Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen
22. Januar 2021
Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.
Diese neue Methode der Sphäroidkulturen kann verwendet werden, um die Tumorigenität zu untersuchen, um das Vorhandensein verschiedener Populationen von Krebsstammzellen zu analysieren und kann auch schön auf durch High Put Screen für neue Medikamente angewendet werden. Dies ist ein robustes und sich wiederholendes kultiviertes System zur Erzeugung einer großen Anzahl homogener Sphäroide. Darüber hinaus können diese Sphäroide verwendet werden, um krebserende Stammzellen zu untersuchen.
Diese Methode wurde eingerichtet, um chronische Krebsbiologie zu studieren, aber es kann leicht eingerichtet werden, um andere Krebsarten zu studieren, indem die 3D-Kulturbedingungen geändert werden. Achten Sie darauf, auf Blasen im Medium zu achten, die Platte während der Sphäroidbildung nicht zu sehr zu bewegen und vorsichtig zu sein, wenn Sie die Sphäroide in das Sieb ernten. Beginnen Sie mit der Vorbehandlung der Brunnen einer 24 WellPlatte mit 500 Mikroliter Anti-Adherence Rinsing Solution pro Brunnen.
Nach ein paar Sekunden zentrifugieren Sie die Platte im Schwingen-Schaufelrotor und spülen Sie jeden Brunnen mit 2 Milliliter warmes Basalmedium. Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Blasen vollständig aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn keine Blasen beobachtet werden, spülen Sie die Brunnen erneut, bevor Sie jeweils einen Milliliter warme DMEM-Kellermembranmatrix zu jedem Brunnen hinzufügen.
Um die Sphäroidbildung zu induzieren, sehen Sie die gewünschte Konzentration von Caco-2-Zellen in einer 2D-Monoschicht in einer 10-Zentimeter-Schale in DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Antibiotika. Für die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Atmosphäre. Wenn eine Konvexität von 80 % erreicht ist, waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Kultur mit zwei Millilitern Trypsin-EDTA zwei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid behandeln.
Wenn die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit vier Millilitern vollständiger DMEM. Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Palette im entsprechenden Volumen des DMEM-Kellermembranmatrixmediums wieder aufsetzen, um die gewünschte Konzentration der Zellen in einem Milliliter Medium pro Brunnen zu erreichen. Fügen Sie jedem Brunnen der Prepaid 24 Well Platte einen Milliliter Zellen hinzu, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter DMEM-Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen.
Nach der Aussaat zentrieren Sie die Platte sofort und verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig über die Mikrobrunnen verteilt wurden. Dann legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für 48 Stunden, ohne die Zellen zu stören. Um die Sphäroide am Ende der Inkubation zu ernten, verwenden Sie eine serologische Pipette und die Hälfte des Überstandes in jedem Brunnen, um die Sphäroide sanft aus ihren Mikrobrunnen zu entfernen.
Wenn alle Sphäroide abgetrennt sind, verwenden Sie die Pipette, um die 3D-Kulturen von jedem Brunnen vorsichtig auf ein 37 Mikron reversibles Sieb auf einem 15 Milliliter konischen Rohr zu übertragen. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit einem Milliliter vorgewärmten Basalmedium pro Wäsche, um alle verbleibenden Sphäroide zu sammeln und fügen Sie diese zusätzlichen Sphäroide zum Sieb hinzu. Nach der letzten Wäsche überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass alle Sphäroide aus den Mikrobrunnen entfernt wurden.
Dann das Sieb über ein neues 15-Milliliter-Rohr umkehren und den Boden des Siebs mit frischem DMEM-Kellermembran-Matrixmedium waschen, um die Sphäroide in das Rohr zu sammeln. Sphäroide steigen aus 500 Zellen und weisen im Laufe der Zeit den homogensten Größenzuwachs auf. Mit 500 und 600 Zellen pro Sphäroid bestimmen, um die optimale Anzahl von Zellen zu sein, unter denen gutes Wachstum und geringe Variabilität erreicht werden können.
Die Zugabe von Kellermembranmatrix verbessert das Sphäroidwachstum und die Homogenität. In der Langzeitkultur erscheinen die Zellen an Tag drei als dichte Multi-Layer. Während abgeflachte Zellen, die in Monoschichten angeordnet sind, an Tag 10 deutlich sichtbar sind.
Interessanterweise erscheint ein Lumen innerhalb der Sphäroide ab dem fünften Tag. Darüber hinaus wird an den Tagen fünf und sieben, die am Tag 10 abnehmen, ein deutlicher Anstieg der proliferierenden zellnuklearen Antigen-positiven Zellen beobachtet. Überraschenderweise wird der aktivierte Caspace 3 nur an den Tagen drei und fünf in sehr wenigen Zellen beobachtet.
Während hohe Konzentrationen der Beta-Catenin-Expression zu jedem Zeitpunkt beobachtet werden. Das Potenzial der Sphäroide, sich in Anterositen zu differenzieren, wird durch ihre Alkaline Phosphatase und die solute Trägerfamilie 2A5 mRNA-Expression belegt. Darüber hinaus exprimieren diese Sphäroide typische Krebsstammzellmarker und reagieren auf Kombinations-Chemotherapie-Behandlungen, die regelmäßig an Darmkrebspatienten verabreicht werden.
Sphäroide bestehen also aus verschiedenen Zellpopulationen. Sie können dann schön verwendet werden, um zellspezifische Reaktionen auf Reize wie Refrakszen und schließlich für Arzneimittelreaktionen zu analysieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt ein robustes Kultursystem zur Erzeugung dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen vor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Biologie von Krebsstammzellen und ihrer Reaktion auf eine Chemotherapie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis von Krebsstammzellen ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien.
- 3D-Sphäroidkulturen imitieren die Tumorumgebung in vivo.
- Diese Methode kann für verschiedene Krebsarten angepasst werden.
- Robustheit und Reproduzierbarkeit sind entscheidend für die experimentelle Validität.
Zweck der Studie
- Etablierung einer zuverlässigen Methode zur Sphäroidkultur aus Caco2-Zellen.
- Untersuchung der Tumorigenität und der Populationen von Krebsstammzellen.
- Ermöglichung eines Hochdurchsatz-Screenings für neue Wirkstoffe.
Verwendete Methoden
- Vorbehandlung der Vertiefungen mit Anti-Adhärenz-Spüllösung.
- Sorgfältige Handhabung, um Blasenbildung während der Sphäroidbildung zu vermeiden.
- Ernte von Sphäroiden mithilfe eines Siebs.
- Überwachung der Kulturbedingungen für optimales Wachstum.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung von gleichmäßig großen Sphäroiden.
- Nachgewiesene Anwendbarkeit zur Untersuchung von Krebsstammzellen.
- Potenzial für Anwendungen in der Wirkstoffscreening.
- Anpassungsfähigkeit an andere Krebsarten durch Modifikation der Kulturbedingungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein neues Werkzeug für die Krebsforschung bereit.
- Sie verbessert das Verständnis der Dynamik von Krebsstammzellen.
- Zukünftige Studien können dieses System für die Entwicklung von Therapien nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses 3D-Sphäroidmodell adressiert das entscheidende Bedürfnis nach präklinischen Systemen, die die Tumorheterogenität und die Phänotypen von Krebsstammzellen (CSC) nachbilden, und ermöglicht eine präzisere Bewertung therapeutischer Zielstrukturen und Arzneimittelwirkungen in der Forschung zum kolorektalen Karzinom. Durch die Bereitstellung einer reproduzierbaren Plattform zur langfristigen Anreicherung von CSCs und zur Beurteilung der Chemotherapieantwort unterstützt die Methode Bemühungen zur Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und zur Identifizierung führender Wirkstoffkandidaten mit verbesserter Übertragbarkeit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Heterogenität von Tumorstammzellen und deren Tumorbildungspotenzial anhand differenzieller Proliferationsmuster und lumenähnlicher Strukturen innerhalb von Sphäroiden.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem Tumorstammzellen, die etablierte Marker exprimieren, angereichert werden, und erleichtert so die mechanistische Absicherung therapeutischer Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Sphäroide einheitlicher Größe aus definierten Zellmengen und schafft damit ein standardisiertes System für die quantitative Analyse der Wirkstoffantwort.
- Operationaler Wert: Aufgrund der Robustheit, Reproduzierbarkeit und einfachen Gewinnung der Sphäroide mittels Sieb-basierter Methoden ist das Verfahren kompatibel mit Hochdurchsatz-Screening-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die Expression von CSC-Markern und die Reaktion auf klinisch relevante Kombinationschemotherapien, wodurch die präklinische Modellierung von Behandlungsresistenz und -empfindlichkeit ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Erhält CSC-Phänotypen über Langzeitkulturen hinweg und unterstützt damit Längsschnittstudien zur Wirkstoffeffizienz und zu Mechanismen der Tumorrückfälle.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung der Zielhypothesen über die Identifizierung von Leads bis hin zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für Onkologieprogramme, die auf CSC-gerichtete Therapien und Resistenzmechanismen ausgerichtet sind.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung, indem Krebsstammzell-Nischen und differenzielle Arzneimittelreaktionen in einem dreidimensionalen Kontext modelliert werden.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch die Bildung von sphäroiden Strukturen einheitlicher Größe und unterstützt damit zuverlässige Wirkstoffscreenings an Populationen mit angereicherten Krebsstammzellen.
- Analytik: Bietet quantitative Auswertungen mittels Expression von Markern für Krebsstammzellen, Proliferationsmarkern (PCNA) und Apoptosemarkern (aktiviertes Caspase-3), um Behandlungsbedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem die Chemotherapieantwort in einem krankheitsspezifischen System modelliert wird, das der Heterogenität des kolorektalen Adenokarzinoms entspricht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Durch Anpassung der dreidimensionalen Kulturbedingungen auf andere Krebsarten übertragbar und damit als wiederverwendbare Plattform in verschiedenen onkologischen Entdeckungsprogrammen einsetzbar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung, indem tumorassoziierte Heterogenität und funktionelle Stammzell-Eigenschaften erfasst werden, die in 2D-Modellen fehlen.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Ansiedlung, Anti-Adhäsions-Vorbehandlung und Sieb-basierte Gewinnung, wodurch die Variabilität bei der Sphäroid-Generierung verringert wird.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Weiterentwicklung oder Abbruch, indem eine frühe Beurteilung von Wirkstoffen, die auf Krebsstammzellen (CSC) abzielen, sowie von Resistenzmechanismen ermöglicht wird und späte biologische Risiken reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Leitstrukturen basierend auf Daten zur Modulation von Krebsstammzellen (CSC) und zur Chemotherapieantwort aus einem physiologisch relevanten Modell.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in 3D-Zellkultivierungstechniken, einschließlich der Behandlung von antiadhärenten Oberflächen und sorgfältigem Umgang, um die Bildung von Blasen während der Sphäroid-Initiierung zu vermeiden.
- Setzt den Zugang zu einer Basalmembranmatrix (z. B. Matrigel) sowie zu Standardzellkulturgefäßen voraus, darunter Zentrifugen, Siebe (37 Mikrometer) und invertierte Mikroskope zur Überwachung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Ansiedledichte (500–600 Zellen/Sphäroid) und der Inkubationsdauer, um Homogenität und Reproduzierbarkeit über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Die Anpassung auf andere Krebsarten erfordert eine Optimierung der Konzentration der Basalmembranmatrix und der Kultivierungsdauer, basierend auf zelllinienspezifischen Adhäsions- und Sphäroidbildungs-Kinetiken.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen der schonende Umgang während der Gewinnung, um eine Zerstörung der Sphäroide zu vermeiden, sowie mögliche Variabilität in der Zeitpunkte der Lumenbildung zwischen verschiedenen Chargen.
