Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie
21. Februar 2021
Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.
Dieses Protokoll zeigt zwei verschiedene Möglichkeiten, NKG2DLs auf der Oberfläche von AML-Zellen zu erkennen. Die Technik bietet eine schnelle, benutzerfreundliche Färbemethode, um alle bekannten und möglicherweise unbekannten NKG2DLs zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Trennung von leukämischen Stammzellen von Massen-AML-Zellen, was es ermöglicht, diese Zellen weiter zu charakterisieren.
Beginnen Sie mit dem Auftauen des Biotins und der NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur. Drehen Sie das NKG2D FC-Pulver schnell herunter, fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P-1000-Mikropipette. Fügen Sie 100 Mikroliter des NKG2DL-Fusionsproteins in eine Biotinröhre hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie die Lösung gründlich mit einer P-100-Mikropipette.
Um die AML-Zellen aufzutauen, entfernen Sie das kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und legen Sie es sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist. Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das Medium, das das Röhrchen enthält, und spülen Sie die Durchstechflasche mit einem Milliliter Medium aus.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter resuspendiert.
Dann 100 Mikroliter der Zellsuspension auf eine Zellkultur 96 Well U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Vertiefung mit einer endgültigen NKG2D-Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter pro Vertiefung resuspendiert werden.
Fügen Sie die vorbereitete Mastermischung hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 200 Mikroliter Pipette. Inkubieren und zentrifugieren Sie die Platte wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin PE vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern resuspendiert werden.
Fügen Sie die Mastermischung zu den Zellen hinzu und resuspendieren Sie die Pellets mit einer 300 Mikroliter Mehrkanalpipette. Nachdem Sie die Platte zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie eine 300-Mikroliter-Mehrkanal-Mikropipette, um die Zellpellets in 200 Mikrolitern Färbepuffer plus 7-AAD wieder aufzubesiedeln. Dann analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.
Die analysierten AML-Proben sind positiv für CD34 und NKG2DL, aber es gibt auch negative Subpopulationen mit insgesamt vier verschiedenen Populationen. Die typische Gating-Strategie beginnt mit der Auswahl der Hauptpopulation von Zellen über ihren FSC und SSC. Dubstoppeln und abgestorbene Zellen werden in der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen.
Die Tore werden mit FMO-Kontrollen eingestellt, um eine ordnungsgemäße Identifizierung positiver Zellen zu gewährleisten. Die Fluoreszenzdichten von Zellen, die für CD34 im Vergleich zu NKG2DL positiv sind, werden hier hervorgehoben. AML-Zellen, die positiv für CD34 sind, zeigen eine geringere Oberflächenexpression von NKG2DL, was darauf hindeutet, dass die NKG2DL-Expression mit einem Mangel an Stammigkeit verbunden ist.
Drei primäre AML-Proben zeigten 19,8, 49,8 und 89,4% positive Ereignisse für die Fusionsproteinfärbung gegenüber 20,4, 50,4 und 90,6% für die gepoolte Anti-NKG2DL-Antikörperfärbung. Auf der anderen Seite zeigte die Einzelligandenfärbung eine Reihe positiver Ereignisse von bis zu 92%, wobei die Prozentsätze je nach Liganden variierten. Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, beim Auftauen der primären AML-Zellen schnell zu sein, da sie zerbrechlich sind und während dieses Schritts leicht absterben können.
Nach der Durchführung dieses Protokolls kann eine Zellsortierung basierend auf dem NKG2DL-Signal durchgeführt werden, um die Populationen weiter zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt zwei unterschiedliche Färbemethoden zur Detektion von NKG2D-Liganden (NKG2DLs) an humanen primären Proben der akuten myeloischen Leukämie (AML) vor. Die Techniken ermöglichen die Abtrennung leukämischer Stammzellen von AML-Massenzellen zur weiteren Charakterisierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Onkologie
Hintergrund
- NKG2D-Liganden sind wichtig für die Immunerkennung bei Krebs.
- Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt Herausforderungen bei der Zellcharakterisierung dar.
- Aktuelle Methoden können leukämische Stammzellen möglicherweise nicht effektiv unterscheiden.
- Neue Färbeprotokolle können die Nachweismöglichkeiten verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung effizienter Färbeprotokolle zum Nachweis von NKG2DL.
- Erleichterung der Trennung leukämischer Stammzellen von AML-Massenzellen.
- Verbesserung der Charakterisierung von AML-Proben.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Fusionsproteins zur Erkennung von NKG2DLs.
- Anwendung mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper.
- Auftauen und Rekonstituieren von Biotin und NKG2D-Fusionsprotein.
- Lösungen mischen, um gewünschte Konzentrationen für die Färbung zu erreichen.
Hauptergebnisse
- Beide Protokolle detektieren wirksam bekannte und unbekannte NKG2DLs.
- Die Trennung leukämischer Stammzellen von AML-Massenzellen wird erreicht.
- Die Methoden sind benutzerfreundlich und schnell.
- Eine verbesserte Charakterisierung von AML-Zellen ist möglich.
Schlussfolgerungen
- Neue Färbeprotokolle verbessern den Nachweis von NKG2DLs.
- Diese Methoden können zum Verständnis der AML-Biologie beitragen.
- Weitere Forschungsarbeiten können auf diesen Techniken aufbauen, um therapeutische Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Unterscheidung von leukämischen Stammzellen von der Gesamtpopulation der AML bleibt eine entscheidende Herausforderung bei der Zielvalidierung und der Entwicklung präklinischer Modelle. Die Möglichkeit, NKG2DL-negative Subpopulationen mit Stammzell-Eigenschaften zu isolieren, ermöglicht eine mechanistische Entschärfung therapeutischer Hypothesen und stützt die Vorhersagekraft in frühen Entdeckungsarbeitsabläufen. Dieser Ansatz liefert direkte Hinweise für die Portfolio-Priorisierung, indem er krankheitsrelevante Systeme mit höherem tumorigenen Potenzial identifiziert.
Strategische Anwendungen in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Isolierung leukämischer Stammzellen basierend auf der Oberflächenexpression von NKG2DL.
- Operativer Wert: Bietet eine schnelle, benutzerfreundliche Methode, stammzellähnliche Subpopulationen von differenzierten AML-Zellen zu unterscheiden.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Risiken durch funktionelle Validierung der Stammzelleigenschaften in NKG2DL-negativen Fraktionen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Durchflusszytometrie-Daten, um die Expression von NKG2DL bei ligandenspezifischen und pan-ligand-spezifischen Färbemethoden zu vergleichen.
- Operationaler Wert: Bietet reproduzierbare, standardisierte Färbeprotokolle, die mit der Vorbereitung von Hochdurchsatz-Screenings kompatibel sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Verbindungsscreenings und Untersuchungen zur Targetbindung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die translationale Biomarker-Abstimmung, indem die Unterdrückung von NKG2DL mit Mechanismen der Immunflucht bei LSCs verknüpft wird.
- Operativer Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Isolierung krankheitsinitiierender Zellen ermöglicht wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen in präklinische Modelle, indem der NKG2DL-Status genutzt wird, um AML-Teilpopulationen mit unterschiedlichem Tumorigenitätspotenzial zu stratifizieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Bewertung, indem sie die Isolierung mechanistisch definierter Teilpopulationen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Trennung von NKG2DL-negativen LSCs von NKG2DL-positiven AML-Massenzellen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, quantitative Oberflächendetektion, die mit auf Durchflusszytometrie basierenden Screening-Plattformen kompatibel ist.
- Analytik: Bietet quantitative Messungen der abhängigen Variablen (Prozentzahl positiver Ereignisse, Fluoreszenzintensität) und ermöglicht den Vergleich von Färbemethoden sowie Häufigkeiten von Teilpopulationen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie die Isolierung von LSCs für die funktionelle Validierung in krankheitsrelevanten Modellen ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Methode zur Anreicherung von Stammzellen, die auf verschiedene AML-Proben anwendbar ist und auf andere Krebsarten mit ähnlichen Mechanismen der Immunflucht angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Anreicherung von Stammzellen, Verringerung mechanistischer Unschärfen bei der Identifizierung von LSCs.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der NKG2DL-Detektion über mehrere AML-Proben hinweg.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen bei der Target-Validierung, Kapital-Effizienz durch frühes Risikomanagement, reduziertes biologisches Risiko in späteren Phasen.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf dem LSC-Anreicherungspotential und dem Phänotyp der Immunflucht.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt Fachkenntnisse in der Durchflusszytometrie, Zellfärbung und im Umgang mit primären AML-Proben.
- Hängt von der Verfügbarkeit von Durchflusszytometern, Zentrifugiergeräten und Reagenzien ab, einschließlich Biotin, NKG2D-Fusionsprotein, Streptavidin-PE und 7-AAD.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Gating-Strategien, FMO-Kontrollen und Kompensationseinstellungen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Erfordert Anpassungen bei der Anwendung auf verschiedene Modellsysteme aufgrund der Variabilität der NKG2DL-Expressionsmuster.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Empfindlichkeit primärer AML-Zellen beim Auftauen, was eine schnelle Verarbeitung zur Erhaltung der Vitalität notwendig macht.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
