Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Diese Methode ermöglicht die Identifizierung und Dissektion von stadienspezifischen Samenröhrensegmenten und ermöglicht die Untersuchung sehr spezifischer Schritte in der Spermatogenese. Die Stadien des Samenepithelzyklus können in frischen, nicht fixierten Tubuli erkannt werden, so dass wir nur die Stadien auswählen können, die für nachgelagerte Analysen von Interesse sind. Es erfordert etwas Übung, um zu lernen, die Stadien anhand ihrer Durchleuchtungsmuster zu erkennen, aber dieses Protokoll sollte Ihren Erfolg sicherstellen.

Verfahren wird von Opeyemi Olotu demonstriert, der als Doktorand in meinem Labor arbeitet. Beginnen Sie damit, eine mindestens 8 Wochen alte erwachsene männliche Maus in Rückenlage zu bringen und den Bauchbauch mit 70 % Ethanol zu desinfizieren. Verwenden Sie eine sterile Schere, um einen V-förmigen Schnitt im Bauchbeckenbereich zu machen, und ziehen Sie mit einer sterilen Pinzette am Nebenhodenfettpolster, um die Hoden zu lokalisieren.

Verwenden Sie eine Schere, um die Hoden zu präparieren, und legen Sie das Gewebe bei der Entnahme in eine sterile 100-Millimeter-Petrischale mit PBS. Schneide mit einer feinen Schere einen Schlitz in die Tunica albuginea, das dicke faserige Blatt, das die Hoden umschließt, und reiße die Tunica mit einer Pinzette auf und drücke die Tubuli heraus. Legen Sie die entkapselten Samenkanälchen in eine neue Petrischalen und fügen Sie so viel steriles PBS hinzu, dass der Boden der Schale bedeckt ist.

Ziehen Sie dann mit der Pinzette die Tubuli vorsichtig auseinander, ohne das Gewebe zu beschädigen. Zum Sezieren der Tubuli kleben Sie die Schale auf einen Präpariermikroskoptisch und schalten Sie die Durchleuchtung ein. Bewegen Sie die Tubuli-Bündel vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um sich mit den Lichtabsorptions- und Streumustern der verschiedenen Stadien vertraut zu machen.

Verwenden Sie dann eine Pinzette mit einer Hakenspitze, um einen interessierenden Tubulus anzuheben, und verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um ein Segment von angemessener Länge zu schneiden. Nachdem Sie die stadienspezifischen Tubulussegmente geschnitten haben, verwenden Sie eine Pipette, um ein interessierendes Segment in einem 10-Mikroliter-Volumen PBS zu sammeln, und platzieren Sie das Segment auf einem Objektträger. Drücken Sie vorsichtig ein 20 x 20 Millimeter großes Deckglas auf den Tubulus, ohne die Küvetten zu stark zu quetschen, und legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines Phasenkontrastmikroskops.

Legen Sie ein Filterpapier auf den Rand des Deckglases, um die Ausbreitung der Zellen in eine Monoschicht zu erleichtern, und verwenden Sie das 40-fach-Objektiv, um die Zellstadien zu überprüfen. Sobald die Zellen aus beiden Enden des Tubulus eine runde Monoschicht gebildet haben, tauchen Sie den Objektträger 10 Sekunden lang in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Klappen Sie das Deckglas mit einem Skalpell von den Zellen ab und legen Sie den Objektträger sofort für 2 bis 5 Minuten in 90%iges Ethanol

Anschließend an der Luft trocknen und den Objektträger bis zu mehreren Tagen bei Raumtemperatur lagern. Für die Ganz-Mount-Immunfärbung der Samenkanälchen verwenden Sie eine Pipette, um die interessierenden Segmente in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem PBS auf Eis zu übertragen. Nachdem Sie die Segmente sedimentieren gelassen haben, entfernen Sie vorsichtig das PBS.

10 Milliliter frisches, eiskaltes PBS dazugeben und durch Inversion mischen. Lassen Sie die Tubuli einige Minuten absetzen, bevor Sie den Überstand wie gezeigt wieder entfernen. Wenn der gesamte Überstand entfernt wurde, fixieren Sie die Tubuli fünf Stunden lang in 5 Millilitern Paraformaldehyd bei 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute bei 4 Grad Celsius.

Lassen Sie die Tubuli am Ende der Inkubation einige Minuten ruhen, bevor Sie die Probe dreimal in frischem PBS bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten pro Waschgang mit Rotation waschen. Nach dem letzten Waschen verwenden Sie eine 1-Milliliter-Pipette, um 10 bis 20 feste Tubulussegmente in ein 2-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden zu übertragen. Wenn sich die Segmente abgesetzt haben, wird der Überstand durch 1 Milliliter 2 % BSA und 10 % FBS in PBSX für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur und 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute ersetzt.

Am Ende der Blockinkubation waschen Sie die Proben mit 1 Milliliter PBSX. Bevor Sie die Tubuli mit 250 Mikrolitern Primärantikörper markieren, verdünnen Sie ihn zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute in 1 % BSA in PBSX. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Tubuli dreimal in PBSX, wie gezeigt, bevor Sie die Proben eine Stunde lang mit 250 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper markieren, geschützt vor Licht bei Raumtemperatur und 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute.

Waschen Sie die Tubuli am Ende der Inkubation dreimal, bevor Sie die Tubuli in einem kleinen Volumen Überstand auf einen Objektträger dekantieren. Ordnen Sie dann die Tubuli mit Gelladespitzen in linearen Streifen an und lassen Sie den überschüssigen Puffer ab. Fügen Sie dann 1 bis 2 Tropfen Eindeckmedium hinzu, bevor Sie die Folie mit einem Deckglas montieren.

Die Stadien 7 bis 8 erscheinen unter Durchleuchtung homogen dunkel, da sie eine hohe Anzahl voll kondensierter elongierender Spermatiden enthalten, die an der apikalen Oberfläche des Epithels ausgerichtet sind. Nachdem reife Spermien während der Spermierung in das Lumen freigesetzt wurden, erscheint der Tubulus in den Stadien 9 bis 10 sehr blass, da keine kondensierten länglichen Spermatiden im Epithel vorhanden sind. Auf diese blasse Zone folgt die Schwachstellenzone, deren fleckiges Aussehen von der Organisation der länglichen Spermatiden mit kondensiertem Chromatin in Bündeln herrührt.

Diese Bündel werden in der anschließenden Strong-Spot-Zone sehr deutlich. Die Spermatidenbündel wandern in Richtung der Sertoli-Zellkerne, die sich in der Nähe der Basallamina befinden, was sich bei Durchleuchtung als gestreiftes Aussehen der Tubuli der Stadien 2 bis 5 widerspiegelt. Die Bündel verteilen sich schließlich im Stadium 6, und kondensierende, längliche Spermatiden bewegen sich in die Nähe des Lumens, um im Stadium 8 aus dem Epithel freigesetzt zu werden.

Das genaue Stadium des Tubulussegments kann durch Phasenkontrastmikroskopie der Kürbispräparate genau überprüft werden. Die Immunfärbung von gestuften Kürbispräparaten kann verwendet werden, um die Expression und Lokalisation von Proteinen von Interesse im Samenepithel zu untersuchen. Die Ganzeinbettfärbung der Samenkanälchen wird typischerweise verwendet, um die Zelltypen zu untersuchen, die mit der Basalmembran des Samenepithels in Kontakt stehen, entweder auf der tubulären oder interstitiellen Seite.

Die Methode kann auch verwendet werden, um Zellen oder Strukturen zu untersuchen, die tiefer im Epithel liegen, wie z. B. die Blut-Hoden-Schranke oder postmeiotische Keimzellen. Neben der Immunfärbung können wir Stufentubensegmente für viele andere nachgelagerte Analysen verwenden, darunter biochemische RNA- und Proteinassays, Durchflusszytometrie und ex vivo Tubenkultur. Da diese Methode eine sehr detaillierte Analyse der Spermatogenese ermöglicht, bietet sie ein nützliches Werkzeug, um alle wichtigen Prozesse zu untersuchen, die für die Spermienproduktion und die männliche Fruchtbarkeit erforderlich sind.