Name: Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie zwei Methoden zur genauen Follikelzählung in fixierten Maus-Ovarien: Stereologie und direkte Zählung. Diese Techniken unterstützen reproduzierbare Forschung in der Ovarbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde durch die Operational Infrastructure Support der viktorianischen Staatsregierung und die australische Regierung NHMRC IRIISS ermöglicht und durch finanzielle Unterstützung des National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) und des Australian Research Council (KJH #FT190100265) unterstützt. Die Autoren möchten die technische Unterstützung der Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform und Monash Micro Imaging Facility würdigen.

Eierstöcke wurden von weiblichen C57BL6J-Mäusen gesammelt. Alle tierischen Verfahren und Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Australischen Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und von der Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee genehmigt.
ANMERKUNG: Ein Chemotherapeutikum, das nachweislich primordiale Follikeloozyten erschöpft, wie mit Stereologie11 und direktenZählungen 12bestimmt,13 wurde in diesem Bericht verwendet, um die beiden Zählmethoden bei demselben Tier zu vergleichen. Weibliche, 8 Wochen alte (junge Erwachsene) Mäuse wurden vor einer einzigen intraperitonealen Injektion von 75 mg/kg/Körpergewicht von Cyclophosphamid oder einer sainen Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) gewogen. Es hat sich gezeigt, dass diese Dosis eine Erschöpfung der Urfollikel von ca. 50 % verursacht, aber nicht berichtet, dass sie Morbidität oder Mortalität bei Mäusen verursacht14. Die Eierstöcke wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet. Ein Eierstock von jedem Tier wurde in 10% (v/v) neutral gepufferte Formalin-Lösung für 24 Stunden fixiert, und der andere in Bouins Lösung für 24 Stunden fixiert. Das Gewebe wurde dann entweder in Glykolmethacrylatharz eingebettet und seriell auf 20 m oder in Paraffin und seriell auf 5 m geschnitten. Alle Gewebe wurden mit Periodensäure Schiff und Hämatoxylin gefärbt.
1. Histologische Präparation: Fixierung, Verarbeitung, Einbettung und Schnitt von Maus-Ovarien
<ol><li>Sezieren Sie die Eierstöcke der Maus, indem Sie das Eileiter und das gesamte umgebende Fett schneiden, ohne den Eierstock selbst zu beschädigen oder zu schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf für diesen Schritt ein Sezieren von Mikroskop und eine feine Klinge (Abbildung 1A).</li>
	<li>Beheben Sie Gewebe sofort, indem Sie es in ein kleines, beschriftetes Rohr legen, das entweder Bouins fixative (Stereologie) oder formalin fixative (direkte Zählungen) für 24 Stunden enthält(Abbildung 1B), bevor Gewebe in 70 % Ethanol übertragen werden. HINWEIS: Die Follikelmorphologie wird am besten in Bouins festem Eierstockgewebe konserviert und in Glykolmethacrylatharz eingebettet (Abbildung 2).</li>
	<li>Verarbeiten Sie ganze feste Eierstöcke und betten Sie dann in Glykolmethacrylatharz für die Stereologie (Ergänzende Akte 1), oder Paraffinwachs für direkte Zählungen mit einem Standard histologisches Protokoll. VORSICHT: Harz ist giftig, so stellen Sie sicher, dass alle Gewebeverarbeitungsschritte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden und Handschuhe zu jeder Zeit getragen werden.</li>
	<li>Verwenden Sie ein spezielles Harzmethacrylat-Mikrotom (Abbildung 1C), das mit einem Glasmesser (Abbildung 1D) ausgestattet ist, um dicke Glycolmethacrylatharzabschnitte (z. B. 20 m) erschöpfend zu schneiden. Sammeln Sie die Abschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden3. Abschnitt) auf Glasmikroskop-Dias für die Stereologie.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Standard-Mikrotom, um dünne Paraffinabschnitte (z. B. 4-6 m) zu schneiden. Sammeln Sie Gewebeabschnitte in regelmäßigen Abständen (z. B. jeden9. Abschnitt) auf einem Glasmikroskopschlitten für direkte Follikelzahlen.</li>
	<li>Die Dias mit periodischer Säure Schiff und Hämatoxylin(Ergänzungsdatei 2) beflecken</li>
	<li>Coverslip mit Standard-DPX für Paraffinprofile oder dickes DPX für Glycolmethacrylatharzabschnitte (Abbildung 1E). VORSICHT: Glycolmethacrylatharz DPX ist gefährlich, also führen Sie diesen Schritt in, um Dunstabzugshaube zu verwenden. HINWEIS: Glycolmethacrylatharz DPX ist extrem zähflüssig. Der Glasdeckel muss fest mit einem Spachtel nach unten gedrückt werden, um sicherzustellen, dass der DPX gleichmäßig und dünn dispergiert ist und unter dem Deckschein keine Luftblasen vorhanden sind (Abbildung 1F).</li>
</ol>2. Stereologische Schätzung der urzeitlichen Follikelzahl mit dem optischen Fractionator
<ol><li>Schalten Sie den Computer, die Multi-Control-Einheit, die Kamera und die Lichtquelle innerhalb des stereologischen Setups ein und stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf eine geringe Vergrößerung (z. B. 10x).</li>
	<li>Öffnen Sie die Stereologie-Software.</li>
	<li>Setzen Sie den ersten Schlitten sicher auf die Mikroskopstufe.</li>
	<li>Stellen Sie die Lichtbelichtung ein, indem Sie im Bedienfeld "Kameraeinstellungen" (Ergänzende Abbildung 1A ) unter Automatisch unter Belichtung überprüfen. Alternativ können Sie die Lichtbelichtung manuell einstellen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Joystick, um die erste Gewebeprobe zu lokalisieren und die Probe in den Fokus zu rücken.</li>
	<li>Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie entweder auf Weitere Einstellungen (unten rechts im Bedienfeld Kameraeinstellungen) klicken und dann auf Weißabgleich und auf Automatisch klicken (Ergänzende Abbildung 1B). Alternativ können Sie auf die Schaltfläche Weißabgleich neben der Schaltfläche Weitere Einstellungen (oder Bereich in weiteren Einstellungen auswählen ) klicken, um den Weißabgleich manuell festzulegen, indem Sie einen weißen Bereich im Abschnitt auswählen.</li>
	<li>Gehen Sie zum Dropdown-Menü "Sonden" und klicken Sie auf Optical Fractionator Workflow. Klicken Sie dann auf Neues Projekt starten und klicken Sie auf OK.
	<ol>
<li>Wenn eine vorhandene Sampling-Konfiguration gespeichert wurde, klicken Sie unter Sampling-Parameter auf Ja | ... und wählen Sie die gewünschte Sampling-Konfiguration aus.</li>
		<li>Wenn dies nicht der Fall ist, klicken Sie auf Nein, und geben Sie die Informationen zum seriellen Abschnitt (Ergänzende Abbildung 1C) manuell ein, und definieren Sie die Prüfpunktkonfiguration in Schritt 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Niedrige Vergrößerung ein und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü die 10-fache Vergrößerung aus.</li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, und verfolgen Sie dann den gesamten Eierstockbereich – beginnen Sie mit einem links klickenden Abschnitt und klicken Sie am Ende mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kontur schließen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Weiter, stellen Sie das Mikroskop auf Hohe Vergrößerung und wählen Sie 100x Ölvergrößerung aus dem Dropdown-Menü.</li>
	<li>Legen Sie einen Tropfen Öl auf den Gewebebereich auf dem Dia und bewegen Sie das Mikroskopobjektiv auf die 100-fache Vergrößerung.</li>
	<li>Passen Sie die Lichtbelichtung an (wie in Schritt 2.4) und klicken Sie auf Weiter.</li>
	<li>Richten Sie die Sampling-Parameter ein, um die Prüfpunktkonfiguration zu definieren. Hier wurde der Zählrahmen auf 47,5 x 47,5 m (2.256,25 m2) und die Schrittlänge auf 100 x 100 m (10.000 m2) eingestellt (Zusatzabbildung 2). Nachdem die Samplingparameter festgelegt wurden, speichern Sie die Vorlage und öffnen Sie sie während der nachfolgenden Analysesitzungen unter Schritt 2.7 erneut.</li>
	<li>Klicken Sie auf Counting starten (Zusatzabbildung 1D). Konzentrieren Sie sich auf den Oberen Rand des Beispiels, klicken Sie auf OK, und beginnen Sie mit der Zählung.</li>
	<li>Verwenden Sie den Fokussierknopf, um sich durch die 10 m Probentiefe zu bewegen und alle Urfollikel zu zählen, deren Eizellenkern in den Fokus rückt. Klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Bereich zu wechseln.<ol>
<li>Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Ur-Zellen, wenn die Oozyte von Plattenzellen (abgeflachten) Granulosazellen umgeben ist, aber keine quakodenalen Granulosazellen (Abbildung 2A). ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen(Abbildung 2B) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2C). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.</li>
		<li>Zählen Sie nur Follikel, in denen der Eizellkern sichtbar ist. Der Oozytenkern muss innerhalb des Zählrahmens erscheinen oder die grünen Einschlusslinien des Zählrahmens berühren (Zusatzabbildung 1E,F).</li>
		<li>Wenn der Oozytenkern außerhalb des Zählrahmens liegt (Zusatzabbildung 1G) oder die roten Ausschlusslinien des Zählrahmens berührt, zählen Sie diesen Follikel nicht.</li>
		<li>Bei der Beurteilung des Urfollikelabbaus als Reaktion auf eine exogene Chemikalie (z. B. Chemotherapie) stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat. Oft wird der Follikeltod durch Beleidigungen wie Chemotherapie induziert, und die Quantifizierung der atretischen Follikel sollte separat erfolgen, um zwischen gesunden und atretischen Follikel zu unterscheiden, da nur gesunde Follikel die Ovarialreserve15umfassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie nach Abschluss der Zählung in diesem Abschnitt eine der folgenden Schritte aus:<ol>
<li>Klicken Sie auf Neuer Abschnitt hinzufügen, und kehren Sie dann zu Schritt 2.3 zurück, um den nächsten Abschnitt für die Zählung einzurichten.</li>
		<li>Klicken Sie auf Ich habe die Zählung beendet, um die Sitzung zu beenden. Setzen Sie das Objektiv auf 10x zurück, beenden Sie die Stereologie-Software und schalten Sie die Lichtquelle, Kamera, Multi-Control-Einheit und Computer aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Beziehen Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt aus dem gesamten Eierstock, dann mit einer Tabelle, verwenden Sie die Gleichung unten, um den endgültigen Wert von jedem replizierenden Tier (N)4zu erhalten. <img alt="N=Q(1/f1)(1/f2)(1/f3) Gleichung; Design optischer Systeme; Verhältnisse der Objektivbrennweite" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">Wo: N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks. Q = Rohe Urfollikelzahl. f1 = Abtastintervall. Jederdritte Abschnitt wurde so abgetastet. <img alt="Bruchvereinfachungsgleichung, algebraischer Ausdruck, mathematische Formel." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> f2 = Beziehung zwischen Zählrahmen (Beispielfläche) und Stepper, berechnet als <img alt="Gleichung für die Probenfläche über der Schrittfläche; Symbol zur Berechnung des Verhältnisses für Bildungszwecke." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"> . Da die Probenfläche 2256 m2 (47,5 x 47,5 m) betrug und die Schrittfläche 10000 m2 (100 x 100 m) <img alt="Berechnung der Optik, Brennweitenformel, Diagramm, f2=2256/10000, 1/f2=10000/2256." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> betrug. f3 = Anteil des Eierstockschnitts. Da 10 m des 20-mm-Abschnitts abgetastet wurden, <img alt="Optik-Refraktionsgleichung, mathematische Formel auf Diagramm zur Berechnung der Brennweite, f3=10/20." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> . Daher. <img alt="N=Q(3/1)(10000/2256)(20/10), Formel zur Berechnung der Korngröße, technische Analyse." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> ANMERKUNG: Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Prinzipien der stereologischen Analysen mit einer viel zitierten Stereologie-Software (Tabelle der Materialien)angewendet werden können; es steht jedoch eine andere stereologische Software zur Verfügung. Die Prinzipien, die bei stereologischen Analysen von Eierstockfollikel angewendet werden, sind die gleichen, unabhängig von der Software, die zum Einrichten der Parameter verwendet wird. Die Stereologie ist am genauesten, wenn 100 oder mehr Objekte in einem erwachsenen Maus-Ovarial4gezählt werden, da dies einen Fehlerkoeffizienten für die Schätzung unter 10%16ergibt. Die hier beschriebenen Stichprobenparameter wurden optimiert, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Objekte (d. h. Ur-, Übergangs- und Primärfollikel) in der Kontrolle der adulten Wild-Typ C57BL6J-Eierstöcke gezählt werden können. Eine Pilotstudie mit einem kleinen Stichprobenumfang kann durchgeführt werden, um die optimalen Stichprobenparameter zu ermitteln, wie das Intervall und die Anzahl der zu analysierenden Abschnitte und die Anzahl der optischen Dissektoren innerhalb der stichprobenartig untersuchten Abschnitte17.</li>
</ol>3. Schätzung der Urfollikelzahl durch direkte Ovarialfollikelzahl
<ol><li>Platzieren Sie den Mikroskopschlitten sicher unter einem Standard-Lichtmikroskop und führen Sie direkte Zählungen durch, um eine rohe Urfollikelzahl zu erhalten.<ol>
<li>Klassifizieren Sie Follikel als Ur-Granulosa-Zellen, aber keine quaroilen Granulosazellen (Abbildung 2D). ANMERKUNG: Primordialfollikel unterscheiden sich von Zwischen-/Übergangsfollikel, die eine Kombination von quatolen und Plattenepithelzellen (Abbildung 2E) und Primärfollikel umfassen, die überwiegend von quaderalen Granulosazellen umgeben sind (Abbildung 2F). Diese Follikelklassen sollten separat quantifiziert werden.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle gezählten Follikel gesund sind und somit eine normale Morphologie haben (Abbildung 2). Zählen Sie alle abnormalen oder atretischen Follikel separat, da nur gesunde Follikel die Eierstockreserve umfassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ können Sie mehrere oder genähte Hochleistungsphotomikroskope (z. B. 20x) des gesamten Eierstockgewebeabschnitts verwenden, um Zählungen durchzuführen, indem Sie die Bilddatei(en) öffnen. Dies kann manuell oder mit einem automatisierten Diascanner erfolgen.</li>
	<li>Erhalten Sie die Summe Rohfollikelzahl (Q) aus jedem Gewebeabschnitt, der im vorgegebenen Intervall aus dem gesamten Eierstock entnommen wird. Multiplizieren Sie diese Zahl mit der Umkehrung des Stichprobenbruchs, um den Endwert für jedes Replizierungstier (N) zu erhalten, wobei die folgende Gleichung verwendet wird. <img alt="Gleichung zur Berechnung von N mit Q und Kehrwert von f₁; Analytisches Berechnungskonzept." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 7">Wo: N = Gesamtgeschätzte Anzahl der Follikel innerhalb des Eierstocks. Q = Rohfollikelzahl (von jedem einzelnen Typ, separat berechnet). f1 = Abtastintervall. Jeder9. Abschnitt wurde so <img alt="Gleichung, die das mathematische Prinzip der reziproken Brüche veranschaulicht, dargestellt im Formelformat." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 8"> abgetastet. Daher. <img alt="Statische Gleichgewichtsgleichung N=Q×(9/1), mathematische Formel." src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 9"></li>
</ol>

<ol><li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li>
<li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments%2C+environmental+toxins+and+maternal+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li>
<li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Mullerian+hormone%3A+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li>
<li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology%3A+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li>
<li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li>
<li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Reproductive+Biomedicine+%28Yazd%29%22%5BJournal%5D)">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+image+analysis+and+its+solution%3A+unbiased+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li>
<li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1%2C+2%2C+3%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).</li>
<li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618(2018).</li>
<li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li>
<li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor%2C+olaparib%2C+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice%3A+implications+for+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li>
<li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide%3A+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li>
<li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).</li>
<li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737(2017).</li>
<li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111(2015).</li>
<li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755(2015).</li>
<li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516(2018).</li>
<li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accurate%2C+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li>
<li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries%3A+symmetry+and+relationship+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li>
<li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number%3A+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li>
<li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+%28STRAW%29+staging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li>
<li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+reproductive+aging%3A+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li>
<li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499(2018).</li>
<li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li>
<li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieser Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Goldstandard-Technik zur Aufzählung von Maus-Urfollikel, Stereologie und die am häufigsten verwendete Methode der direkten Follikelzählung. Die Chemotherapie wurde verwendet, um die Ergebnisse dieser beiden verschiedenen Methoden innerhalb des linken und rechten Eierstocks desselben Tieres zu vergleichen und zu vergleichen. Beide Methoden zeigten eine hohe variabilile Zwischentiervariabilität bei den ursprünglichen Follikelzahlen. Eine signifikante Erschöpf...

Die unreifen, meiotisch verhafteten Eizellen, die in Urfollikel im Eierstock gelagert werden, sind die Lagereinheit für die weibliche Keimbahn und bilden die lebenslange Eierstockreserve eines Individuums. Primordial Follikel Zahlen sinken natürlich mit dem Alter1, oder alternativ, kann vorzeitig nach der Exposition gegenüber exogenen Chemikalien, einschließlich einiger Pharmazeutika und Umweltgifte in Luft, Lebensmittel und Wasser2. Da die ursprüngliche Follikelzahl endlich ist, bestimmen die Menge und Qualität der Follikel innerhalb des Eierstocks weitgehend die weibliche Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen. Daher ist eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahl bei Frauen für die Bewertung der außerhalb des Ziels von exogenen Beleidigungen auf die Eierstockreserve wichtigen Bedeutung.
Bei Frauen ist eine Analyse des gesamten Eierstocks im Allgemeinen nicht möglich, so dass nicht-invasive Ersatzmaßnahmen der Ovarialreserve in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden müssen. Das Anti-M-Llerian-Hormon (AMH) ist der am weitesten verbreitete Ersatz-Biomarker klinisch3. Serum AMH-Spiegel werden oft bei Frauen im fortgeschrittenen mütterlichen Alter oder vor und nach der Krebsbehandlung, wie Chemotherapie, gemessen. AMH wird jedoch durch den Anbau von Follikel und nicht durch Urfollikel erzeugt, und daher informieren serumspiegel nicht über die absolute Urfollikelzahl.
Da es keine Methoden gibt, um die Primordialzahl bei Frauen in situgenau zu bestimmen, bleibt die Zählung der Eierstockfollikel in Kleintiermodellen wie Nagetieren ein wesentliches Forschungsinstrument, um zu beurteilen, inwieweit exogene Beleidigungen Auswirkungen auf die Urfollikel und damit auf die Fruchtbarkeit haben. Leider sind die Berichte in der gesamten Literatur über urfolgische Zahlen in Nagetiermodellen sehr variabel4. Ein Hauptgrund dafür sind weithin berichtete technische Unterschiede in der eingesetzten Zählmethode. Vor allem gibt es zwei verschiedene Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, um Urfollikel bei Mäusen aufzuzählen. Dazu gehören die Stereologie, die die optische Dissektormethode des Fraktionators verwendet, und die Anzahl der direkten Follikel.
Die Stereologie wird weithin als Goldstandard angesehen, da sie systematische einheitliche Stichproben5verwendet, was sie zur genauesten Methode zur Quantifizierung der urtypischen Follikelzahl in der ganzen Maus oder Ratteneierstöcke4,6,7macht. Die Stereologie ist unvoreingenommen, da sie die dreidimensionale Struktur desObjektsvon Interesse 8 berücksichtigt. Mit Hilfe einer optischen Dissektor-/Fraktionatormethode werden drei Stichprobenebenen angewendet, um Urfollikel mit dicken Gewebeabschnitten (z. B. 20 m) innerhalb eines bekannten Bruchteils des gesamten Mausovarials zu quantifizieren. Zunächst wird das Stichprobenintervall (z. B. jederdritte Abschnitt) zu einem zufälligen Start gewählt (Sampling-Fraktion 1, f1)4. Die Abschnitte werden dann systematisch und einheitlich von diesem Punkt an durch den gesamten Eierstock abgetastet. Dann wird ein unvoreingenommener Zählrahmen über dem Eierstockbereich überlagert und nach und nach entlang eines definierten, randomisierten Zählrasters bewegt (Sampling-Fraktion 2, f2)8. Schließlich wird ein bekannter Bruchteil der Schnittdicke optisch beprobt (z.B. 10 m) und Follikel in diesem Bereich gezählt (Probenahmefraktion 3, f3)4. Die rohe Follikelzahl wird mit der Umkehrung dieser Stichprobenfraktionen multipliziert, um den Endwert zu erhalten. Diese Methode erfordert eine fachkundige Schulung und Ausrüstung, einschließlich eines Mikroskops mit einer motorisierten Bühne, die von stereologischer Software angetrieben wird. Gewebe sollten in einem speziellen Bouin-Fixativ konserviert und in Glycolmethacrylatharz eingebettet werden, damit dicke Gewebeabschnitte mit einem Glycolmethacrylatharz-Mikrotom mit einem Glasmesser geschnitten werden können. Diese Methode wurde entwickelt, um Gewebeschrumpfung und Verformung zu berücksichtigen, um die dreidimensionale morphologische Struktur des Eierstocks und der Follikel am besten zu erhalten9.
Die direkte Follikelzählung ist die am häufigsten verwendete Methode zum Zählen von Follikel10. Es können häufigere Fixative (d. h. Formalin) verwendet werden, gefolgt von Paraffinwachseinbettung und erschöpfender serieller Schnitte mit einem Standardmikrotome mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m. Follikel werden systematisch im gesamten Gewebeabschnitt in einem definierten Intervall gezählt und dann mit der Umkehrung des Probenahmeintervalls multipliziert, um die Gesamtfollikelschätzung zu erhalten. Diese Methode ist schnell und einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Trotz dieser Vorteile fehlt es der direkten Follikelzählung jedoch an Genauigkeit und strengen Zählparametern der Stereologie, was sie anfälliger für Voreingenommenheit der Prüfer macht. Darüber hinaus können Gewebe während der Verarbeitung schrumpfen und verformt werden, wodurch die Integrität und Morphologie des Eierstocks gestört wird und somit die Follikelklassifizierung und -quantifizierung erschwert wird.
Ziel dieses Artikels ist es, zwei häufig verwendete Methoden zur quantitativen Bewertung der Urfollikelzahl in den Eierstöcken der Maus zu beschreiben: Stereologie und direkte Follikelzählung. Wir werden detaillierte Protokolle für diese beiden Methoden bereitstellen und einige ihrer Stärken und Schwächen aufzeigen, um die Reproduzierbarkeit in unserem Bereich zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung über die am besten geeignete Zählmethode für ihre Studien zu treffen.

<table><tbody><tr><td>1-Butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Acid Alkohol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s Fixiermittel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Pikrinsäure 0,9% (w/v), Formaldehyd 9% (v/v), Essigsäure 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Cyclophosphamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalat Polystyrol Xylol (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>Ethanol 100%</td></tr><tr><td>Micro Feather Augenskalpell mit Aluminiumgriff</td><td>Designs for Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Federklinge zum Sezieren (siehe Abbildung 1)</td></tr><tr><td>Formalin-Fixiermittel</td><td>Australian Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Glycomethacrylat-Harz RM2165 Mikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glycolmethacrylat DPX</td><td>*made in house</td><td></td><td>*Mischen Sie 1,5 l Xylol; 800 g Polystyrol-Pellets; 100 ml Dibutylphthalat für 3 Wochen</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s Hämatoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX50 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>Hellfeldmikroskop mit 10x Trocken- & 100x Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur 1,3)</td></tr><tr><td>Olympus Immersionsöl Typ-F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 Lichtquelle</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinwachs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Periodische Säure</td><td>Trajan</td><td>#PERI1%</td><td>Periodische Säure 1%</td></tr><tr><td>Rotationsmikrotom CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Wird zum Schneiden von Paraffinschnitten</td></tr><tr><td>verwendet Schiff' s Reagenz</td><td>Trajan</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>Scott's Leitungswasser</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>Kaliumcarbonat, Magnesiumsulfat, Wasser</td></tr><tr><td>StereoInvestigator Stereologisches System</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Enthält StereoInvestigator Software, Multi-Steuereinheit, automatischen Tisch und Joystick</td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 Stk.</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Einbettsystem aus Kunststoff</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 gelb</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 mL</td></tr></tbody></table>

genaue follikel-aufzählung in adulten maus-ovarien

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexuell reproduzierende weibliche Säugetiere werden mit ihrer gesamten lebensleinen Versorgung mit Eizellen geboren. Unreife, stille Eizellen finden sich in den Urfollikel, der Speichereinheit der weiblichen Keimbahn. Sie sind nicht erneuerbar, so dass ihre Zahl bei der Geburt und anschließende Verlustrate weitgehend die weibliche fruchtbare Lebensdauer diktiert. Eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahlen bei Frauen und Tieren ist für die Bestimmung der Auswirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen auf die Eierstockreserve von entscheidender Bedeutung. Es ist auch notwendig, die Notwendigkeit und den Erfolg bestehender und neu entstehender Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit zu bewerten. Derzeit gibt es keine Methoden, um die Anzahl der Urfollikel, die die Eierstockreserve bei Frauen umfassen, genau zu messen. Darüber hinaus ist es oft nicht möglich, Eierstockgewebe von großen Tieren oder gefährdeten Arten für Experimente zu erhalten. So sind Mäuse zu einem wesentlichen Modell für solche Studien geworden, und die Fähigkeit, urfolale Follikelzahlen in ganzen Eierstöcken der Maus zu bewerten, ist ein entscheidendes Werkzeug. Berichte über absolute Follikelzahlen in den Eierstöcken der Maus in der Literatur sind jedoch sehr variabel, was es schwierig macht, Daten zu vergleichen und/oder zu replizieren. Dies ist auf eine Reihe von Faktoren wie Belastung, Alter, Behandlungsgruppen sowie technische Unterschiede in den methoden zur Zählung zurückzuführen. In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung histologischer Abschnitte und das Zählen von Urfollikel in Denstöcken der Maus mit zwei verschiedenen Methoden bereit: [1] Stereologie, die sich auf die Fraktionator-/optische Dissektortechnik stützt; und [2] die direkte Zähltechnik. Einige der wichtigsten Vor- und Nachteile jeder Methode werden hervorgehoben, so dass die Reproduzierbarkeit vor Ort verbessert werden kann und die Forscher die am besten geeignete Methode für ihre Studien auswählen können.

Es wurde ein gut charakterisiertes Modell der Follikeldepletion verwendet, bei dem jungen erwachsenen weiblichen Mäusen eine Einzeldosis Cyclophosphamid-Chemotherapie oder kochische Fahrzeugkontrolle (n=5/Gruppe) verabreicht wurde und beide Eierstöcke nach 48 Stunden von jedem Tier geerntet wurden. Für jede der beiden Methoden wurde ein Eierstock pro Tier hergestellt, wie in Schritt 1 beschrieben: Stereologie oder direkte Zählung. Der linke und rechte Eierstock jedes Tieres wurde jeder Gruppe zufällig zugeordnet. Diese D...

Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Wir hoffen, dass diese detaillierten Protokolle dazu beitragen werden, die Reproduzierbarkeit in unserem Fachgebiet zu verbessern und es den Forschern gleichzeitig zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung bei der Auswahl der Abrechnungsmethode für ihre Studien zu treffen. Da die Stereologie mehrere Sampling-Parameter verwendet, ist sie sehr empfindlich und genau. Direkte Zählungen sind jedoch schneller und einfacher und können an Proben durchgeführt werden, die mit histologischen Standardtechniken vorbereitet wurden.Stereologie wird in Studien zur Eierstockbiologie verwendet, um die Auswirkungen von Giftstoffen auf die Eierstockreserven zu bewerten. Es kann auch in den Lebenswissenschaften zur Erforschung der Niere und des Gehirns angewendet werden. Um sich mit der Morphologie der Follikel vertraut zu machen, ist Erfahrung erforderlich.Die Verwendung früherer Studien zur Definition der Morphologie zusammen mit der Festlegung standardisierter Klassifikationskriterien kann zur Konsistenz beitragen. Um die Anzahl der primordialen Follikel durch Stereologie mit einem optischen Fraktionator zu schätzen, schalten Sie den Computer, die Multi-Steuereinheit, die Kamera und die Lichtquell

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die nicht-invasive Beurteilung der Eizelle Entwicklungskompetenz während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle zur Metaphase II Stufe durchgeführt. Diese Methode verbindet Zeitraffer Bildgebung mit Particle Image Velocimetry (PIV) und neuronale Netzwerkanalysen.

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine genaue, kostengünstige, schnelle und ungiftige Methode zur Bestimmung des Geschlechts eines Schweineembryos am Tag 30 mittels PCR-Methode nach dem Mahlen eines Embryos zu Pulver ohne Phenol-Chloroform-Extraktion und DNA-Säulenreinigung.

Präzise und Phenol Freie DNA Geschlechtsbestimmung von Tag 30 Schweineembryonen mittels PCR

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Lernen Sie zwei Methoden zur genauen Follikelzählung in fixierten Maus-Ovarien: Stereologie und direkte Zählung. Diese Techniken unterstützen reproduzierbare Forschung in der Ovarbiologie.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Weitere Videos entdecken