Name: Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Erfahren Sie zwei durchflusszytometrische Methoden zur Detektion von NKG2D-Liganden auf AML-Zellen. Diese Techniken ermöglichen die Trennung leukämischer Stammzellen von Massenzellen für weitere Charakterisierung.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Schweizerischen Nationalfonds (179239), der Stiftung zur Krebsbekämpfung (Zürich), der Wilhelm Sander Stiftung an CL (2019.042.1) und der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung an C.L. Darüber hinaus wurde dieses Projekt aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 765104 gefördert. Wir danken der Durchflusszytometrie-Anlage in Basel für die Unterstützung.

Patientenproben wurden nach Bewilligung durch die Ethikprüfungskommission der Universitätsspitäler Basel und Tübingen erhoben.
1. Biotinylierung des NKG2D-Fusionsproteins
HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem Biotinylierungskit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dieser Schritt des Protokolls muss mindestens 24 Stunden vor der Färbung durchgeführt werden. Das biotinylierte NKG2D-Fusionsprotein sollte bei -20 °C gelagert werden.
<ol><li>Tauen Sie sowohl das Biotin als auch die NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur (RT) auf. HINWEIS: Wenn die Zellen für weitere experimentelle Verwendungen steril sein müssen (Injektion in Mäuse, koloniebildende Einheitentests usw.), rekonstituieren Sie das Fusionsprotein unter einer laminaren Strömungshaube, um eine Kontamination zu vermeiden. Ansonsten kann jeder Schritt auf einer Bank durchgeführt werden.</li>
	<li>Drehen Sie schnell das 50μg lyophilisierte NKG2D-Fusionsprotein herunter. Fügen Sie 500 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P1000-Mikropipette.</li>
	<li>100 μL des NKG2DL-Fusionsproteins werden in ein Biotinröhrchen gegeben, um eine endgültige Stammkonzentration von 100 μg/ml zu erhalten.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösung gründlich durch kontinuierliches Wiederaufbewenden mit einer P100-Mikropipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Fusionsprotein/Biotinlösung bei einem kontrollierten RT für 24 h. Das Fusionsprotein ist nun einsatzbereit.</li>
</ol>2. Auftauen primärer AML-Zellen
HINWEIS: Ungefähr 5.000.000 gefrorene leukämische Zellen pro Patient, die in flüssigem Stickstoff gelagert wurden, wurden aufgetaut und dann sofort für die Assays verwendet. Leukämische Zellen wurden wie zuvor beschrieben gewonnen und eingefroren15. Kurz gesagt, periphere Blutproben, die von Patienten mit AML und hohen Blastenzellanteilen (>90% der Blasten zwischen mononukleären Zellen) entnommen wurden, wurden mit einer Dichtegradiententrennung verarbeitet, um mononukleäre Zellen zu erhalten, und anschließend in fetalem Kalbserum (FCS) mit 10% Dimethylsulfoxidlösung (DMSO) eingefroren. Die Zellzahlen variierten stark zwischen den Patienten in Abhängigkeit von der Leukozytenkonzentration im Patienten (Bereich: 1.000.000 bis 30.000.000 leukämische Zellen pro ml Blut).
<ol><li>Vorwärmen rpmI-Medium mit 10% FCS bei 37 °C in einem Wasserbad. Für jede Durchstechflasche mit AML-Zellen (bis zu 30.000.000 Zellen in 1 ml FCS + 10% DMSO) werden 10 ml vorgewärmtes Medium in ein 15 ml Reaktionsröhrchen gegeben.</li>
	<li>Entfernen Sie die kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und tauen Sie die Zellen sofort mit einem 37 °C Wasserbad auf. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist.</li>
	<li>Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das mediumhaltige Röhrchen und spülen Sie die Durchstechflasche mit 1 ml Medium aus.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 ml RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min.</li>
</ol>3. Zellzählung
<ol><li>Das Zellpellet wird in einem bekannten RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, wieder aufsetzen.</li>
	<li>Ein kleines Volumen der Zellsuspension wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in einem bekannten Verhältnis mit Trypanblau oder einem anderen alternativen Farbstoff verdünnt, der eine Unterscheidung zwischen lebenden Zellen und toten Zellen ermöglicht.</li>
	<li>Verwenden Sie ein beliebiges Gerät, um die Zellen zu zählen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
</ol>4. Färbung primärer AML-Zellen mit dem biotinylierten NKG2D-Fusionsprotein
<ol><li>Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 500 ml PBS mit Rinderserumalbumin (BSA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf eine Endkonzentration von 0,07 mM bzw. 2 mM ergänzen. Passen Sie den pH-Wert (7,2–7,4) bei Bedarf an.</li>
	<li>Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 x 107 Zellen/ml resuspendiert. HINWEIS: Optional können die Zellen vor der Färbung mit einem Blockierungsmittel (z.B. hIgG (1μg/ml) für 30 min bei RT oder FcR-Blockierungsmittel) inkubiert werden.</li>
	<li>100 μL der Zellsuspension auf eine Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung mit einer Endkonzentration von 10 μg / ml pro Vertiefung resuspendiert werden.</li>
	<li>Fügen Sie die in Schritt 4.4 hergestellte Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette. HINWEIS: Skalieren Sie das endende Volumen entsprechend der Anzahl der Zellen, um die menge an Fusionsprotein zu reduzieren, die für die Färbung erforderlich ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellsuspension für 25 min bei RT oder 50 min bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8. HINWEIS: Die hier beschriebene Färbung erfolgt in einer Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte. Daher werden Waschschritte aufgrund der geringen Volumenkapazität solcher Platten zweimal durchgeführt. Die Färbung kann auch in anderen Röhrchen durchgeführt werden und Waschschritte können dann nur einmal mit einem größeren Volumen durchgeführt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin-PE vor (siehe Tabelle 1 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL resuspendiert werden. HINWEIS: Fügen Sie Selektionsantikörper für Ihren Zelltyp von Interesse hinzu, wie z.B. CD33, CD34.... für AML.</li>
	<li>Fügen Sie die in Schritt 4.10 vorbereitete Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellsuspensionen für 15 min bei RT oder 30 min bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.13 und 4.14.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung aus Färbepuffer einschließlich 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) oder einem reagenz an, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden.</li>
	<li>Resuspend-Zellpellets in 200 μL Färbepuffer + 7-AAD, hergestellt in Schritt 4.16 unter Verwendung einer 300 μL Mehrkanal-Mikropipette.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.</li>
</ol>5. Färbung einzelner oder gepoolter einzelner Anti-NKG2DL-Antikörper
<ol><li>Verwenden Sie dieselbe Zellsuspension wie in Schritt 4.2.</li>
	<li>100 μL der Zellsuspension mit einer 300 μL Mehrkanalpipette auf eine Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte übertragen und die Platte bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Bereiten Sie für jeden primären Antikörper oder gepoolte Antikörper einen Antikörper-Master-Mix vor (siehe Tabelle 2 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL resuspendiert werden.</li>
	<li>Fügen Sie die in Schritt 5.3 hergestellte Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für 25 minuten bei RT.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellkultur 96-Well-U-Bodenplatte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Antikörper-Master-Mix vor, indem Sie den sekundären Antikörper hinzufügen (siehe Tabelle 2 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung resuspendiert werden.</li>
	<li>Fügen Sie die in Schritt 5.9 vorbereitete Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.</li>
	<li>15 min bei RT oder 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.12 und 5.13.</li>
	<li>Resuspend Zellpellets in 200 μL Färbepuffer mit 7-AAD, hergestellt in Schritt 4.16.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät, wie in Schritt 6 beschrieben.</li>
</ol>6. Datenerfassung
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass wöchentliche Qualitätskontrollen des Durchflusszytometers durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Laser ordnungsgemäß funktionieren. Für das hier vorgestellte Protokoll wird ein wöchentlicher CtS-Prozess (Cytometer and Tracking) mit relativen Perlen durchgeführt, um die Laserleistung auf allen Kanälen zu überprüfen. Nach dem CTS werden 10.000 Ereignisse mit den 8-Peak-Perlen als interne Kontrolle aufgezeichnet. Alle Gipfel sollten sich in der gleichen Position innerhalb ihrer Tore befinden und gut voneinander getrennt sein.
<ol><li>Erzeugen Sie die Matrixkompensation, um die spektrale Überlappung zwischen Detektoren mit Perlen oder mit Zellen16zu subtrahieren.</li>
	<li>Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse für die nicht gefärbten Zellen und die einzelnen gefärbten Perlen auf. Für die Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) zeichnen Sie 50.000 Ereignisse auf und für die vollständig gefärbten Proben bis zu 100.000 Ereignisse auf. HINWEIS: Alternativ können einzelne gefärbte Proben an den Zellen durchgeführt werden. Wenn ja, stellen Sie sicher, dass die Zellen ein positives Signal für den gewünschten Marker haben.</li>
	<li>Erwerben Sie eine einzelne gefärbte Zell- oder Perlenprobe für jedes Fluorophor, das im Experiment verwendet wird, um die Menge der spektralen Überlappung aufzudecken. Verwenden Sie den Kompensationsersteller des Durchflusszytometriegeräts, um Spillover-Werte zu berechnen und die Kompensationsmatrix auf alle gemessenen Proben anzuwenden. HINWEIS: Sekundäre Antikörper können nicht für die Kompensationserstellung mit Perlen verwendet werden, wenn die Kompensation mit Perlen berechnet wird. Je nach Art der Kompensationsperlen können sekundäre Antikörper nicht für die Kompensation mit Perlen verwendet werden.</li>
	<li>Für die FMO-Kontrollen und die vollständig gefärbten Proben mit dem Fusionsprotein wählen Sie zunächst die Zellen basierend auf ihrer Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) aus. Nach dem Ausschluss von Duplätten die Zellen basierend auf ihrer Negativität für das 7-AAD-Signal (PercP-Cy5.5) ein, um die toten Zellen auszuschließen (siehe Schritt 5.15). Das letzte Diagramm zeigt den Ausdruck von CD34 (Y-Achse) und NKG2DL (X-Achse) auf lebenden Singustücken.</li>
	<li>Wenden Sie für die einzelnen Anti-NKG2DL-Antikörper die gleiche Strategie auf die Proben an, beachten Sie jedoch, dass die Ligandenpositivität in Alexa Fluor 488 und nicht im PE-Kanal liegt.</li>
	<li>Passen Sie die Gatter entsprechend den FMO-Steuerungen für die Gating-Strategie aus schritt 6.4 und 6.5 (siehe Tabelle 3)an, um geeignete FMO-Kontrollen für dieses Experiment durchzuführen: Zeichnen Sie in der Analysesoftware ein Tor auf die negative Fraktion. Während der Aufzeichnung der vollständig gefärbten Probe sind die Zellen über dem zuvor erzeugten Gate positiv für den analysierten Marker.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Methoden vor, die die NKG2DL-Oberflächenexpression auf menschlichen primären AML-Zellen nachweisen können. Wir zeigen, dass beide Nachweismethoden in Verbindung mit anderen Antikörperfärbungen (z.B. Nachweis der CD34-Expression) eingesetzt werden können. Ähnliche Färbungen können auch an anderen primären Zelltypen und Zelllinien durchgeführt werden.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Fehlen von NKG2DL auf der Oberfläche von AML-Patientenblasten L...

NK-Zellen sind wichtige Effektoren des angeborenen Immunsystems, die bösartige Zellen oder gestresste gesunde Zellen (z.B. durch eine Virusinfektion) ohne vorherige Antigenstimulation erkennen und eliminieren können1. Dieser Prozess wird durch ein komplexes Repertoire an aktivierenden Rezeptoren – wie natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCRs), NKG2D und CD16 – und inhibitorische Rezeptoren, die weitgehend durch Killer-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs) repräsentiert werden, streng reguliert2. Die Bindung von KIRs an humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse-I-Moleküle auf somatischen Zellen gewährleistet die Selbsterkennung und vermittelt NK-Zelltoleranz. Auf der anderen Seite lösen das Fehlen von Selbsterkennung und die erhöhte Bindung von aktivierenden Rezeptoren an ihre Liganden auf den Zielzellen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die zu einer NK-zellvermittelten Zytotoxizität führen1. Schließlich können NK-Zellen eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ausüben, indem sie den aktivierenden Rezeptor CD16 an Ziele binden, die den Fc-Anteil von Ig (FcR)2exprimieren. Neben der direkten Zytotoxizität können NK-Zellen auch die Zytokinfreisetzung auslösen, die das Angeborene mit dem adaptiven Immunsystem überbrückt3.
NKG2D ist ein wichtiger aktivierender Rezeptor, der auf NK-, NKT-, γδ T- und naiven CD8+ T-Zellen4 exprimiert wird und es solchen zytotoxischen Immunzellen ermöglicht, NKG2D-Liganden (NKG2DL) exprimierende Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Gesunde Zellen exprimieren normalerweise kein NKG2DL. Stattdessen wird die NKG2DL-Expression auf bösartigen oder virusinfizierten Zellen hochreguliert, um diese für die Immunclearance 5 zuverbessern.
Die humane NKG2DL-Familie umfasst acht bekannte Moleküle, darunter die beiden MHC-I-Kettenmoleküle A und B (MICA und MICB6)und die Cytomegalievirus UL16-bindenden Proteine 1–6 (ULBP1-67). Die Expression von NKG2DL wird auf der transkriptionellen, posttranskriptionellen sowie post-translationalen Ebene8reguliert. Während die NKG2DL-Expression auf der Oberfläche gesunder Zellen normalerweise nicht nachweisbar ist, wurden NKG2DL mRNA9 und intrazelluläre Proteinexpression in gesunden Geweben berichtet. Die funktionelle Relevanz eines solchen Ausdrucks und die Mechanismen, die solchen abweichenden Ausdrucksmustern zugrunde liegen, müssen noch definiert werden10.
Die mechanistische Regulation der NKG2DL-Expression in den Krebszellen ist ein faszinierendes Untersuchungsgebiet. Signalwege, von denen bekannt ist, dass sie entweder an zellulärem Stress beteiligt sind, z. B. der Hitzeschockstressweg9,oder DNA-schadensbedingte Signalwege, wie der Ataxie-Teleangiektasie-mutierte (ATM) und Rad3-assoziierte (ATR) Weg11,sowie virale oder bakterielle Infektionen wurden direkt mit der Induktion der NKG2DL-Expression12in Verbindung gebracht. Aber selbst wenn die Oberflächenexpression von NKG2DL effektiv induziert wurde, kann diese Expression durch proteolytisch vermittelte Ausscheidung wieder verloren gehen, ein Mechanismus, der bei einigen Krebsarten mit Immunentwehung und schlechter klinischer Prognose verbunden ist13.
Das Fehlen von Zelloberflächen-NKG2DL kann auch bei Patienten mit AML eine wichtige Rolle spielen. Hier induziert die Behandlung mit intensiver Chemotherapie oft eine Remission, aber ein Rückfall tritt häufig aus leukämischen Stammzellen (LSC) auf, die Chemotherapien selektiv überleben und der Immunantwort entgehen. Wie wir kürzlich gezeigt haben, entgehen LSCs beispielsweise der NK-Zelllyse, indem sie die NKG2DL-Oberflächenexpression14unterdrücken.
Umgekehrt kann das Fehlen einer Oberflächen-NKG2DL-Expression als Methode verwendet werden, um mutmaßliche stammähnliche Subpopulationen von Zellen aus leukämischen Subpopulationen zu identifizieren und kämisch zu isolieren. Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Ansätze vor, mit denen die NKG2DL-Oberflächenexpression nachgewiesen und damit NKG2DL-negative Stammzellen bei Leukämie und vielleicht auch bei anderen Krebsarten identifiziert werden können: Eine Methode zur Panliganden-Oberflächenerkennung und eine Methode zur Färbung mit einzelnen oder gepoolten Antikörpern, die einzelne bekannte NKG2DL-Proteine erkennen.

<table><tbody><tr><td>7-Amminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>96 Well Plate U bottom</td><td>Sarstedt</td><td>833925500</td><td>96 Well Plate für unser Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human cd34</td><td>BD</td><td>555824</td><td>Antikörpernachweis CD34 RRID: AB_398614</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1391,0050</td><td>Bestandteil der Färbung Puffer</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td>Bestandteil des Färbepuffers</td></tr><tr><td>Fetales Kälberserum (FCS)</td><td>BioConcept</td><td>2-01F10-I</td><td>Bestandteil des supplementierten RPMI-Mediums</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>BD</td><td>/</td><td>Software zur Datenanalyse für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21222</td><td>Sekundärer Antikörper zum Nachweis der primären Antikörper für MICA und MICB RRID: AB_1037853</td></tr><tr><td>Humanes NKG2D Fc Chimera Protein, CF</td><td>R& D</td><td>1299-NK-050</td><td>Fusionsprotein zum Nachweis aller NKG2DLs RRID:</td></tr><tr><td>Human ULBP-1 Antikörper</td><td>R& D</td><td>AF1380</td><td>Antikörper zum Nachweis von ULBP1 RRID: AB_354765</td></tr><tr><td>humane ULBP-2/5/6 Antikörper</td><td>R& D</td><td>AF1298</td><td>Antikörper zum Nachweis von ULBP2/5/6 RRID: AB_354725</td></tr><tr><td>humane ULBP-3 Antikörper</td><td>R& D</td><td>AF1517</td><td>Antikörpernachweis ULBP3 RRID: AB_354835</td></tr><tr><td>MICA Polyklonaler Antikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-35346</td><td>Antikörpernachweis MICA RRID: AB_2552656</td></tr><tr><td>MICB Polyklonaler Antikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-66698</td><td>Antikörpernachweis MICB RRID: AB_2663413</td></tr><tr><td>Einstufiges Antikörper-Biotinylierungskit 1 Streifen, für 8 Reaktionen</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-093-385</td><td>Biotinylierungskit für das NKG2DL-Fusionsprotein</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Bestandteil des Färbepuffers</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Ziegen-IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11034</td><td>Sekundärantikörper zum Nachweis der primären Antikörper für die ULBPs RRID: AB_2576217</td></tr><tr><td>Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3,0 um</td><td>Spherotech Inc.</td><td>RCP-30-20A</td><td>Kügelchen für die Wartung von Durchflusszytometriegeräten</td></tr><tr><td>RPMI-Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>RayBright Universal-Kompensationsperlen</td><td>Raybiotech</td><td>137-00013-100</td><td>Kügelchen zur Herstellung der Kompensationsmatrix</td></tr><tr><td>Streptavidin, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE) - 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>S866</td><td>Zweiter Schritt für den Nachweis des biotinylierten NKG2DL-Fusionsproteins</td></tr></tbody></table>

zwei durchflusszytometrische ansätze der nkg2d-ligandenoberflächendetektion zur unterscheidung von stammzellen von massensubpopulationen bei akuter myeloischer leukämie

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Innerhalb desselben Patienten wurde gezeigt, dass das Fehlen einer Oberflächenexpression von NKG2D-Liganden (NKG2DL) leukämische Subpopulationen mit Stammzelleigenschaften (sogenannte leukämische Stammzellen, LSCs) von differenzierteren leukämischen Gegenstückzellen unterscheidet, denen das Krankheitsinitiierungspotenzial fehlt, obwohl sie ähnliche leukämiespezifische genetische Mutationen aufweisen. NKG2DL sind biochemisch sehr vielfältige MHC-Klasse-I-ähnliche Selbstmoleküle. Gesunde Zellen unter homöostatischen Zuständen exprimieren im Allgemeinen kein NKG2DL auf der Zelloberfläche. Stattdessen wird die Expression dieser Liganden bei Exposition gegenüber zellulärem Stress (z. B. onkogene Transformation oder infektiöse Reize) induziert, um die Eliminierung geschädigter Zellen durch Lyse durch NKG2D-Rezeptor-exprimierende Immunzellen wie natürliche Killerzellen (NK) auszulösen. Interessanterweise wird die NKG2DL-Oberflächenexpression in LSC-Subpopulationen selektiv unterdrückt, so dass diese Zellen der NKG2D-vermittelten Immunüberwachung entgehen können. Hier präsentieren wir eine Parallelanalyse von zwei verschiedenen Durchflusszytometrie-Methoden, die die Untersuchung der NKG2DL-Oberflächenexpression auf Krebszellen ermöglichen, d.h. eine Methode mit Panligandenerkennung und eine Methode, bei der mit mehreren Antikörpern gegen einzelne Liganden gefärbt wird. Diese Methoden können verwendet werden, um lebensfähige NKG2DL-negative zelluläre Subpopulationen mit mutmaßlichen Krebsstammzelleigenschaften von NKG2DL-positiven Nicht-LSC-Eigenschaften zu trennen.

Beide hier vorgestellten Protokolle ermöglichen die Anreicherung von AML LSC durch durchflusszytometrische Analysen mit CD34, einem bekannten Marker von LSC17, in Kombination mit NKG2DL-Oberflächenexpression durch entweder unter Verwendung der Panligandenerkennung oder Färbung mit gepoolten Antikörpern gegen einzelne Liganden. In Abbildung 1zeigen wir, dass die analysierten AML-Proben positiv für CD34 und NKG2DL sind, aber auch negative Subpopulationen existieren, was...

Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Dieses Protokoll zeigt zwei verschiedene Möglichkeiten, NKG2DLs auf der Oberfläche von AML-Zellen zu erkennen. Die Technik bietet eine schnelle, benutzerfreundliche Färbemethode, um alle bekannten und möglicherweise unbekannten NKG2DLs zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Trennung von leukämischen Stammzellen von Massen-AML-Zellen, was es ermöglicht, diese Zellen weiter zu charakterisieren.Beginnen Sie mit dem Auftauen des Biotins und der NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur. Drehen Sie das NKG2D FC-Pulver schnell herunter, fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P-1000-Mikropipette. Fügen Sie 100 Mikroliter des NKG2DL-Fusionsproteins in eine Biotinröhre hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie die Lösung gründlich mit einer P-100-Mikropipette.Um die AML-Zellen aufzutauen, entfernen Sie das kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und legen Sie es sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist. Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das Medium, das das Röhrchen enthält, und spülen Sie die Durchstechflasche mit einem Milliliter Medium aus.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter resuspendiert.Dann 100 Mikroliter der Zellsuspension auf eine Zellkultur 96 Well U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung mit einer endgültigen NKG2D-Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter pro Vertiefung resuspendiert werden.Fügen Sie die vorbereitete Mastermischung hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 200 Mikroliter Pipette. Inkubieren und zentrifugieren Sie die Platte wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin PE vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern resuspendiert werden.Fügen Sie die Mastermischung zu den Zellen hinzu und resuspendieren Sie die Pellets mit einer 300 Mikroliter Mehrkanalpipette. Nachdem Sie die Platte zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie eine 300-Mikroliter-Mehrkanal-Mikropipette, um die Zellpellets in 200 Mikrolitern Färbepuffer plus 7-AAD wieder aufzubesiedeln. Dann analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.Die analysierten AML-Proben sind positiv für CD34 und NKG2DL, aber es gibt auch negative Subpopulationen mit insgesamt vier verschiedenen Populationen. Die typische Gating-Strategie beginnt mit der Auswahl der Hauptpopulation von Zellen über ihren FSC und SSC. Dubstoppeln und abgestorbene Zellen werden in der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen.Die Tore werden mit FMO-Kontrollen eingestellt, um eine ordnungsgemäße Identifizierung positiver Zellen zu gewährleisten. Die Fluoreszenzdichten von Zellen, die für CD34 im Vergleich zu NKG2DL positiv sind, werden hier hervorgehoben. AML-Zellen, die positiv für CD34 sind, zeigen eine geringere Oberflächenexpression von NKG2DL, was darauf hindeutet, dass die NKG2DL-Expression mit einem Mangel an Stammigkeit verbunden ist.Drei primäre AML-Proben zeigten 19,8, 49,8 und 89,4% positive Ereignisse für die Fusionsproteinfärbung gegenüber 20,4, 50,4 und 90,6% für die gepoolte Anti-NKG2DL-Antikörperfärbung. Auf der anderen Seite zeigte die Einzelligandenfärbung eine Reihe positiver Ereignisse von bis zu 92%, wobei die Prozentsätze je nach Liganden variierten. Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, beim Auftauen der primären AML-Zellen schnell zu sein, da sie zerbrechlich sind und während dieses Schritts leicht absterben können.Nach der Durchführung dieses Protokolls kann eine Zellsortierung basierend auf dem NKG2DL-Signal durchgeführt werden, um die Populationen weiter zu untersuchen.

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Wir bieten eine detaillierte Beschreibung eines Protokolls für die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenantigenen und/oder intrazellulären Antigenen in neuralen Zelltypen. Kritische Aspekte der Versuchsplanung, methodische Schritte und grundlegende Prinzipien der Durchflusszytometrie werden erläutert, um Neurobiologen in die Lage zu versetzen, diese leistungsstarke Technologie zu nutzen.

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

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Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Nachweis von minimal oder messbare Resterkrankung (MRD) ist eine wichtige prognostische Biomarker für die Verfeinerung der Risikobewertung und Vorhersage von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML). Diese umfassende Leitlinien und Empfehlungen mit best Practices für konsistente und genaue Identifizierung und Nachweis von MRD, können helfen, effektive Entscheidungen für AML-Behandlung.

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Hier präsentieren wir ein Fluss durchflusszytometrischen Protokoll um CD4 zu identifizieren+ und CD8+ T Zellen, γδ T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten im menschlichen peripheren Blut durch Verwendung von nur zwei Fluorochromes anstelle von sieben. Mit diesem Ansatz können fünf zusätzliche Markierungen auf den meisten fließen Cytometers aufgezeichnet werden.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

Erfahren Sie zwei durchflusszytometrische Methoden zur Detektion von NKG2D-Liganden auf AML-Zellen. Diese Techniken ermöglichen die Trennung leukämischer Stammzellen von Massenzellen für weitere Charakterisierung.

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie (Video) | JoVE Journal

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

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