Name: Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit. Diese Methode ermöglicht funktionelle Charakterisierungsassays in vitro und in vivo.

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Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre hilfreichen Gespräche und Unterstützung. Unsere Forschung zu Brustkrebsstammzellen und der Tumormikroumgebung wird durch Zuschüsse des Canadian Cancer Research Society Research Institute und des Brustkrebsprogramms des US-Verteidigungsministeriums (Grant # BC160912) finanziert. V.B. wird durch ein Western Postdoctoral Fellowship (Western University) unterstützt, und sowohl A.L.A. als auch V.B. werden von der Breast Cancer Society of Canada unterstützt. C.L. wird durch ein Vanier Canada Graduate Scholarship der kanadischen Regierung unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Brustkrebsmetastasen und Therapieresistenzen sind weltweit zu einer Haupttodesursache bei Frauen geworden. Die Existenz einer Subpopulation von Brustkrebsstammzellen (BCSCs) trägt zur verstärkten Metastasierung 26,43,44,45,46 und Therapieresistenz21,47,48 bei. Daher s...

Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen menschlicher Brustkrebsstammzellen (BCSCs) ist entscheidend, um die Herausforderungen bei der Brustkrebsbehandlung zu bewältigen. Die Entstehung des BCSC-Konzepts geht auf das frühe 21. Jahrhundert zurück, als eine kleine Population von CD44+CD24-/niedrigen Brustkrebszellen in der Lage war, heterogene Tumore in Mäusen zu erzeugen 1,2. Anschließend wurde beobachtet, dass menschliche Brustkrebszellen mit hoher enzymatischer Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDHhigh) ebenfalls ähnliche stammzellähnliche Eigenschaften aufwiesen3. Diese BCSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind, was zur heterogenen Natur von Massentumoren beiträgt 1,2,3. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen in evolutionär konservierten Signalwegen das Überleben und die Aufrechterhaltung von BCSC vorantreiben 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die extrinsische Mikroumgebung der Zelle eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung verschiedener BCSC-Funktionen spielt15,16,17. Diese molekularen Signalwege und die externen Faktoren, die die BCSC-Funktion regulieren, tragen zum Rückfall von Brustkrebs, zur Metastasierung18 und zur Entwicklung von Therapieresistenzen bei 19,20,21, wobei die Restexistenz von BCSCs nach der Behandlung eine große Herausforderung für das Gesamtüberleben von Brustkrebspatientinnen darstellt22,23 . Die präklinische Bewertung dieser Faktoren ist daher sehr wichtig, um BCSC-zielgerichtete Therapien zu identifizieren, die für bessere Behandlungsergebnisse und ein verbessertes Gesamtüberleben bei Brustkrebspatientinnen von Vorteil sein könnten.
Mehrere in vitro menschliche Brustkrebs-Zelllinienmodelle und in vivo menschliche Xenograft-Modelle wurden verwendet, um BCSCs 24,25,26,27,28,29 zu charakterisieren. Die Fähigkeit von Zelllinien, sich nach jeder nachfolgenden Passage kontinuierlich neu zu besiedeln, macht diese zu einem idealen Modellsystem für die Durchführung von Omics-basierten und pharmakogenomischen Studien. Zelllinien können jedoch die in Patientenproben beobachtete Heterogenität oft nicht rekapitulieren. Daher ist es wichtig, Zellliniendaten mit Patientenproben zu ergänzen. Die Isolierung von BCSCs in ihrer reinsten Form ist wichtig, um eine detaillierte Charakterisierung von BCSCs zu ermöglichen. Das Erreichen dieser Reinheit hängt von der Auswahl der phänotypischen Marker ab, die für BCSCs spezifisch sind. Derzeit wird der ALDH-Zellphänotypmit hohemCD44+CD24-Zellgehalt am häufigsten verwendet, um humane BCSCs aus Massen-Brustkrebszellpopulationen zu unterscheiden und zu isolieren, wobei Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für maximale Reinheit verwendet wird 1, 3,26. Darüber hinaus können die Eigenschaften isolierter BCSCs wie Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung mit in vitro und in vivo Techniken bewertet werden.
Zum Beispiel können In-vitro-Koloniebildungsassays verwendet werden, um die Fähigkeit einer einzelnen Zelle zu beurteilen, sich selbst zu erneuern, um eine Kolonie von 50 Zellen oder mehr bei unterschiedlichen Behandlungsbedingungen zu bilden30. Mammosphären-Assays können auch verwendet werden, um das Selbsterneuerungspotenzial von Brustkrebszellen unter verankerten Bedingungen zu beurteilen. Dieser Assay misst die Fähigkeit einzelner Zellen, bei jeder nachfolgenden Passage unter serumfreien, nicht adhärenten Kulturbedingungen als Kugeln (Mischung aus BCSCs und Nicht-BCSCs) zu erzeugen und zu wachsen31. Darüber hinaus können 3-dimensionale (3D) Kulturmodelle verwendet werden, um die BCSC-Funktion zu bewerten, einschließlich Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, die die In-vivo-Mikroumgebung genau rekapitulieren und die Untersuchung der Aktivität potenzieller BCSC-zielgerichteter Therapien ermöglichen32. Trotz der vielfältigen Anwendungen von In-vitro-Modellen ist es schwierig, die Komplexität von In-vivo-Bedingungen nur mit In-vitro-Assays zu modellieren. Diese Herausforderung kann durch die Verwendung von Maus-Xenograft-Modellen zur Bewertung des BCSC-Verhaltens in vivo überwunden werden. Insbesondere dienen solche Modelle als ideales System zur Beurteilung der Brustkrebsmetastasierung33, zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung während des Krankheitsverlaufs 34, zur In-vivo-Bildgebung 35 und zur Vorhersage der patientenspezifischen Toxizität und Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen 34.
Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung für die Isolierung von humanen ALDHhohenCD44+CD24- BCSCs in maximaler Reinheit aus Massenpopulationen heterogener Brustkrebszellen. Wir bieten auch eine detaillierte Beschreibung von drei In-vitro-Techniken (koloniebildender Assay, Mammosphärentest und 3D-Kulturmodell) und einen In-vivo-Tumor-Xenograft-Assay, der zur Beurteilung verschiedener Funktionen von BCSCs verwendet werden kann. Diese Methoden wären für Forscher geeignet, die an der Isolierung und Charakterisierung von BCSCs aus menschlichen Brustkrebszelllinien oder primär von Patienten abgeleiteten Brustkrebszellen und Tumorgewebe interessiert sind, um die BCSC-Biologie zu verstehen und/oder neuartige BCSC-zielgerichtete Therapien zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>empfohlen: 0,25 &Mikro; g/1x106 Zellen</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyddehydrogenase (ALDH) Substrat</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Kommerziell verkauft als Teil des ALDEFLOUR Assay Kits; befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die ALDH-Substratvorbereitung</td></tr><tr><td>Basalmembranextrakt (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Verkauft unter dem Handelsnamen Matrigel</td></tr><tr><td>Zellkulturplatten: 6 Brunnen</td><td>Corning</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten: 60 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten: 96 Brunnen mit extrem geringer Bindung</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb: 40 Mikron</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>Bereiten Sie eine Verdünnung von 3 mg/ml Kollagen in PBS</td></tr> <tr>im Maßstab 1:30 vor<td>Kollagenase</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>konische Röhrchen: 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>Verwenden Sie 0,05% Kristallviolettlösung in Wasser zum Färben</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, mit L-Glutamin und 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0,1 mg/ml, Endkonzentration</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td><stark>&nbsp; </td></tr><tr><td>FlowRöhrchen: 5 ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td>Fisher 84124</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Humaner CD24-Antikörper</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-Phycoerythrin und Cyaninfarbstoff konjugiert Klon: ML5</td></tr><tr><td>Maus Anti-Humaner CD44-Antikörper</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-Phycoerythrin konjugiert, Klon: G44-26</td></tr><tr><td>N, N-Diethylaminobenzaldehyd (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>Kommerziell verkauft als Teil des ALDEFLOUR Assay Kits; befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers DEAB-Präparat</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, Ohne Calcium und</td></tr><tr><td>Magnesium Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056<</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Mammosphere Medien Zusammensetzung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, mit L-Glutamin und 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 &Mikro; g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D Organoid Media Composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, mit L-Glutamin und 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Neuregulin &beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>R-Spondin3</td><td>R& D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 & Mikro; M</td></tr></tbody></table>

isolierung und funktionelle beurteilung menschlicher brustkrebsstammzellen aus zell- und gewebeproben

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Brustkrebsstammzellen (BCSCs) sind Krebszellen mit vererbten oder erworbenen stammzellähnlichen Eigenschaften. Trotz ihrer geringen Häufigkeit tragen sie wesentlich zur Entstehung, zum Rückfall, zur Metastasierung und zur Therapieresistenz von Brustkrebs bei. Es ist unerlässlich, die Biologie von Brustkrebsstammzellen zu verstehen, um neue therapeutische Ziele zur Behandlung von Brustkrebs zu identifizieren. Brustkrebsstammzellen werden isoliert und charakterisiert, basierend auf der Expression einzigartiger Zelloberflächenmarker wie CD44, CD24 und der enzymatischen Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH). Diese ALDHHighCD44+CD24- Zellen bilden die BCSC-Population und können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) für nachgeschaltete funktionelle Studien isoliert werden. Je nach wissenschaftlicher Fragestellung können unterschiedliche in vitro und in vivo Methoden verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von BCSCs zu beurteilen. Hier stellen wir ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Isolierung von humanen BCSCs sowohl aus heterogenen Populationen von Brustkrebszellen als auch aus primärem Tumorgewebe von Brustkrebspatientinnen zur Verfügung. Darüber hinaus heben wir nachgeschaltete In-vitro - und In-vivo-Funktionstests hervor, einschließlich koloniebildender Assays, Mammosphären-Assays, 3D-Kulturmodelle und Tumor-Xenograft-Assays, die zur Beurteilung der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung humaner BCSCs aus einer heterogenen Population von Brustkrebszellen, entweder aus Zelllinien oder aus dissoziiertem Tumorgewebe. Für jede gegebene Zelllinie oder Gewebeprobe ist es entscheidend, eine einheitliche Einzelzellsuspension zu erzeugen, um BCSCs mit maximaler Reinheit zu isolieren, da die Kontamination von Nicht-BCSC-Populationen zu variablen zellulären Reaktionen führen könnte, insbesondere wenn das Studienziel darin besteht, die Wirksamkeit von Therapeutika...

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszell- und Gewebeproben sowie die in vitro und in vivo Assays, die zur Beurteilung des BCSC-Phänotyps und der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, Brustkrebsstammzellen mit maximaler Reinheit und Lebensfähigkeit für die Durchführung von In-vitro- und In-vivo-Assays zur funktionellen Charakterisierung zu isolieren. Isolierte Brustkrebsstammzellen können auch verwendet werden, um die molekularen Ereignisse aufzuklären, die die Tumorigenität und Metastasierung steuern, und um therapeutische Strategien zu entwickeln, die auf diese Zellen abzielen. Mit geringfügigen Modifikationen, die spezifisch für die interessierenden Zell- und Gewebetypen sind, kann diese Methode auch auf andere Systeme angewendet werden.Um eine einzelne Zellsuspension aus einer Zellkultur zu erzeugen, waschen Sie eine 80%ige konfluente Brustkrebszellkultur mit PBS und behandeln Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer geeigneten Zelldissoziationslösung. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie fünf Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Zelldissoziationslösung zu neutralisieren, und geben Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Suspendieren Sie das Pellet zum Zählen in fünf Millilitern PBS.Nach der Zählung zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie die Zellen dann einmalig 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ALDH-Substratpuffer. Um eine Einzelzellsuspension aus einer Gewebeprobe zu erzeugen, verwenden Sie chirurgische Klingen in einer Kreuztechnik, um das Tumorgewebe in etwa einen Millimeter große Stücke zu zerkleinern. Legen Sie die Stücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Dissoziationspuffer.Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm für eine 40-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler und sedimentieren Sie die verdauten Gewebestücke durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer Fünf-Milliliter-Pipette in fünf Millilitern Trypsin und inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Am Ende der Inkubation pipettieren Sie das Gewebe mehrmals kräftig, um einzelne Zellen freizusetzen, und fügen Sie so viel DMEM/F-12-Medium hinzu, dass das Gesamtvolumen im Röhrchen 25 Milliliter beträgt.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Displace DNAse und inkubieren Sie es fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Bringen Sie am Ende der Inkubation das Gesamtvolumen mit PBS auf 10 Milliliter. Mischen Sie die Zellen durch Pipettieren und führen Sie sie durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern frischem PBS zur Zählung. Um einen koloniebildenden Assay durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen nach dem Sortieren in vollständigem Medium und fügen Sie die entsprechende Anzahl von Brustkrebsstammzellen zu jedem der drei Röhrchen hinzu, die zwei Milliliter Medium pro Röhrchen enthalten, die einmal 10 für die zweite, zweimal 10 für die zweite oder fünfmal 10 für die zweite Zelle markiert sind. Pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um die Zellsuspension gründlich zu mischen, und plättieren Sie die Zellen in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte.Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu erhalten, und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator, bis Kolonien erscheinen. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation mit einem Milliliter PBS pro Vertiefung und färben Sie die Zellen 30 Sekunden lang mit 500 Mikrolitern 0,05%iger Kristallviolettlösung pro Vertiefung. Waschen Sie die Vertiefungen am Ende der Inkubation zweimal mit zwei Millilitern Wasser pro Vertiefung, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und zählen und notieren Sie die Gesamtzahl der Kolonien pro Vertiefung durch Lichtmikroskopie bei vier- oder zehnfacher Vergrößerung.Um einen Mammosphären-Assay durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen nach dem Sortieren in vollständigem Mammosphärenmedium und plättieren Sie die Zellen bei einer Sitzdichte von fünf mal 10 der zweiten Zellen pro Quadratzentimeter Fläche pro Vertiefung in einer 96-Well-Zellkulturplatte mit extrem geringer Bindung. Bevor Sie die Anzahl der Mammosphären pro Vertiefung durch Lichtmikroskopie zählen, legen Sie die Platte für fünf bis 10 Tage in den Zellkultur-Inkubator. Um ein 3D-Kulturmodell einzurichten, geben Sie vorsichtig 50 Mikroliter Basalmembranextrakt ohne Blasen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf, damit die Lösung polymerisieren kann.Fügen Sie nach 10 Minuten 100 Mikroliter PBS hinzu, um ein Austrocknen der Gelschicht zu vermeiden. Am Ende der Inkubation werden die sortierten Zellen auf fünf bis 50 mal 10 bis dritte Zellen pro 200 Mikroliter 3D-Kulturmedium suspendiert und das PBS in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte durch 200 Mikroliter Medien ersetzt, die Zellen enthalten. Legen Sie die Platte dann für 10 bis 14 Tage in den Zellkultur-Inkubator, bevor Sie die Kulturen auf Organoidbildung untersuchen.Menschliche Brustkrebszellen, die eine erhöhte enzymatische Aktivität von ALDH aufweisen, exprimieren hohe CD44-Spiegel und niedrige bis negative CD24-Expressionswerte und können als Brustkrebsstammzellen klassifiziert werden. Der Anteil an Brustkrebsstammzellen in der Massenpopulation kann zwischen Zelllinien oder Patienten variieren und hängt oft vom Krankheitsstadium ab, wobei aggressiverer Brustkrebs in der Regel einen höheren Anteil an Brustkrebsstammzellen aufweist. Die Fähigkeit einer einzelnen Brustkrebszelle, sich selbst zu erneuern und Kolonien von 50 Zellen zu erzeugen, kann durch koloniebildende Assays beurteilt werden.Die Fähigkeit von Brustkrebsstammzellen, sich unter verankerungsunabhängigen experimentellen Bedingungen selbst zu erneuern, kann mit Mammosphären-Assays beurteilt werden. Die Kultivierung von Brustkrebszellen und Basalmembranextrakt ermöglicht es Brustkrebsstammzellen, 3D-Strukturen zu bilden, die sich unter In-vivo-Bedingungen rekapitulieren. Darüber hinaus können in vivo Maus-Xenotransplantatmodelle verwendet werden, um die Unterschiede im Wachstum, in der Selbsterneuerung, der Differenzierung und/oder der tumorinitiierenden Fähigkeit von Brustkrebsstammzellen im Vergleich zu Nicht-Brustkrebsstammzellen oder Massenzellpopulationen zu verstehen.Nach diesem Verfahren können die isolierten Brustkrebsstammzellen in transkriptomischen, kinomischen und metabolomischen Studien verwendet werden. Diese Methode bietet Forschern die Möglichkeit, die Rolle von Brustkrebsstammzellen bei der Tumorentstehung, Metastasierung, Rezidiv und Therapieresistenz zu untersuchen.

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Research

Forschung

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Cancer Research

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