Name: Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Lernen Sie die transilluminierte Mikrodissektion von Maus-Seminiferentubuli zur Analyse spezifischer Stadien des Spermatogenesezyklus. Diese Methode ermöglicht präzise Immunfärbungen für die reproduktionsbiologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Akademie Finnlands [315948, 314387 bis N.K.] unterstützt; Sigrid Jusélius Stiftung [nach N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [to J.-A.M., T.L.]; Turku Doktoratsstudium molekulare Medizin [S.C.-M., O.O.].

Die Wartung von Labormäusen und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der Universität Turku durchgeführt.
1. Herstellung von seminiferen Tubuli für die Mikrodissektion
<ol><li>Opfern Sie eine erwachsene männliche Maus (≥8 Wochen alt, Hoden 80–120 mg je nach Stamm und Alter) durch CO 2-Erstickung gefolgt von zervikaler Dislokation. HINWEIS: Die Maus sollte geschlechtsreif und vorzugsweise mindestens 8 Wochen alt sein. Transilluminationsmuster von jugendlichen Mäusen unterscheidet sich von Erwachsenen, weil die Welle des seminiferösen Epithels noch nicht vollständig etabliert ist, und das Timing der ersten Welle der Spermatogenese ist deutlich21,22. Der Mangel an länglichen Spermaatiden bei <4 Wochen alten männlichen Mäusen schließt ihre Verwendung für transilluminationsunterstützte Mikrodissektion aus. Alle Mausstämme, die eine normale Spermatogenese haben, können verwendet werden.</li>
	<li>Sprühen Sie den ventralen Bauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die abdominobeckende Kavität mit einer sterilen Schere, wodurch eine V-förmige Öffnung entsteht.</li>
	<li>Ziehen Sie das epididymale Fettpolster mit sterilen Zangen, lokalisieren Sie die Hoden, sezieren Sie sie mit einer Schere und legen Sie sie auf eine sterile 100-mm-Petrischale, die PBS enthält. HINWEIS: Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass alle Laborwaren und chirurgischen Werkzeuge steril sind.</li>
	<li>Mit einer feingekippten Schere entkapseln Sie die Hoden, indem Sie einen Schlitz in der Tunika albugineaschneiden, dem dicken Faserblech, das die Hoden einkapselt. Dann reißen Sie die Tunika mit einem Paar Zange auf. Zwingen Sie die Tubuli durch Drücken mit Zangen und entsorgen Sie die Tunika. HINWEIS: Beim Wegwerfen der Tunika könnte es für einige nachgelagerte Anwendungen von Vorteil sein, dass arteria hoicularis zusammen mit der Tunika entfernt wird. Vermeiden Sie eine Beschädigung der seminiferous tubulies.</li>
	<li>Bewegen Sie die seminiferous Tubuli zu einer neuen Petrischale und gießen Sie genug sterile PBS, um den Boden der Petrischale zu bedecken. Als nächstes ziehen Sie die Tubuli vorsichtig auseinander, vermeiden aber, die Tubuli zu beschädigen. HINWEIS: Zu viel mechanische Beanspruchung wirkt sich auf das Transilluminationsmuster aus und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit des Gewebes und seiner zellulären Architektur. Die Tubuli können ab diesem Zeitpunkt auch für ganzmontierte Immunostainierungen ohne Inszenierung (3B) verarbeitet werden. Manchmal reicht es aus, das Stadium nachträglich zu definieren, indem Antikörper gegen Proteine, die in differenzierender Spermatogonie exprimiert werden, wie SALL4, c-KIT und DNMT3A18,23,eingeschlossen werden. Die Dichte der Spermatogonie ist ein relativ zuverlässiger Indikator für die Stufe (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Transilluminationsunterstützte Mikrodissektion
<ol><li>Legen Sie die Petrischale unter ein Seziermikroskop fest, indem Sie sie auf die Bühne kleben. HINWEIS: Es ist wichtig, die Petrischale gut zu kleben, um ihre Bewegung zu verhindern, die eine Vermischung der gesammelten inszenierten seminiferen Tubulensegmente verursachen könnte.</li>
	<li>Um das Lichtabsorptionsmuster von seminiferen Tubuli unter Fokus zu enthüllen, stellen Sie sicher, dass die Probe von unten beleuchtet wird und das Licht durch die Probe geht, d.h.es wird transbeleuchtet. ANMERKUNG: Die Menge des absorbierten/gestreuten Lichts ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad in länglichen Spermaatiden und ihrer Bündelung im Seminifer-Tubuli: Je kondensierter, desto mehr Licht absorbiert wird, d. h., erscheint dunkler.</li>
	<li>Machen Sie sich mit dem Lichtabsorptionsmuster verschiedener Stufen vertraut, wie in Abbildung 2, Abbildung 5A und Abbildung S1 beschrieben, indem Sie Tubulenbündel mit feinen Zangen vorsichtig bewegen. HINWEIS: Die Stadien folgen einander immer in einer logischen Reihenfolge und bilden die Welle des seminiferösen Epithels. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass die Richtung der spermatogenen Welle gelegentlich umkehrt und dann wieder zurückkehrt (auch bekannt als Modulationen4,9), was manchmal das Verfahren erschwert. Auch die Länge der einzelnen Stufen, in Bezug auf wie viele mm Tubuli, variiert erheblich.</li>
	<li>Heben Sie den Interessent vorsichtig mit Zangen mit einer Hakenspitze an, und schneiden Sie dann ein Segment von geeigneter Länge mit einer Mikrodissektionsschere (siehe Ergänzendes Video 1). Ein Haken an der Spitze der Zange erleichtert das Heben und Halten eines Tubuli und hilft, ein Drücken zu vermeiden. HINWEIS: Die Länge der zu schneidenden Segmente hängt von nachgelagerten Anwendungen ab. Für die Sammlung von gepoolten Tubulenstücken eines bestimmten Stadiums für die Protein- oder RNA-Analyse12,13 (II–V, VII–VIII und IX–XI, Abbildung 5B) beträgt die Länge typischerweise 2–5 mm. Bei Verwendung der Standard-Phenol-Chlorform-Extraktion können aus 1 mm Tubuli rund 200 ng RNA abgeleitet werden. Bei der Vollmontage der Färbung von inszenierten Tubulesegmenten sollte die Länge der Segmente >5 mm betragen. Bei Squash-Präparaten sollte die Länge der Segmente 1–2 mm nicht überschreiten, da die Zellen in der Mitte des Segments möglicherweise nicht verlassen werden, wenn sie zu lang sind. Verwenden Sie eine mm-Skala unter der Petrischale für eine genaue Messung der Tubuslänge.</li>
</ol>3. Immunostainierung verschiedener Präparate
<ol><li>Squash-Vorbereitung: Stufenverifizierung und Immunfärbung HINWEIS: Bühnenspezifische Tubulenstücke können auf einem Mikroskopschlitten mit einem Deckglas zerquetscht werden, um morphologische Analysen lebender Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie und anschließende Immunfärbung durchzuführen. Ein Anfänger wird empfohlen, diesen Ansatz zu verwenden, um die Stadien zu überprüfen, wenn er mit der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode vertraut wird.<ol>
<li>Sammeln Sie das Segment in einem Volumen von 10 l mit einer Pipette und bewegen Sie es auf ein Mikroskopschlitten.</li>
		<li>Squash die Tubule durch Legen eines Deckglases (20 mm x 20 mm) vorsichtig auf den Tubuli. Als Ergebnis fließen Zellen aus dem Tubuli und bilden eine Live-Zell-Monoschicht. Legen Sie ein Filterpapier auf den Rand des Deckglases, um die Ausbreitung der Zellen zu erleichtern. Vermeiden Sie es, die Zellen zu sehr zu zerquetschen, um sie am Leben zu erhalten.</li>
		<li>Überwachen Sie die Zellausbreitung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit 40-fachem Ziel, um die Phasenerkennung zu überprüfen, indem Sie die vorhandenen Zelltypen untersuchen (Abbildung 2, Abbildung S2).</li>
		<li>Sobald sich die Zellen zu einer runden Monoschicht von beiden Enden des Tubuli ausgebreitet haben, tauchen Sie den Schlitten in einen Behälter, der flüssigen Stickstoff enthält, während Sie ihn mit Zange halten. Halten Sie es 10 s unter Wasser. Alternativ legen Sie die Rutsche zum Einfrieren auf eine Trockeneisplatte.</li>
		<li>Entfernen Sie das Deckglas, indem Sie es mit einem Skalpell abdrehen.</li>
		<li>Fahren Sie ohne Verzögerung mit der Fixierung fort und legen Sie die Rutsche schnell in einen Behälter mit 90% Ethanol für 2–5 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Squash-Zubereitung nicht auftaut, bevor Sie sie auf 90% Ethanol legen. Andere Fixative können auch verwendet werden, wie Aceton, für 10 min.</li>
		<li>Lufttrocken und lagern bei Raumtemperatur (RT) (bis zu einigen Tagen) oder bei -80 °C (langfristig).</li>
		<li>Zur Immunfärbung die Proben in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT nachfixieren.</li>
		<li>In PBS abspülen und mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min permeabilisieren.</li>
		<li>In PBS abspülen und einen Fettring um jede Squashprobe ziehen.</li>
		<li>Fügen Sie 50–100 l von 10% BSA (Rinderserumalbumin) in 0,1% Tween in PBS (PBST) in den Fettring und Blockproben für 30 min bei RT hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie die BSA-Lösung und inkubieren Sie mit einem primären Antikörper, der in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT verdünnt wird.</li>
		<li>Waschen Sie 3x für 5 min mit PBST.</li>
		<li>Inkubieren Sie mit einem sekundären Antikörper, der in 10% BSA in PBST verdünnt wird. HINWEIS: Um die Akrosomen zu färben, können die Proben mit Rhodamine-beschriftetem Erdnuss-Agglutinin-Antikörper (PNA, 1:1000) in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT(Abbildung S3) anstelle spezifischer Primär- und Sekundärantikörper inkubiert werden.</li>
		<li>Waschen Sie 3x für je 5 min mit PBST, spülen Sie mit PBS und montieren Sie mit einem Mountant, das DAPI enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Ganzer Immunfärbung von seminiferösen Tubuli HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Vollmontagefärbung für inszenierte (ab Schritt 2.4) Tubulesegmente. Wenn ein Forscher eine vollwertige Färbung ohne Inszenierung durchführen möchte (ab Schritt 1.5), achten Sie auf Noten in 3.2.1 und 3.2.7.<ol>
<li>Mit einer Pipette die Tubulesegmente (ab Schritt 2.4) in eiskaltem PBS in ein 15 ml kegelförmiges Rohr übertragen und auf Eis sedimentieren lassen. HINWEIS: Wenn Sie nicht inszenierte Tubuli von 1.5. verwenden, trennen Sie die Tubuli in einer Petrischale, indem Sie mehrmals auf eine gekippte Schale pfeifen und zurückpfeifen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette mit einer geschnittenen Spitze. Dieser Schritt soll die Struktur des Gewebes öffnen. Vermeiden Sie jedoch zu viel Pipettierung, da es die Tubuli beschädigen könnte. Die Sedimentation von Tubuli wird einige Dutzend Sekunden dauern. Kleine Tubulenfragmente, interstitielle Zellen und Zellablagerungen bleiben im Überstand.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand (SN) vorsichtig durch Pipettieren oder mit einem Aspirator. 10 ml eiskaltes PBS hinzufügen und durch Inversion mischen.</li>
		<li>Lassen Sie Sediment eimt und dann entfernen SN wie zuvor.</li>
		<li>5 ml 4% PFA hinzufügen und für 5 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei +4 °C fixieren. HINWEIS: Die Fixationszeit hängt von den Proteinen von Interesse und ihrer subzellulären Lokalisierung ab. Für kern- und zytoplasmatische Proteine ist eine 2-h-Fixierung in der Regel ausreichend, jedoch Membranmarker, wie z. B. GFR1 (GDNF-Familienrezeptor alpha 1; Abbildung 6A,B), profitieren von einer längeren Fixierung, bis zu 6 h.</li>
		<li>Sedimentieren zulassen, SN (PFA) wie bisher entfernen und kurz abspülen, indem 10 ml PBS hinzugefügt und das Rohr invertieren.</li>
		<li>Sedimentieren, SN wie bisher entfernen und den PBS-Waschschritt dreimal für jeweils mindestens 10 min auf einem rotierenden Tisch bei +4 °C wiederholen und bei +4 °C färben oder lagern. HINWEIS: Wenn die Arbeitsbedingungen steril sind und die Proben gereinigt werden können, können sie mindestens einige Wochen gelagert und verwendet werden. Alternativ können Sie Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w/v) aus einer 2%igen Stofflösung hinzufügen, um die Tubuli vor der Lagerung bei +4 °C zu erhalten.</li>
		<li>Mit einer 1-ml-Pipette 10–20 feste Tubulisegmente in ein 2-ml-Rundbodenrohr verschieben. SN sedimentieren und entfernen lassen. HINWEIS: Wenn Sie mit langen Tubuli arbeiten, die nicht inszeniert wurden, gießen Sie die Tubuli auf eine Petrischale und schneiden Sie mit Mikrodissektionsschere und Zangen Segmente von etwa 5–20 mm. Zu lange Segmente verwickeln sich während des Färbevorgangs, während zu kurze Segmente leicht verloren gehen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml von 2% BSA + 10% FBS (fetales Rinderserum) in 0,3% Triton X-100 in PBS (PBSX) hinzu. Block für mindestens 1 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) bei RT.</li>
		<li>Spülen Sie mit 1 ml PBSX, entfernen Sie SN durch Pipettieren und fügen Sie 250 L primären Antikörper in 1% BSA in PBSX verdünnt (1:100–1:2000 Verdünnung) hinzu. 2 h bei RT oder über Nacht bei +4 °C auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Pipettieren und spülen Sie die Tubuli mit 1 ml PBSX wie oben beschrieben. Dreimal für 1 h in PBSX auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT waschen. HINWEIS: Nach diesem ersten Waschen kann die Probe bei Bedarf bei +4 °C über Nacht gelassen werden.</li>
		<li>Entfernen Sie SN, und fügen Sie 250 L sekundären Antikörpers hinzu, der in 1% BSA in PBSX verdünnt wird (typischerweise 1:500 Verdünnung eines fluoreszierenden Antikörpers). In Folie abdecken und auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie 3.2.10.</li>
		<li>Entfernen Sie schließlich SN und gießen Sie die Tubuli auf ein Mikroskopschlitten. Mit Gel-Ladespitzen können Sie Tubuli in Linearstreifen sanft trennen und anordnen. Überschüssigen Puffer abtropfen lassen und Montagemedium und Einen Deckelschlupf hinzufügen. HINWEIS: Vermeiden Sie das Trocknen der Tubuli, während Sie sie arrangieren. Eine Gegenfärbung der Kerne mit DAPI ist in den meisten Fällen nicht notwendig. Versiegeln Sie die Kante des Deckels mit Nagellack, um Probentrocknung und Verschlechterung zu verhindern. Dias können vor der Bildgebung 1–2 Wochen lang bei +4 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Parvinen, M., Söderström, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die oben beschriebene transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht einen stufenorientierten Ansatz zur Untersuchung der Spermatogenese. Die Spermatogenese ist ein hochsynchronisierter Prozess, und alle wichtigen Schritte während der spermatogenen Differenzierung werden stufenabhängig reguliert und ausgeführt, wie Z.B. Differenzierungsverpflichtung (in den Stadien VII-VIII), Beginn der Meiose (VII-VIII), meiotische Teilungen (XII), Beginn der Spermadehnung (VIII) und Spermiation (VIII)1,26,27. Die phasenorientierte Analyse bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um diese besonderen Ereignisse zu untersuchen, die auf bestimmte Schritte der Spermatogenese beschränkt sind und daher nur in definierten Stadien des seminiferen Epithelzyklus gefunden werden. Die Beherrschung der Methode erfordert einige Praxis und die Verwendung eines hochwertigen Seziermikroskops und richtige Beleuchtungsbedingungen sind der Schlüssel zum Erfolg. Die Implementierung dieser Methode als Teil des täglichen Toolkits hat die Fähigkeit, die Wirkung und biologische Relevanz der Forschung über männliche Fortpflanzungsfunktionen erheblich zu verbessern, indem eine genauere Zerlegung molekularer Ereignisse während der Spermatogenese ermöglicht wird.
Alle von uns untersuchten WT-Mausstämme zeigen ein ähnliches Transilluminationsmuster und zeigen konservierte Zellassoziationen in Stadien des seminiferen Epithelzyklus. Unter der Voraussetzung, dass sich die spermiogene Differenzierung von Keimzellen nicht wesentlich von WT-Mäusen unterscheidet, gilt das gleiche auch für alle von uns untersuchten Knock-out-Mausmodelle. Darüber hinaus kann es auf andere Arten angewendet werden, die längsförmige segmentale Anordnung von Stadien des seminiferen Epithelzyklus7aufweisen. Arten mit nicht-segmentalen Stadien (z. B. menschliche Stadien) können jedoch nicht verwendet werden. Angesichts der wesentlichen Rolle der Chromatinkondensation bei der Festlegung des Transilluminationsmusters bei der Definition des Transilluminationsmusters ist klar, dass jede Fehlregulation dieses Prozesses unweigerlich die Umsetzung dieser Methode beeinträchtigen wird. Bei jugendlichen Mäusen und jungen Erwachsenen (5-6 Wochen) ist das Transilluminationsmuster noch nicht vollständig etabliert, daher sollten nur Mäuse verwendet werden, die älter als 8 Wochen sind. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass das Drücken und Ziehen der Tubuli unweigerlich auf das Transilluminationsmuster einwirkt, da es die zelluläre Architektur innerhalb des seminiferen Epithels verzerrt.
Die isolierten seminiferen Tubulensegmente können auch kultiviert werden, was die Ex-vivo-Beobachtung und Manipulation von Spermatogenese-gekoppelten Prozessen, einschließlich Meiose, ermöglicht. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten und den Abbau von RNA und Protein zu verhindern, sollten die Proben nicht mehr als 2 Stunden nach dem Opfern der Maus gesammelt und verarbeitet werden. Für ex vivo Kultur der seminiferous tubulies, sollte die Zeit vom Opfer bis zum Beginn der Kultur nicht mehr als 1 Stunde. Die Integrität von Tubule-Fragmenten kann in der Regel bis zu 72 Stunden in vitro aufrechterhalten werden, wenn sie richtig geerntet werden.
Das Stadium des seminiferen Epithelzyklus kann mit einer Phasenkontrastmikroskopie von Squashpräparaten16überprüft und noch genauer definiert werden. Die Mikroskopie wird an lebenden Zellen durchgeführt, was eine zusätzliche Dimension in die Analyse einführt und die Beobachtung von Organellen- oder Zellbewegungen in bestimmten Stadien der Spermatogenese28,29,30ermöglicht. Die Phasenkontrastmikroskopie liefert eine exakte Inszenierung für die nachfolgende Immunfärbung, die eine sehr detaillierte Analyse der Proteinexpression und Lokalisierungsdynamik während der Spermatogenese ermöglicht, einschließlich stufenspezifischer Veränderungen.
Während Zellen in Squashpräparaten aus dem epitheliaalen Kontext freigesetzt werden, ermöglichen ganzmontierte Immunostainierungen von Tubulisegmenten die Untersuchung von spermaatogenen Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Daher können Vollmontagepräparate eine bessere Visualisierung der seminiferous tubbule Architektur und ihrer interzellulären Kontakte bieten als die Immunfärbung auf Querschnitten. Wichtig ist, dass die transilluminationsunterstützte Inszenierung der Tubulesegmente vor der Immunfärbung den Ansatz noch stärker macht, indem Informationen über die spezifische Stufe eines bestimmten Segments eingebunden werden. Die Vollfärbung ist ein besonders nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Zellen an der Peripherie seminiferöser Tubuli, wie peritubululare Myoidzellen, peribuläre Makrophagen und Spermatogonie, könnte aber auch neue Erkenntnisse in der Forschung an meiotischen und postmetiotischen Keimzellen eröffnen.

Die Differenzierung männlicher Keimzellen von diploiden Spermatogonien zu reifen haploiden Spermatozoen, d.h.Spermatogenese, ist ein komplexer Prozess, der im Epithel von seminiferen Tubuli in den Hoden eines sexuell reifenIndividuums1 stattfindet. Mitotische Nachkommen von A1-Spermatogonien teilen sich zuerst fünfmal, um die differenzierungsgebundene Population zu erweitern, und treten dann als Spermatozyten ein, die letztlich zu haploiden Spermatoiden führen. Die Differenzierung von runden Spermien in Spermatozoen, d.h.Spermiogenese, beinhaltet komplexe Veränderungen in der zellulären Morphologie, einschließlich nuklearer Verdichtung und Konstruktion von spermienspezifischen Strukturen wie dem Akrosom und dem Flagellum. In der Maus dauert der gesamte Prozess der Spermatogenese 35 Tage, um2,3.
An jedem Gebietsschema beherbergt das Seminiferepithel bis zu fünf Kohorten differenzierender Keimzellen sowie der Keimbahnstamm-/Vorläuferzellen und der somatischen Sertolizellen1. Differenzierende Keimzellen bilden konzentrische Schichten, deren Zusammensetzung vorhersagbar ist, und haploide Zellen in einem bestimmten Entwicklungsschritt immer mit bestimmten Arten von Spermatozyten und Spermatogonie4,5assoziieren. Daher beherbergt jeder Querschnitt eines Tubuli Kohorten von Keimzellen mit konstanter Zusammensetzung. Diese spezifischen Zellassoziationen werden als die Stadien des seminiferen Epithels definiert. Stufen an sich stellen keine stagnierenden Kontrollpunkt-ähnlichen Zustände dar, sondern entwickeln sich ständig weiter, wenn die Differenzierung von Keimzellkohorten in Synchron1,2,6fortschreitet. Bei Mäusen gibt es 12 Stufen (I-XII)2, die segmental entlang der Längsachse des seminiferösen Tubuli angeordnet sind, und sie folgen einander in einer logischen Reihenfolge und bilden so die Welle des seminiferösen Epithels oder der spermaatogenen Welle7,8,9 ( Abbildung1). Die Vollendung der Spermatogenese dauert vier Zyklen, und hierarchische Schichten oder Kohorten von differenzierenden Keimzellen innerhalb eines seminiferösen Tubbulenquerschnitts sind zeitlich ein Seminiferzyklus voneinander entfernt. Die Länge des Zyklus ist artabhängig und in der Maus dauert jeder Zyklus 8,6 Tage10.
Die Stadien können auf der Grundlage der zellulären Zusammensetzung und Organisation des seminiferen Epithels auf den histologischen Hodenabschnitten5 (Abbildung 1 und Abbildung 2) identifiziert werden. Die histologische Analyse ist jedoch mühsam, zeitaufwändig und erfordert eine Fixierung und Färbung und kann daher nicht auf lebendes Gewebe angewendet werden. Wichtig ist, dass die Inszenierung auch auf lebendem Gewebe unter einem Seziermikroskop durchgeführt werden kann, indem die unterschiedlichen Lichtabsorptions-/Streumuster genutzt werden, die in verschiedenen Stadien des Zyklus dargestellt werden (Abbildung 2). Die Fähigkeit jeder Stufe, Licht zu absorbieren und zu streuen, ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad der späten postmeiotischen Spermaatien, die jede bestimmte Stufe Wirt ist, und der Verpackung dieser Zellen in Bündeln7,11. Die Spermadifferenzierung, d.h.Spermiogenese, ist weiter in 16 Entwicklungsschritte unterteilt, darunter 8 Schritte runder Sperma (Schritt 1-8) und 8 Schritte der lästigen Spermatiendifferenzierung (Schritte 9-16)(Abbildung 1). Schritt 9-11 langlängige Spermatoren (Stufe IX-XI) zeigen nur einen niedrigen Chromatinkondensationsgrad, was zu einer geringen Menge an Licht führt, die absorbiert wird. Die Chromatinkondensation beginnt in Schritt 11 Spermaatiden (Stufe XI), und Schritt 15-16 längliche Spermatien (Stufe IV-VIII) enthalten vollständig kondensiertes Chromatin und weisen daher eine maximale Lichtabsorption auf (Abbildung 3). Chromatin muss kondensiert werden, um fest in den Spermienkopf gepackt zu werden. Weitere Faktoren, die zum Lichtabsorptionsmuster beitragen, sind die Lage der länglichen Spermatoide innerhalb des Epithels (Basal vs. apikal) und die Bündelung von länden Spermaatiden (ausgesprochen in den Stadien II-V)11 (Abbildung 3). Bündel werden als Flecken in der Mitte der Tubuli und als Streifen an den Rändern unter einem Seziermikroskop und je kondensierter das Chromatin, desto dunkler der Fleck/Streifen11.
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulisegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen. Einmal isoliert, können inszenierte Tubulesegmente verschiedenen nachgelagerten Analysen unterzogen werden, einschließlich biochemischer RNA- und Proteinanalysen12,13,14,15, Durchflusszytometrie16, ex vivo Tubule-Kultur17 und Immunostaining18. Hier bieten wir auch detaillierte Nachflussprotokolle zur Vorbereitung von gequetschten Monolayern von inszenierten Tubulesegmenten für die morphologische Analyse von Lebenden Zellen und die anschließende Immunfärbung sowie für die ganzmontierte Immunfärbung von Tubulensegmenten. Der Workflow in Abbildung 4auf den Punkt gebracht.
Die transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht dank der synchronisierten zellulären Zusammensetzung der Stadien eine genaue Identifizierung und Isolierung von Keimzellen bei bestimmten Differenzierungsschritten. Wichtig ist, es ermöglicht auch die Untersuchung von stadium-abhängigen Ereignissen während der Spermatogenese auf lebendem Gewebe. Angesichts des Fehlens skalierbarer In-vitro-Modelle für die Spermatogenese hat diese Methode auch einen einzigartigen Vorteil, gezielte kurzfristige Entwicklungs- und toxikologische Studien an stufenspezifischen Tubulesegmenten ex vivo12,17zu ermöglichen. Während wir die Methode hier für die Maus beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf alle Säugetierarten mit Längs- und Segmentanordnung von seminiferen Epithelstadien angewendet werden, wie die Ratte4,7,15,19,20.

<table><tbody><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 20x20 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>Falcon konisches Röhrchen 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Fettstift (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (100 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36962</td><td></td></tr> mit <tr><td>Rhodamin markiertes Erdnussagglutinin (PNA)</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenese ist ein einzigartiger Differenzierungsprozess, der letztlich zu einem der unterschiedlichsten Zelltypen des Körpers, dem Sperma, führt. Die Differenzierung von Keimzellen erfolgt in den zytoplasmatischen Taschen somatischer Sertolizellen, die gleichzeitig 4 bis 5 Generationen von Keimzellen beherbergen und ihre Entwicklung koordinieren und synchronisieren. Daher ist die Zusammensetzung der Keimzelltypen innerhalb eines Querschnitts konstant, und diese Zellassoziationen werden auch als Stadien (I–XII) des seminiferen Epithelzyklus bezeichnet. Wichtig ist, dass Stadien auch aus intakten seminiferen Tubuli identifiziert werden können, basierend auf ihren differenziellen Lichtabsorptions-/Streueigenschaften, die durch Transillumination aufgedeckt werden, und der Tatsache, dass die Stufen einander entlang des Tubuli in numerischer Reihenfolge folgen. Dieser Artikel beschreibt eine transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulensegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus der Maus darstellen. Das Lichtabsorptionsmuster seminiferöser Tubuli wird zunächst unter einem Seziermikroskop untersucht, und dann werden Tubulensegmente, die bestimmte Stufen darstellen, geschnitten und für nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschreiben wir Immunstainierungsprotokolle für stufenspezifische Squashpräparate und für intakte Tubulesegmente. Diese Methode ermöglicht es einem Forscher, sich auf biologische Ereignisse zu konzentrieren, die in bestimmten Phasen der Spermatogenese stattfinden, und bietet so ein einzigartiges Werkzeug für entwicklungstechnische, toxikologische und zytologische Studien der Spermatogenese und der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Diese Methode ermöglicht die Identifizierung und Dissektion von stadienspezifischen Samenröhrensegmenten und ermöglicht die Untersuchung sehr spezifischer Schritte in der Spermatogenese. Die Stadien des Samenepithelzyklus können in frischen, nicht fixierten Tubuli erkannt werden, so dass wir nur die Stadien auswählen können, die für nachgelagerte Analysen von Interesse sind. Es erfordert etwas Übung, um zu lernen, die Stadien anhand ihrer Durchleuchtungsmuster zu erkennen, aber dieses Protokoll sollte Ihren Erfolg sicherstellen.Das Verfahren wird von Opeyemi Olotu demonstriert, der als Doktorand in meinem Labor arbeitet. Beginnen Sie damit, eine mindestens 8 Wochen alte erwachsene männliche Maus in Rückenlage zu bringen und den Bauchbauch mit 70 % Ethanol zu desinfizieren. Verwenden Sie eine sterile Schere, um einen V-förmigen Schnitt im Bauchbeckenbereich zu machen, und ziehen Sie mit einer sterilen Pinzette am Nebenhodenfettpolster, um die Hoden zu lokalisieren.Verwenden Sie eine Schere, um die Hoden zu präparieren, und legen Sie das Gewebe bei der Entnahme in eine sterile 100-Millimeter-Petrischale mit PBS. Schneide mit einer feinen Schere einen Schlitz in die Tunica albuginea, das dicke faserige Blatt, das die Hoden umschließt, und reiße die Tunica mit einer Pinzette auf und drücke die Tubuli heraus. Legen Sie die entkapselten Samenkanälchen in eine neue Petrischalen und fügen Sie so viel steriles PBS hinzu, dass der Boden der Schale bedeckt ist.Ziehen Sie dann mit der Pinzette die Tubuli vorsichtig auseinander, ohne das Gewebe zu beschädigen. Zum Sezieren der Tubuli kleben Sie die Schale auf einen Präpariermikroskoptisch und schalten Sie die Durchleuchtung ein. Bewegen Sie die Tubuli-Bündel vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um sich mit den Lichtabsorptions- und Streumustern der verschiedenen Stadien vertraut zu machen.Verwenden Sie dann eine Pinzette mit einer Hakenspitze, um einen interessierenden Tubulus anzuheben, und verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um ein Segment von angemessener Länge zu schneiden. Nachdem Sie die stadienspezifischen Tubulussegmente geschnitten haben, verwenden Sie eine Pipette, um ein interessierendes Segment in einem 10-Mikroliter-Volumen PBS zu sammeln, und platzieren Sie das Segment auf einem Objektträger. Drücken Sie vorsichtig ein 20 x 20 Millimeter großes Deckglas auf den Tubulus, ohne die Küvetten zu stark zu quetschen, und legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines Phasenkontrastmikroskops.Legen Sie ein Filterpapier auf den Rand des Deckglases, um die Ausbreitung der Zellen in eine Monoschicht zu erleichtern, und verwenden Sie das 40-fach-Objektiv, um die Zellstadien zu überprüfen. Sobald die Zellen aus beiden Enden des Tubulus eine runde Monoschicht gebildet haben, tauchen Sie den Objektträger 10 Sekunden lang in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Klappen Sie das Deckglas mit einem Skalpell von den Zellen ab und legen Sie den Objektträger sofort für 2 bis 5 Minuten in 90%iges Ethanol.Anschließend an der Luft trocknen und den Objektträger bis zu mehreren Tagen bei Raumtemperatur lagern. Für die Ganz-Mount-Immunfärbung der Samenkanälchen verwenden Sie eine Pipette, um die interessierenden Segmente in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit eiskaltem PBS auf Eis zu übertragen. Nachdem Sie die Segmente sedimentieren gelassen haben, entfernen Sie vorsichtig das PBS.10 Milliliter frisches, eiskaltes PBS dazugeben und durch Inversion mischen. Lassen Sie die Tubuli einige Minuten absetzen, bevor Sie den Überstand wie gezeigt wieder entfernen. Wenn der gesamte Überstand entfernt wurde, fixieren Sie die Tubuli fünf Stunden lang in 5 Millilitern Paraformaldehyd bei 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute bei 4 Grad Celsius.Lassen Sie die Tubuli am Ende der Inkubation einige Minuten ruhen, bevor Sie die Probe dreimal in frischem PBS bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten pro Waschgang mit Rotation waschen. Nach dem letzten Waschen verwenden Sie eine 1-Milliliter-Pipette, um 10 bis 20 feste Tubulussegmente in ein 2-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden zu übertragen. Wenn sich die Segmente abgesetzt haben, wird der Überstand durch 1 Milliliter 2 % BSA und 10 % FBS in PBSX für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur und 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute ersetzt.Am Ende der Blockinkubation waschen Sie die Proben mit 1 Milliliter PBSX. Bevor Sie die Tubuli mit 250 Mikrolitern Primärantikörper markieren, verdünnen Sie ihn zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute in 1 % BSA in PBSX. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Tubuli dreimal in PBSX, wie gezeigt, bevor Sie die Proben eine Stunde lang mit 250 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper markieren, geschützt vor Licht bei Raumtemperatur und 20 bis 30 Umdrehungen pro Minute.Waschen Sie die Tubuli am Ende der Inkubation dreimal, bevor Sie die Tubuli in einem kleinen Volumen Überstand auf einen Objektträger dekantieren. Ordnen Sie dann die Tubuli mit Gelladespitzen in linearen Streifen an und lassen Sie den überschüssigen Puffer ab. Fügen Sie dann 1 bis 2 Tropfen Eindeckmedium hinzu, bevor Sie die Folie mit einem Deckglas montieren.Die Stadien 7 bis 8 erscheinen unter Durchleuchtung homogen dunkel, da sie eine hohe Anzahl voll kondensierter elongierender Spermatiden enthalten, die an der apikalen Oberfläche des Epithels ausgerichtet sind. Nachdem reife Spermien während der Spermierung in das Lumen freigesetzt wurden, erscheint der Tubulus in den Stadien 9 bis 10 sehr blass, da keine kondensierten länglichen Spermatiden im Epithel vorhanden sind. Auf diese blasse Zone folgt die Schwachstellenzone, deren fleckiges Aussehen von der Organisation der länglichen Spermatiden mit kondensiertem Chromatin in Bündeln herrührt.Diese Bündel werden in der anschließenden Strong-Spot-Zone sehr deutlich. Die Spermatidenbündel wandern in Richtung der Sertoli-Zellkerne, die sich in der Nähe der Basallamina befinden, was sich bei Durchleuchtung als gestreiftes Aussehen der Tubuli der Stadien 2 bis 5 widerspiegelt. Die Bündel verteilen sich schließlich im Stadium 6, und kondensierende, längliche Spermatiden bewegen sich in die Nähe des Lumens, um im Stadium 8 aus dem Epithel freigesetzt zu werden.Das genaue Stadium des Tubulussegments kann durch Phasenkontrastmikroskopie der Kürbispräparate genau überprüft werden. Die Immunfärbung von gestuften Kürbispräparaten kann verwendet werden, um die Expression und Lokalisation von Proteinen von Interesse im Samenepithel zu untersuchen. Die Ganzeinbettfärbung der Samenkanälchen wird typischerweise verwendet, um die Zelltypen zu untersuchen, die mit der Basalmembran des Samenepithels in Kontakt stehen, entweder auf der tubulären oder interstitiellen Seite.Die Methode kann auch verwendet werden, um Zellen oder Strukturen zu untersuchen, die tiefer im Epithel liegen, wie z. B. die Blut-Hoden-Schranke oder postmeiotische Keimzellen. Neben der Immunfärbung können wir Stufentubensegmente für viele andere nachgelagerte Analysen verwenden, darunter biochemische RNA- und Proteinassays, Durchflusszytometrie und ex vivo Tubenkultur. Da diese Methode eine sehr detaillierte Analyse der Spermatogenese ermöglicht, bietet sie ein nützliches Werkzeug, um alle wichtigen Prozesse zu untersuchen, die für die Spermienproduktion und die männliche Fruchtbarkeit erforderlich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt die Isolierung von Sertoli-Zellen aus Samenkanälchen der Maus, einer Komponente der Hoden. Enzymatischer Verdau und wiederholtes Waschen fördern die Freisetzung von Sertoli-Zellen in die Lösung, die zur Proliferation und zum Wachstum weiter kultiviert werden kann.

Isolierung immunregulatorischer Sertoli-Zellen aus Samenmagentubuli der Maus

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität durch Einspritzen von Inulin-FITC in Hoden zu beurteilen. Dies ist eine effiziente in Vivo -Methode, um die Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren, die durch genetische und umweltbedingte Elemente beeinträchtigt werden kann.

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Hier stellen wir ein eCLIP-Protokoll vor, um die wichtigsten RNA-Ziele von RBP-Kandidaten in Hoden zu ermitteln.

Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Eine Methode zur Mikrodissektion des Eileiters der Maus, die die Sammlung der einzelnen Segmente unter Beibehaltung der RNA-Integrität ermöglicht, wird vorgestellt. Darüber hinaus wird ein nicht-enzymatisches oviduktales Zelldissoziationsverfahren beschrieben. Die Methoden eignen sich für die anschließende Gen- und Proteinanalyse der funktionell unterschiedlichen Eileitersegmente und dissoziierten Eileiterzellen.

Mikrodissektion und Dissoziation des Murinen Eileiters: Identifizierung einzelner Segmente und Einzelzellisolierung

Dies ist eine häufig verwendete Methode für die C.  elegans-Gonadendissektion, gefolgt von Freeze Crack, bei der Keimbahnproben für die Immunfluoreszenz durch Antikörperfärbung oder für die einfache DAPI-Färbung zur Visualisierung von DNA hergestellt werden. Dieses Protokoll war erfolgreich für Studenten in einem Forschungslabor und in einer kursbasierten Bachelor-Forschungserfahrung.

C. elegans Gonadendissektion und Gefrierriss für Immunfluoreszenz und DAPI-Färbung

Lernen Sie die transilluminierte Mikrodissektion von Maus-Seminiferentubuli zur Analyse spezifischer Stadien des Spermatogenesezyklus. Diese Methode ermöglicht präzise Immunfärbungen für die reproduktionsbiologische Forschung.

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses (Video) | JoVE Journal

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