Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, Brustkrebsstammzellen mit maximaler Reinheit und Lebensfähigkeit für die Durchführung von In-vitro- und In-vivo-Assays zur funktionellen Charakterisierung zu isolieren. Isolierte Brustkrebsstammzellen können auch verwendet werden, um die molekularen Ereignisse aufzuklären, die die Tumorigenität und Metastasierung steuern, und um therapeutische Strategien zu entwickeln, die auf diese Zellen abzielen. Mit geringfügigen Modifikationen, die spezifisch für die interessierenden Zell- und Gewebetypen sind, kann diese Methode auch auf andere Systeme angewendet werden.

Um eine einzelne Zellsuspension aus einer Zellkultur zu erzeugen, waschen Sie eine 80%ige konfluente Brustkrebszellkultur mit PBS und behandeln Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer geeigneten Zelldissoziationslösung. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie fünf Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Zelldissoziationslösung zu neutralisieren, und geben Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie das Pellet zum Zählen in fünf Millilitern PBS.

Nach der Zählung zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie die Zellen dann einmalig 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ALDH-Substratpuffer. Um eine Einzelzellsuspension aus einer Gewebeprobe zu erzeugen, verwenden Sie chirurgische Klingen in einer Kreuztechnik, um das Tumorgewebe in etwa einen Millimeter große Stücke zu zerkleinern. Legen Sie die Stücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Dissoziationspuffer

Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm für eine 40-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler und sedimentieren Sie die verdauten Gewebestücke durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer Fünf-Milliliter-Pipette in fünf Millilitern Trypsin und inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Am Ende der Inkubation pipettieren Sie das Gewebe mehrmals kräftig, um einzelne Zellen freizusetzen, und fügen Sie so viel DMEM/F-12-Medium hinzu, dass das Gesamtvolumen im Röhrchen 25 Milliliter beträgt.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Displace DNAse und inkubieren Sie es fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Bringen Sie am Ende der Inkubation das Gesamtvolumen mit PBS auf 10 Milliliter. Mischen Sie die Zellen durch Pipettieren und führen Sie sie durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern frischem PBS zur Zählung. Um einen koloniebildenden Assay durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen nach dem Sortieren in vollständigem Medium und fügen Sie die entsprechende Anzahl von Brustkrebsstammzellen zu jedem der drei Röhrchen hinzu, die zwei Milliliter Medium pro Röhrchen enthalten, die einmal 10 für die zweite, zweimal 10 für die zweite oder fünfmal 10 für die zweite Zelle markiert sind. Pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um die Zellsuspension gründlich zu mischen, und plättieren Sie die Zellen in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte.

Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu erhalten, und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator, bis Kolonien erscheinen. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation mit einem Milliliter PBS pro Vertiefung und färben Sie die Zellen 30 Sekunden lang mit 500 Mikrolitern 0,05%iger Kristallviolettlösung pro Vertiefung. Waschen Sie die Vertiefungen am Ende der Inkubation zweimal mit zwei Millilitern Wasser pro Vertiefung, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und zählen und notieren Sie die Gesamtzahl der Kolonien pro Vertiefung durch Lichtmikroskopie bei vier- oder zehnfacher Vergrößerung.

Um einen Mammosphären-Assay durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen nach dem Sortieren in vollständigem Mammosphärenmedium und plättieren Sie die Zellen bei einer Sitzdichte von fünf mal 10 der zweiten Zellen pro Quadratzentimeter Fläche pro Vertiefung in einer 96-Well-Zellkulturplatte mit extrem geringer Bindung. Bevor Sie die Anzahl der Mammosphären pro Vertiefung durch Lichtmikroskopie zählen, legen Sie die Platte für fünf bis 10 Tage in den Zellkultur-Inkubator. Um ein 3D-Kulturmodell einzurichten, geben Sie vorsichtig 50 Mikroliter Basalmembranextrakt ohne Blasen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf, damit die Lösung polymerisieren kann.

Fügen Sie nach 10 Minuten 100 Mikroliter PBS hinzu, um ein Austrocknen der Gelschicht zu vermeiden. Am Ende der Inkubation werden die sortierten Zellen auf fünf bis 50 mal 10 bis dritte Zellen pro 200 Mikroliter 3D-Kulturmedium suspendiert und das PBS in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte durch 200 Mikroliter Medien ersetzt, die Zellen enthalten. Legen Sie die Platte dann für 10 bis 14 Tage in den Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die Kulturen auf Organoidbildung untersuchen.

Menschliche Brustkrebszellen, die eine erhöhte enzymatische Aktivität von ALDH aufweisen, exprimieren hohe CD44-Spiegel und niedrige bis negative CD24-Expressionswerte und können als Brustkrebsstammzellen klassifiziert werden. Der Anteil an Brustkrebsstammzellen in der Massenpopulation kann zwischen Zelllinien oder Patienten variieren und hängt oft vom Krankheitsstadium ab, wobei aggressiverer Brustkrebs in der Regel einen höheren Anteil an Brustkrebsstammzellen aufweist. Die Fähigkeit einer einzelnen Brustkrebszelle, sich selbst zu erneuern und Kolonien von 50 Zellen zu erzeugen, kann durch koloniebildende Assays beurteilt werden.

Die Fähigkeit von Brustkrebsstammzellen, sich unter verankerungsunabhängigen experimentellen Bedingungen selbst zu erneuern, kann mit Mammosphären-Assays beurteilt werden. Die Kultivierung von Brustkrebszellen und Basalmembranextrakt ermöglicht es Brustkrebsstammzellen, 3D-Strukturen zu bilden, die sich unter In-vivo-Bedingungen rekapitulieren. Darüber hinaus können in vivo Maus-Xenotransplantatmodelle verwendet werden, um die Unterschiede im Wachstum, in der Selbsterneuerung, der Differenzierung und/oder der tumorinitiierenden Fähigkeit von Brustkrebsstammzellen im Vergleich zu Nicht-Brustkrebsstammzellen oder Massenzellpopulationen zu verstehen.

Nach diesem Verfahren können die isolierten Brustkrebsstammzellen in transkriptomischen, kinomischen und metabolomischen Studien verwendet werden. Diese Methode bietet Forschern die Möglichkeit, die Rolle von Brustkrebsstammzellen bei der Tumorentstehung, Metastasierung, Rezidiv und Therapieresistenz zu untersuchen.