lebensfähigkeit, indem Sie ihre Bewegungen beobachten. Wiegen Sie alle Föten.Führen Sie einen vertikalen Schnitt am Thorax für eine Thorakotomie, um die Lunge zu sezieren. Und wiegen Sie sie, um das Gesamtgewicht von Lunge zu Körper zu berechnen. Fangen Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff, optimale Schnitttemperatur Verbindung und Trockeneis einfrieren.Schneiden Sie die Proben in Abschnitten von 10 Mikrometern mit einem Kryostat und montieren Sie sie auf polylysinbeschichteten Dias. Backen Sie die Rutschen über Nacht bei 60 Grad Celsius und färben Sie die gebackenen Dias mit Hämatoxylin und Eosin. Bild der Dias mit 10- bis 20-facher Vergrößerung mit einem Weitfeldmikroskop.Für Protein- und DNA-Analysen frieren Sie das Gewebe ein und homogenisieren es in 300 Mikrolitern Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer. Zentrifuge bei 18.000 x g und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Dann extrahieren und quantifizieren Sie Protein, DNA und RNA.Das mittlere Körpergewicht, das Lungengewicht und LBWR waren in der TO-Gruppe höher als in der Kontrollgruppe. Lungen-DNA-Mengen und das DNA-Protein-Verhältnis waren in der TO-Gruppe höher. In der Lungen-RNA wurde kein Unterschied beobachtet, und die Proteinmengen waren in der TO-Gruppe geringer als in der Kontrollgruppe.Histologische Analysen der E18.5-Kontrolllunge zeigten das späte oder frühe sakkare Stadium der Lungenentwicklung mit sich entwickelnden Lufträumen und verdickten Interstitiums zwischen epitheliaalen Oberflächen. Die Lunge in der TO-Gruppe hatte zentrale und distale Lufträume mit subjektiv höheren Kernzahlen erweitert. Beim Versuch dieses Protokolls, Wir fixieren die Nähte in einer Weise, dass die Augen des Fötus sichtbar sind und der Hals verlängert wird, so dass die Nadel nicht die eingestellten Strukturen stören.Die Entfernung der Strukturen zur Wiedergeburt des Fötus im Nitril-Fan und Knockout-Modelle der CDH wird die zukünftige Anwendung dieser Technik sein.

transuterine-fetal-tracheal-occlusion-model-in-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt und vergleicht zwei experimentellen Modellen zur Entwicklung von obliterative Atemwegserkrankung (OAD) bei Mäusen, die heterotopen und orthotopen Transplantation Tracheal-Modell zu studieren.

Heterotope und orthotopen Tracheal Transplantation in Mäuse als Modelle benutzt, um die Entwicklung von obliterans Airway Disease Study

Quer Aorta Verengung (TAC) in der Maus ist eine häufig verwendete experimentelle Modell zugrunde liegenden Mechanismen der Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz Entwicklung zu studieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur Einengung der Aorta zu einem reproduzierbaren Grad der Herzhypertrophie in Mäusen zu erzeugen.

Quer Aorten-Verengung in Mäuse

Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle...

In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen

Wir entwickelten eine neuartige chirurgische Ansatz für intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in die Maus Fötus. Die Transportroute ist effizienter bei der Ausrichtung der fetalen Mauslungen als der üblicherweise verwendete intra-Fruchtwasser Injektion. Dieses Verfahren hat sich nicht in einem Mausmodell wurden bisher beschrieben.

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

Dieses Video zeigt die transuterine tracheale Okklusion eines Mausfötus bei einer trächtigen Maus. Dieses Modell kann verwendet werden, um den Einfluss einer verschlossenen Luftröhre auf die Lungenentwicklung zu untersuchen.

Modellierung des transuterinen fetalen Trachealverschlusses im Mausmodell: Ein chirurgisches Verfahren zur Ligatur der fetalen Luftröhre bei einer trächtigen Maus

Wir haben eine einfache, zuverlässige und relativ kostengünstiges Verfahren zur Intubation bei Mäusen durch direkte Laryngoskopie mit einem Otoskop mit einem 2,0-mm-Spekulum entwickelt. Diese Technik ist atraumatisch und für wiederholte Messungen bei chronischen Experimente eingesetzt werden. Wir finden es besser als zuvor berichtet, Tracheostoma oder chirurgischen Techniken.

Intubation bei Mäusen<em&gt; Über</em&gt; Direkte Laryngoskopie Mit einem Otoskop

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll der transversalen Aortenstenose Verengung (TAC) über eine laterale Thorakotomie. Diese Technik ist ein minimal-invasive, geschlossenen Brust chirurgischer Eingriff mit dem Ziel, drucküberlastung und Herzinsuffizienz bei Mäusen unter Verwendung der Standardeinstellungen TAC-Labor zu simulieren.

Eine geschlossen Kasten Modell quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen zu induzieren

Transplantat Stenose stellt eine kritische Hindernis Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz. Um zellulären Mechanismen, die Stenose zu untersuchen, verwenden wir ein Mausmodell entwickelt trachealen Gewebeersatz mit kernigen Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC). Hier zeigen wir unsere Protokoll, einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation.

Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine verfeinerte Methode der Intubation der Labormaus zu beschreiben. Die Methode ist nichtinvasiv und daher ideal für Studien, die eine serielle Überwachung der Atemfunktion und/oder die Instillation von Behandlungen in die Lunge erfordern.

Wiederholte orotracheale Intubation bei Mäusen

Ein chirurgisches Mausmodell zur Erzeugung einer Reperfusionsverletzung der linken Lunge (IR) bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Beatmung und Vermeidung von Hypoxie.

Ein Mausmodell der orotrachealen Intubation und der beatmeten Lungenischämie-Reperfusionschirurgie

Das Modell der intrapulmonalen Trachealtransplantation (IPTT) ist wertvoll für die Untersuchung der obliterativen Atemwegserkrankung (OAD) nach Lungentransplantation. Es bietet Einblicke in das lungenspezifische immunologische und angiogene Verhalten bei der Atemwegsobliteration nach Allotransplantation mit hoher Reproduzierbarkeit. Hier beschreiben wir das IPTT-Verfahren und die zu erwartenden Ergebnisse.

Intrapulmonale Trachealtransplantation bei Mäusen: Ein Modell zur Untersuchung obliterativer Atemwegserkrankungen nach Lungentransplantation

Lernen Sie die fetale Trachealokklusion bei Mäusen zur Untersuchung der Lungenentwicklung und Pathophysiologie der angeborenen Zwerchfellhernie. Diese reversible Technik ermöglicht genetische Analysen mit reduzierter Tiersterblichkeit.

Transuterine Fetal Tracheal Okklusion Modell bei Mäusen

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