Name: Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie eine computerbasierte Bildanalysemethode zur präzisen Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell. Dieses Protokoll reduziert menschliche Zählfehler und liefert schnellere, konsistentere Ergebnisse für die präklinische Krebsforschung.

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Diese Arbeit wurde vom Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), dem Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) und den National Institutes of Health R21EB028429 (IA) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Virginia Tech und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Die Durchführung dieses Protokolls erfordert die Genehmigung der zuständigen Institutionen und die Einhaltung aller geeigneten Richtlinien.
1. Zellkultur
<ol><li>Machen Sie komplette Kulturmedien (RPMI + 10% Fetal Bovine Serum +1% Pen Strep). 4T1-Zellen gemäß ATCC-Protokoll10 beleben und bei 37 °C und 5%CO2 in einem T-25-Kolben bis zum Einfluss inkubieren. Ändern Sie die Medien am Tag nach der Wiederbelebung, um abgestorbene Zellen zu entfernen, und wieder, wenn Medien verbraucht werden, bevor Zellen konfluent genug sind, um sie zu durchziehen.</li>
	<li>Sobald der T-25-Kolben konfluent ist, durchführen Zellen zu einem T-75-Kolben durch Wegwerfen von Medien, Waschen Kolben mit 5 ml 1x Dulbecco Phosphat gepufferte Saline (DPBS), und Hinzufügen von 500 L Trypsin-EDTA. 5-10 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.<ol>
<li>Nach dem Lösen fügen Sie den Zellen 5 ml erwärmte komplette Kulturmedien hinzu. Aspirieren und übertragen Sie den 5 ml auf einen T-75-Kolben mit 15 ml erwärmten kompletten Kulturmedien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchgangszellen in T-75-Flaschen mindestens viermal. Tun Sie dies, sobald der Kolben konfluent ist, indem Sie mit 8 ml 1x DPBS waschen, 1 ml Trypsin-EDTA zum Lösen von Zellen hinzufügen, 10 ml erwärmte Medien zu zellen hinzufügen und 1:6-1:8 in einen neuen T-75-Kolben verdünnen, der 20 ml erwärmte komplette Kulturmedien enthält.</li>
	<li>Durchgangszellen bis zur entsprechenden Anzahl von T-150-Kolben, die 40 ml erwärmte komplette Kulturmedien enthalten, für die Anzahl der zu injizierenden Mäuse. Die meisten Studien erfordern mehrere T-150-Flaschen, um genügend Zellen für die Injektion zu gewährleisten.</li>
	<li>Wenn Mäuse bereit sind, injiziert zu werden (8 Wochen alt oder mit einem Gewicht von mehr als 20 g, abhängig von den IACUC oder institutionellen Protokollen), Ernten Sie Zellen durch Dasverworfene Medien, waschen Sie jeden Kolben mit 10 ml 1x DPBS und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA hinzu. 5-10 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.</li>
	<li>Kolben mit 10 ml kompletter Medien waschen und alle Inhalte (10 ml Medien + 2 ml Trypsin-EDTA-Zellmischung) auf den nächsten Kolben übertragen. Fahren Sie fort, Zellen aus jedem Kolben mit den gleichen 10 ml Medien zu waschen und zu sammeln, um eine übermäßige Menge an Medien zu vermeiden.<ol>
<li>Sobald alle Kolben gesammelt sind, übertragen Sie den Inhalt in ein 50 ml Zentrifugenrohr. Sammeln Sie eine 10-L-Probe für die Zählung in einem Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie das 50 ml konische Rohr bei 125 x g für 5 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Während Zellen zentrifugiert werden, fügen Sie 10 L Trypan blau zu 10 l Zellprobe hinzu. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Sobald die Gesamtzahl der Zellen bestimmt ist, berechnen Sie die Konzentration der Zellen, die benötigt werden, um Mäuse für 1,2 x 106 Zellen pro Maus (pro 100 L) zu injizieren.</li>
	<li>Nach Zentrifugation, Dekantmedien und Resuspend zellpellet in der richtigen Menge an sterilen 1x DPBS für 1,2 x 106 Zellen pro 100 l. Zelle/DPBS-Mischung in Mikrozentrifugenröhrchen teilen, um mit der Spritze bei der Injektion von Zellen leicht zugänglich zu sein. Halten Sie Zellen auf Eis und injizieren Sie bald danach, da die Zellen beginnen zu sterben, nachdem sie für längere Zeit auf Eis sind.</li>
</ol>2. Injektionen
<ol><li>Bereiten Sie Zellen für die Injektion vor, indem Sie das Mikrozentrifugenrohr tippen oder sanft mischen, um die Zellen wieder aufzuhängen, und dann 600 l in eine 1 ml Spritze aspirieren. Drehen Sie die Spritze nach oben und ziehen Sie den Kolben nach unten, um zellenfern von der Spritzenöffnung zu bringen. Tippen Sie auf die Spritze, um sie von Luftblasen zu befreien.</li>
	<li>Befestigen Sie die Nadel ab und geben Sie die Zellen wieder in das Mikrozentrifugenrohr, bis nur noch 500 l in der Spritze verbleiben. Spritze flach auf Eis legen. HINWEIS: 4T1-Zellen fallen schnell aus der Suspension. Daher ist es wichtig, Zellen durch häufiges Tippen wieder in die Suspension zu mischen.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie 8 Wochen alt/>20 g weibliche BALB/c Maus mit Isofluran oder einem anderen zugelassenen Anästhetikum. Überwachen Sie die Atmung der Maus, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen.</li>
	<li>Sobald die Maus richtig anästhetisiert ist, wie durch mangels Hornhautreflex angezeigt, legen Sie die Maus auf den Rücken. Halten Sie mit Daumen, Zeiger und Mittelfinger die Maus vorsichtig gedrückt. Verwenden Sie den Zeiger und den Mittelfinger, um den Oberkörper und Daumen der Maus für das hintere linke Bein zu halten. Seien Sie sanft, aber fest.</li>
	<li>Mit der Abschrägung der Nadel nach oben, injizieren Sie 100 L Zellen subkutan in die linke Bauchbrust Fettpolster der Maus. Überwachen Sie eine gute Bleb und alle Leckagen, und stellen Sie sicher, dass die Maus aufwacht und bewegt sich leicht nach der Injektion.<ol>
<li>Ändern Sie die Nadeln zwischen jeder Maus. HINWEIS: Lassen Sie die Nadel nicht in die Peritonealhöhle gelangen. Dies würde dazu führen, dass sich der Krebs schnell ausbreitet und nicht repräsentativ für das Modell ist. Um eine subkutane Injektion zu gewährleisten, ziehen Sie vorsichtig nach oben auf der Nadel, wenn sie in das linke Bauchfettpolster eingesetzt wird. Wenn die Nadel leicht nach oben gehoben wird, wird sie subkutan positioniert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Überwachung
<ol><li>Überwachen Sie Mäuse mindestens 3 mal pro Woche auf Gewicht, Körperzustandsbewertung, Tumorgröße, Tumorzustand, Atmung, Aktivitätsniveau, Aussehen und Bewegung. Sobald der Tumor einen Durchmesser von 0,7-0,8 cm erreicht hat, beginnen Sie täglich zu überwachen.<ol>
<li>Betrachten Sie Euthanasie, wenn die Tumorgröße 1,5 cm erreicht, oder Gewichtsverlust erreicht 20%, oder schwere klinische Abnahme des Körperzustands Score, Tumorzustand, Atmung, Aktivitätsniveau, Aussehen, oder Bewegung werden auf der Grundlage institutioneller Richtlinien beobachtet. HINWEIS: Körperzustand Score ist entscheidend zu überwachen, wie Körpergewicht kann zu erhöhen, wie der Tumor in der Größe zunimmt, Negieren Körperzustand Verlust aufgrund von Krankheitsbelastung. Genaue Überwachungsprotokolle hängen von den zugelassenen IACUC- oder institutionellen Protokollen ab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Nekropsie
<ol><li>Euthanisieren Sie die Maus mit CO2 nach den institutionellen Richtlinien.</li>
	<li>Sprühmaus mit 70% Ethanol zum Desinfizieren. Machen Sie einen Schnitt bis zur ventralen Mittellinie der Maus, um die Körperhöhle freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Niere. Schneiden Sie die Mittellinie weiter, bis die Membran sichtbar ist. Verwenden Sie eine Schere, um das Zwerchfell zu punktieren, um die Lunge zu entschärfen. Trimmen Sie die Membran, um einen besseren Zugang zum Hohlraum zu erhalten.</li>
	<li>Verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Mitte des Brustkorbs zu schneiden. Pin Brustkorb zurück, um die Lunge und das Herz zu belichten.</li>
	<li>Durchdringen Sie das Herz mit 2 ml nicht-sterilen 1x DPBS, indem Sie eine Nadel in die Spitze des Herzens einsetzen, bis sie sich in der Bauchhöhle, in der die Niere entfernt wurde, einschwimmt.</li>
	<li>Um das Herz und die Lunge zu entfernen, verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Speiseröhre und Luftröhre direkt über dem Herzen zu schneiden. Mit Zange, beginnen, das Herz weg aus dem Körper zu ziehen und schneiden Sie an jedem Bindegewebe halten es befestigt. Die Lunge wird mit dem Herzen herauskommen.</li>
	<li>Identifizieren Sie die mehrlappige (rechte) und einlappige (linke) Lunge. Halten Sie das Herz zur Referenz befestigt, aber sobald die Lunge identifiziert ist, schneiden Sie das Herz weg.</li>
	<li>Beschriften Sie eine 12 Wellplatte mit 1x Hank es Balanced Saline Solution (HBSS) in jedem Brunnen. Jede Maus benötigt 2 Brunnen. Legen Sie die mehrlappige (rechte) Lunge zur Metastasenauswertung in die 12-Well-Platte und halten Sie sie auf Eis. Halten Sie den benachbarten Brunnen vorerst leer. HINWEIS: Es ist wichtig, dieselbe Lunge (mehrlappige) von jeder Maus zu verwenden, um sicherzustellen, dass jede Probe nahe ist. Die einlappende Lunge kann dann für andere Analysen wie Histopathologie verwendet werden. HINWEIS: Die Proben sind auf Eis oder bei 4 °C für einige Stunden stabil.</li>
</ol>5. Verarbeitung von Geweben
HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt sollten mit steriler Technik durchgeführt werden.
<ol><li>Etikett ieren 1 15 ml konische Röhre pro Maus und fügen Sie 2,5 ml Typ IV Kollagennase-Mischung und 30 Einheiten Elastase zu jedem Rohr. Um Typ IV Kollagennase-Gemisch zu machen, lösen Sie 2 mg Typ IV Kollagennase pro ml 1x HBSS und sterilen Filter auf. Diese kann bis zu 12 Monate bei -20 °C gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Lunge auf die zweite, saubere 1x HBSS gut für diese Probe. Wirbeln Sie mit Zangen, um restliches Blut zu entfernen. Saubere Lunge auf leere 3,5 cm Gewebekulturplatte übertragen. Hacken Lunge mit Schere. Spülplatte mit 2,5 ml 1x HBSS, 1x HBSS und Lungenstücke in ein 15 ml konisches Rohr übertragen, das bereits Kollagennase/Elastase-Cocktail enthält (5 ml insgesamt).</li>
	<li>75 Minuten bei 4 °C inkubieren. Mischen Sie während dieser Zeit die Proben weiter, platzieren Sie daher Rohre auf einer Wippe oder einem rotierenden Rad. Beschriften Sie während dieses Inkubationsschritts 50 ml Zentrifugenröhrchen und 10 cm Gewebekulturplatten für jede Maus. Wenn Sie eine Verdünnung machen, beschriften Sie genügend 10 cm Gewebekulturplatten für die Verdünnungen. HINWEIS: Beschriften Sie den Deckel der Gewebekulturplatten. Wenn die Platte selbst beschriftet wird, wird die Schrift die Fidschi-ImageJ-Analyse stören.</li>
	<li>Bringen Sie volumenjedes Rohr bis zu 10 ml insgesamt mit 1x HBSS. Gießen Sie den Inhalt über ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr für jede Probe. Verwenden Sie den Kolben einer 1 ml Spritze, um die Probe vorsichtig durch das Sieb zu schleifen, damit mehr Zellen durchfiltern können.</li>
	<li>Zentrifuge für 5 Minuten bei 350 x g bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und waschen Pellet mit 10 ml 1x HBSS. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
	<li>Resuspend Pellet in 10 ml von 60 'M 6TG komplette Kulturmedien, entweder RPMI oder IMDM. Plattenproben in 10 cm Zellkulturplatten, falls gewünscht, mit einem Verdünnungsschema. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 5 Tage. ANMERKUNG: 1:2, 1:10 und 1:100 sind häufige Verdünnungen, die empirisch anhand von Studienparametern bestimmt werden müssen. VORSICHT: 6TG ist giftig. Seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und befolgen Sie alle Richtlinien für die Umweltsicherheit und -sicherheit für die Entsorgung.</li>
</ol>6. Färbplatten
<ol><li>Gießen Sie Kulturmedien von Platten in entsprechende Abfallbehälter. FixZellen durch Zugabe von 5 ml unverdünntem Methanol pro Platte und inkubieren für 5 Minuten bei RT, um sicherzustellen, dass Methanol zu wirbeln, so dass es die gesamte Platte bedeckt. VORSICHT: Methanol ist gefährlich, wenn es aufgenommen, eingeatmet oder auf der Haut ist. Verwenden Sie eine Dunstabzugshaube für diesen Schritt.</li>
	<li>Methanol von Platten in entsprechende Abfallbehälter gießen. Spülen Sie Platten mit 5 ml destilliertem Wasser pro Platte und gießen Sie Wasser in entsprechende Abfallbehälter. Fügen Sie 5 ml 0,03% Methylenblau pro Platte hinzu und brüten 5 Minuten bei RT, um sicherzustellen, dass Methylenblaulösung so gewirbelt wird, dass sie die gesamte Platte bedeckt.</li>
	<li>Methylenblau in entsprechenden Abfallbehälter gießen. Spülen Sie die Platten wieder mit 5 ml destilliertem Wasser pro Platte. Drehen Sie Platten auf den Kopf und bloten Sie gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Platte auf den Deckel legen und die Luft über Nacht bei RT trocknen lassen. HINWEIS: Metastasierende Kolonien werden blau sein. Sobald die Platten getrocknet sind, können sie bei RT auf unbestimmte Zeit gelagert werden.</li>
</ol>7. Bildanalyse
<ol><li>Entfernen Sie beschriftete Deckel von den Platten, wobei Sie auf eine eindeutige Identifizierung der Proben achten. Richten Sie alle gefärbten Lungenplatten auf einer sauberen, hellen Oberfläche aus, um ein Bild aller Platten in einem Bild zu machen.</li>
	<li>Machen Sie ein Bild von der Sammlung von Platten in einem gut beleuchteten Bereich, um reflexionen zu minimieren, da die Platten sehr reflektierend sind. Reflexionen in den Platten beeinflussen die Bildanalyse und müssen daher vermieden werden. HINWEIS: Fidschi-ImageJ hat eine Obergrenze von 2 Gigapixeln. Die meisten modernen Smartphones werden über genügend Kameras verfügen. Verwenden Sie keine Kamera mit weniger als 8 Megapixeln. Die Kamera, die in diesem Experiment verwendet wurde, war ein 12,2 Megapixel auf einem Google Pixel 2.</li>
	<li>Schneiden Sie das Bild zu, um die Platten einzuschließen, schließen Sie jedoch die Deckel oder irgendetwas anderes im Hintergrund des Bildes aus. Laden Sie das zugeschnittene Bild in Fiji-ImageJ hoch.</li>
	<li>Ändern Sie das Bild mit den folgenden Befehlen in Schwarzweiß: Bild, Anpassen, Farbschwellenwert, Schwellenwertmethode: Standard, Schwellenwertfarbe: B&W, Schwellenwertbereich: Lab. Deaktivieren Sie das Feld Dunkles Hintergrund. Das Bild sollte nun schwarz und weiß sein. Schwarz stellt den hellen Hintergrund dar, und Weiß stellt die blauen metastasierenden Kolonien dar.</li>
	<li>Wählen Sie mit dem Werkzeug Kreis auf der Symbolleiste Fidschi-ImageJ den zu analysierenden Bereich aus. Zeichnen Sie einen Kreis, der für alle Platten verwendet werden soll, um sicherzustellen, dass jede Platte für die gleiche Größe analysiert wird. Wählen Sie eine Größe aus, die den analysierten Bereich auf den Platten maximiert und gleichzeitig das Hintergrundrauschen minimiert, das am Rand der Platten angezeigt wird. Die Größe wird in der Symbolleiste angezeigt, während sie gezeichnet wird, so dass es möglich ist, einen perfekten Kreis zu bilden, indem Sie die Höhe und die Breite überwachen, während der Kreis gezeichnet wird.</li>
	<li>Analysieren Sie den ausgewählten Kreis, um zu bestimmen, welcher Prozentsatz der Fläche weiß ist, der die Fläche der Platte darstellt, die blaue metastasierende Kolonien hat. Verwenden Sie die folgenden Befehle: Analysieren, Analysieren von Partikeln, Größe (Pixel2):0-Infinity, Zirkularität: 0.00-1.00, Anzeigen: Nichts, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zusammenfassen. Klicken Sie auf OK.</li>
	<li>Zeichnen Sie das Ergebnis %Fläche auf. Dies ist der Prozentsatz des ausgewählten Bereichs, der weiß ist, und stellt daher die metastasierende Belastung dar. HINWEIS: Es wird empfohlen, entweder die Ergebnisse in Fiji-ImageJ zu speichern oder die gesamte Ergebnisseite in ein separates Dokument zu kopieren/einzufügen. Wenn % Flächenergebnisse unerwartet oder verdächtig sind, kann man sehen, ob eine der anderen Messungen ebenfalls verdächtig war oder ob % Fläche falsch aufgezeichnet wurde.</li>
	<li>Verschieben Sie den Kreis, ohne seine Größe zu ändern, indem Sie ihn in seiner Mitte greifen, zur nächsten Platte im Bild. Wiederholen Sie die Schritte 7.6 und 7.7 für alle Platten im Bild.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 7.1 – 7.8 auf mindestens zwei weiteren Bildern. Nachdem alle Platten und Bilder analysiert wurden, durchschnittlich die % Fläche Ergebnisse zwischen verschiedenen Bildern für jede Platte, um alle Inkonsistenzen zwischen den Bildern zu mildern.</li>
</ol>

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<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
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<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wie gezeigt, kann das manuelle Zählen der metastasierenden Kolonien auf jeder Lungenplatte eine ungenaue und ungenaue Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen sein, was die Notwendigkeit einer besseren Quantifizierung simoniert (Abbildung 2). Die histopathologische Analyse unterschied sich sowohl von der manuellen Zählung als auch von der Fidschi-ImageJ-Analyse(Abbildung 2B und 4D), wahrscheinlich, weil die H&E-Folien keine repräsentativ...

Eine von acht Frauen wird in ihrem Leben an Brustkrebs diagnostiziert werden, und trotz mehrerer Behandlungsmöglichkeiten ist Brustkrebs die zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle bei amerikanischen Frauen1. Diese Frauen sterben nicht an dem primären Tumor in ihrer Brust. Stattdessen ist die metastasierende Last für die Sterblichkeit dieser Krankheit verantwortlich, da sie sich häufig auf die Lungen-, Knochen-, Gehirn-, Leber- und Lymphknoten ausbreitet2. Aus diesem Grund müssen Brustkrebsmodelle Metastasen bewerten, um zur Eindämmung der Sterblichkeit dieser Krankheit beizutragen. Das 4T1 murinen Brustkrebsmodell ist ein hervorragendes Protokoll, um dies zu erreichen. Die hier beschriebene Methode bietet eine Verbesserung des 4T1-Modells, indem Fidschi-ImageJ verwendet wird, um Lungenmetastasen zu quantifizieren und konsistente und schnelle Ergebnisse zu erzielen.
Das 4T1-Modell ist etabliert, wobei die meisten Labore Protokolle wie die von Pulaski und Ostrand-Rosenberg im Jahr 2001 beschriebenen verwenden3. Die 4T1-Zelllinie ist 6-Thioguanin (6TG) resistent und repräsentativ für Stadium IV, dreifach negativer Brustkrebs3,4,5. Es ist klinisch relevant, da es ein orthotopisches Modell ist und spontan zu den gleichen Organen metastasiert wie bei menschlichem Brustkrebs3,4. Die 4T1-Zellen metastasieren spontan mit einer vorhersagbaren Rate basierend auf der Menge der injizierten Zellen3,4. Wichtig ist, dass genetische Unterschiede zwischen Mäusen, die hier verwendet werden, die erwartete interindividuelle Variabilität der metastasierenden Belastung verursachten. Zur Bewertung der Metastasierung werden Gewebe geerntet, um Krebszellen an entfernten Standorten mit 6TG-Auswahl und Methylenblaufärbung zu sammeln und zu quantifizieren. Das Ergebnis ist eine Sammlung von Gewebekulturplatten mit blauen Punkten, die metastasierende Kolonien darstellen. Das Pulaski- und Ostrand-Rosenberg-Protokoll quantifiziert jedoch metastasierende Kolonien durch manuelles Zählen, und daher war dies das Standardmittel zur Bewertung von Metastasen in diesem Modell. Während dies für Gewebe mit geringer metastasierender Belastung einfach ist, sind Gewebe wie die Lunge oft mit Metastasen beladen. Da Lungenplatten sehr konfluent sein können, ist die genaue und präzise Quantifizierung metastasierender Kolonien durch manuelles Zählen schwierig und anfällig für menschliches Versagen. Um die metastasierende Belastung besser zu quantifizieren, beschreiben wir die Verwendung von Fiji-ImageJ für eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Histopathologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung ist ein weiteres Mittel zur Quantifizierung von Lungenmetastasen, und interessanterweise wurde auch mit Fiji-ImageJ Software6,7verbessert. Da jedoch die histopathologische Analyse eine einzelne Scheibe der Lunge beobachtet, kann sie ungenau und unrepräsentativ sein. Dies liegt daran, dass das 4T1-Modell mehrere metastasierende Läsionen im gesamten Organ verursacht, die nicht gleichmäßig verteilt sind. Während die Gesamttrends zwischen histopathologischer Analyse und manueller Zählung ähnlich sein können8,können einzelne Werte unterschiedlich sein und daher sollte die histopathologische Analyse nicht als einziges Mittel zur Quantifizierung verwendet werden. Wir zeigen den Nutzen im Vergleich zur histopathologischen Analyse und die Inkonsistenzen bei der manuellen Zählung zwischen verschiedenen Zählern, während wir gleichzeitig die Konsistenz der Verwendung von Fidschi-ImageJ demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode die Inkubationszeit von 10-14 Tagen auf 5 Tage reduzieren kann, was bedeutet, dass Forscher Daten aus ihrer Studie viel früher analysieren können, als wenn sie sich auf manuelles Zählen verlassen.
Diese Methode ist eine Sammlung einfacher Anpassungen des Pulaski- und Ostrand-Rosenberg-Protokolls3. Da das 4T1-Modell weit verbreitet ist und die Lungenmetastasierung ein kritischer Parameter für präklinische Modelle ist, glauben wir, dass diese Methode weit verbreitet sein kann und für Brustkrebsforscher sehr wertvoll ist. Die einzigen zusätzlichen Vorräte sind eine Kamera und Der Zugriff auf einen Computer mit Fiji-ImageJ, einer kostenlosen Software, die häufig in der Bildanalyse verwendet wird9. Diese Methode konzentriert sich speziell auf Lungenmetastasen, aber es könnte für andere Gewebe mit signifikanter metastasierender Belastung verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Anästhesiekammer</td><td>Siehe Kommentare</td><td>Siehe Kommentare</td><td>Verwenden Sie zugelassene Materialien in den Richtlinien Ihrer Einrichtung</td></tr><tr><td>Anästhetikum</td><td>Siehe Kommentare</td><td>Siehe Kommentare</td><td>Verwenden Sie zugelassene Materialien in den Richtlinien Ihrer Einrichtung</td></tr><tr><td>BALB/c Weibliche Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Taschenrechner</td><td>Beliebig</td><td>Beliebige</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Mindestens 8 Megapixel</td></tr><tr><td>Zentrifugieren</td><td>Beliebig</td><td>Beliebig</td> Muss in <td>der Lage sein, 125 x g und 300 x g</td></tr><tr><td>CO2-Euthanasie-Einrichtung</td><td>zu erfüllen Siehe Kommentare Siehe</td><td>Kommentare</td><td>Verwenden Sie zugelassene Materialien in den Richtlinien Ihrer Institution</td></tr><tr><td>Kühlraum, Kühlschrank, Kühlhaus</td><td>Beliebig Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer mit Fiji-ImageJ</td><td>Beliebig</td><td></td> Beliebig Muss in <td>der Lage sein, zu laufen Fiji-ImageJ</td></tr><tr><td>Zählkammer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Beliebig</td><td>Elastase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>Beliebig</td><td>Beliebig Beliebig</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Siehe Kommentare</td><td>Siehe Kommentare Muss</td><td>in der Lage sein, 5% CO2 und 37 &/de; C</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Stecknadeln oder Nadeln</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Zum Festhalten von Mäusen während der Autopsie</td></tr><tr><td>Kunststoff-Messschieber</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Wippe oder rotierendes Rad</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scharfe Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Einwegfilter mit PES-Membran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Dreieckiges Kunststoffbecherglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Zum Wiegen von Mäusen</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm Gewebekulturplatten</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Gewebekulturplatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>12 Well Platte</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco's Phostphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>1x Hank' s Ausgewogene Kochsalzlösung (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1/2 Zoll Nadeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg; CRL&schüchtern; 2539&Handel;)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-Thioguanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Cell Sieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Auf 70% mit DI-Wasser verdünnen</td></tr></tbody></table>

verwendung computerbasierter bildanalyse zur verbesserung der quantifizierung von lungenmetastasen im 4t1-brustkrebsmodell

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Brustkrebs ist eine verheerende Bösartigkeit, die allein im Jahr 2019 40.000 Todesfälle bei Frauen und 30 % der neuen Krebsdiagnosen bei Frauen in den Vereinigten Staaten ausmacht. Die Hauptursache für Todesfälle im Zusammenhang mit Brustkrebs ist die metastasierende Belastung. Daher müssen präklinische Modelle für Brustkrebs die metastasierende Belastung analysieren, um klinisch relevant zu sein. Das 4T1-Brustkrebsmodell bietet ein spontan metastasierendes, quantifizierbares Mausmodell für menschlichen Brustkrebs im Stadium IV. Die meisten 4T1-Protokolle quantifizieren jedoch die metastasierende Belastung, indem sie gefärbte Kolonien manuell auf Gewebekulturplatten zählen. Während dies für Gewebe mit geringerer metastasierender Belastung ausreicht, führt menschliches Versagen bei der manuellen Zählung zu inkonsistenten und variablen Ergebnissen, wenn Platten konfluent und schwer zu zählen sind. Diese Methode bietet eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Hier evaluieren wir das Protokoll mit der Lunge, einem hochmetastasierenden Gewebe im 4T1-Modell. Bilder von Methylenblau-gefärbten Platten werden in Fidschi-ImageJ zur Analyse aufgenommen und hochgeladen. Fiji-ImageJ bestimmt dann den Prozentsatz des ausgewählten Bildes, der blau ist, und stellt den Prozentsatz der Platte mit metastasierender Belastung dar. Dieser computergestützte Ansatz bietet konsistentere und schnellere Ergebnisse als manuelle Zählung oder histopathologische Auswertung für hochmetastasierte Gewebe. Die Konsistenz der Fidschi-ImageJ-Ergebnisse hängt von der Qualität des Bildes ab. Es können leichte Abweichungen in den Ergebnissen zwischen den Bildern auftreten, daher wird empfohlen, dass mehrere Bilder aufgenommen und die Ergebnisse gemittelt werden. Trotz ihrer minimalen Einschränkungen ist diese Methode eine Verbesserung der Quantifizierung der metastasierenden Belastung in der Lunge, indem sie konsistente und schnelle Ergebnisse bietet.

Diese Methode enthält einfache Anpassungen aus dem Pulaski und Ostrand-Rosenberg 4T1 Protokoll3 und kann in Abbildung 1visualisiert werden. Wenn 3 separate Forscher metastasierende Kolonien manuell für 12 Lungenplatten zählten (1:10 Verdünnung), waren die Ergebnisse zwischen verschiedenen Zählern sehr inkonsistent (Abbildung 2A). Alle Forscher wurden angewiesen, "die metastasierenden Kolonien zu zählen, die als blaue Punkte erscheinen", a...

Wir beschreiben eine konsistentere und beschleunigte Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell mit Fidschi-ImageJ.

Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Dieses Protokoll quantifiziert Lungenmetastasen, eine aggressive und häufige Ursache für brustkrebsbedingte Todesfälle, mit erhöhter Präzision und Effizienz in einem präklinischen Brustkrebsmodell. Im Vergleich zur ursprünglichen Technik liefert dieses Protokoll Forschern schnellere, konsistentere Ergebnisse. Es lindert menschliche Zählfehler durch einfach zu bedienende Computertechnologie.Diese Technik kann absolut auf die präklinische Forschung ausgedehnt werden, die die Auswirkungen von Brustkrebstherapien auf Lungenmetastasen untersucht, indem sie es Forschern ermöglicht, eine verringerte metastasierende Belastung nach erfolgreicher Behandlung nachzuweisen. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung eines 15 Milliliter konischen Rohrs für die Gewebeprobe. Dann fügen Sie 2,5 Milliliter Typ vier Kollagenase-Mischung und 30 Einheiten Elastase in das Rohr.Bewegen Sie die Lunge auf einen sauberen 1X HBSS gut und wirbeln Sie sie mit Zangen, um das verbleibende Blut zu entfernen, und übertragen Sie sie dann auf eine leere 3,5-Zentimeter-Gewebekulturplatte. Die Lunge mit einer Schere zerkleinern, dann den Teller mit 2,5 MilliliterHBSS abspülen und die HBSS mit den Lungenstücken in ein präpariertes 15-Milliliter-Konusrohr mit Kollagenase und Elastase-Cocktail übertragen. Inkubieren Sie das Rohr für 75 Minuten bei vier Grad Celsius auf einer Wippe oder einem rotierenden Rad.In der Zwischenzeit beschriften Sie ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr und eine 10 Zentimeter Gewebekulturplatte für jede Maus. Wenn Sie eine Verdünnung tun, beschriften Sie genügend Gewebekulturplatten für die Verdünnungen. Bringen Sie das Volumen der Röhre auf 10 Milliliter mit 1X HBSS, dann gießen Sie den Inhalt über ein 70 Mikrometer Zellsieb in die 50 Milliliter konische Röhre.Verwenden Sie den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um die Probe vorsichtig durch das Sieb zu schleifen. Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 350 mal G und entsorgen Sie den Überstand, dann waschen Sie das Pellet zweimal mit 10 Milliliter 1X HBSS. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter 60 Mikromolar 6-Thioguanin komplette Kulturmedien, und platten Sie die Proben in den 10 Zentimeter Zellkulturplatten mit einem Verdünnungsschema, wenn gewünscht.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Gießen Sie Kulturmedien von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie fünf Milliliter unverdünntes Methanol zu jeder Platte hinzu und brüten für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass das Methanol so gewirbelt wird, dass es die gesamte Platte bedeckt.Das Methanol von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter gießen und dann jede Platte mit fünf Millilitern destilliertem Wasser abspülen. Fügen Sie fünf Milliliter 0,03% Methylenblau pro Platte hinzu und inkubieren Sie es für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass die Methylenblaue Lösung so gewirbelt wird, dass sie die gesamte Platte bedeckt. Gießen Sie das Methylenblau in den entsprechenden Abfallbehälter und spülen Sie jede Platte mit fünf Millilitern destilliertem Wasser wieder aus.Drehen Sie die Platte auf den Kopf und bdeaktivieren Sie sie gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Platte auf den Deckel und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Metastasierende Kolonien werden blau sein.Sobald die Platten getrocknet sind, können sie bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden. Entfernen Sie die beschrifteten Deckel von den Platten, wobei Sie darauf achten, dass die Proben eindeutig identifiziert werden. Richten Sie alle gefärbten Lungenplatten auf einer sauberen, hellen Oberfläche aus.Machen Sie ein Bild von der Sammlung von Platten in einem gut beleuchteten Bereich, um Reflexionen zu minimieren. Reflexionen in den Platten beeinflussen die Bildanalyse und sollten vermieden werden. Achten Sie genau auf die aufgenommenen Fotos und nehmen Sie mehrere Bilder aus verschiedenen Blickwinkeln auf.Nachdem Sie die Platten fotografiert haben, schneiden Sie das Bild zu, um die Deckel oder irgendetwas im Hintergrund auszuschließen. Öffnen Sie das Bild in Fidschi ImageJ, und ändern Sie es in Schwarzweiß, indem Sie auf Bild, Anpassen und Farbschwelle klicken. Wählen Sie dann Die Standardeinstellung für die Schwellenwertmethode, Schwarzweiß für die Schwellenwertfarbe und das Labor für den Farbraum aus.Stellen Sie sicher, dass das dunkle Hintergrundfeld nicht ausgewählt ist. Das Bild sollte nun schwarz und weiß sein. Schwarz stellt den hellen Hintergrund dar, und Weiß stellt die blauen metastasierenden Kolonien dar.Verwenden Sie das Kreiswerkzeug, um den zu analysierenden Bereich auszuwählen. Zeichnen Sie einen Kreis, der für alle Platten verwendet werden soll, um sicherzustellen, dass jede Platte für die gleiche Größe analysiert wird. Wählen Sie eine Größe aus, die den analysierten Bereich auf den Platten maximiert und gleichzeitig das Hintergrundrauschen minimiert, das am Rand der Platten angezeigt wird.Die Größe wird in der Symbolleiste angezeigt, während sie gezeichnet wird. Analysieren Sie den ausgewählten Kreis, um den Prozentsatz der weißen Fläche zu bestimmen. Klicken Sie auf Analysieren und Analysieren von Partikeln, und wählen Sie dann Null bis Unendlichkeit für die Größe, null bis eins für die Zirkularität und nichts für die Anzeige.Aktivieren Sie das zusammengefasste Kästchen und klicken Sie auf okay. Verschieben Sie den Kreis zur nächsten Platte im Bild, indem Sie ihn in der Mitte greifen und die Analyse wiederholen. Kopieren Sie das Ergebnis, und fügen Sie es in eine Kalkulationstabelle ein.Der Prozentbereich, d. h. der Prozentsatz der ausgewählten Fläche, die weiß ist, stellt die metastasierende Belastung dar. Sobald alle Platten und Bilder analysiert wurden, durchschnittlich e0einer eisern die prozentualen Ergebnisse zwischen den verschiedenen Bildern für jede Platte, um Inkonsistenzen zwischen den Bildern zu verringern. Die Fidschi ImageJ-Analyse wurde mit manueller Zählung und histopathologischer Analyse verglichen.Wenn drei separate Forscher metastasierende Kolonien manuell zählten, waren die Ergebnisse zwischen den Zählern inkonsistent. Die Ergebnisse von Fiji ImageJ waren konsistent zwischen den Zählern für jedes der drei Bilder. Die Ergebnisse der drei Bilder und der drei Zähler wurden für jede Lungenplatte kombiniert.Die Ergebnisse wurden für jede Platte gemittelt, um die Variationen zwischen den Bildern zu berücksichtigen, die konsistente Ergebnisse zwischen den Zählern lieferten. Bei der Rangfolge der Platten von den meisten bis zu den am wenigsten metastasierenden, manuelle Zählung auf der konfluentsten Platte vereinbart, aber alle folgenden Ränge waren inkonsistent. Die Ränge aus den durchschnittlichen Fidschi ImageJ Ergebnissen waren viel konsistenter zwischen den Zählern.Um zu demonstrieren, wie wichtig es ist, Reflexionen in den Bildern zu vermeiden, wird ein Bild mit der Reflexion einer Hand und der anschließenden Fidschi ImageJ-Analyse zusammen mit einem Bild derselben Platte ohne Reflexion gezeigt. Dunkle Flecken von einer schmutzigen Hintergrundoberfläche oder ein Blutprobenrückstand auf den Platten können sich auch negativ auf die Fidschi ImageJ-Analyse auswirken. Diese Blutplatte hat nur zwei metastasierende Kolonien, aber die dunklen Rückstände veranlassten Fidschi ImageJ, es als 31,6% metastasiert zu betrachten.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, Bilder sorgfältig auf Reflexion zu untersuchen, verwenden Sie den gleichen Größenkreis für jede Platte im Bild, und durchschnittlich die Ergebnisse für jede Platte zwischen mindestens drei separaten Bildern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Wir beschreiben ein Protokoll für die präklinische in Vivo Verfolgung von Krebsmetastasen. Es basiert auf einem Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Kombination von Natrium Iodid Symporter, entdeckt nichtinvasive [18F] Tetrafluoroborate-PET, und ein fluoreszierendes Protein für optimierte ex Vivo Bestätigung. Die Methode ist anwendbar für präklinische in Vivo Zelle tracking über Tumorbiologie.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

In diesem Protokoll beschreiben wir wie nutzen [18-F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose-Positronen-Emissions-Tomographie und Computertomographie (18F-FDG-PET/CT) Bildgebung zur Messung der Tumor metabolische Reaktion auf die gezielte Therapie MLN0128 in einer  KRAS/Lkb1 mutierte Maus Modell von Lungenkrebs und gekoppelte Bildgebung mit hoher Auflösung Ex Vivo Autoradiographie und quantitativer Histologie.

Nutzung von 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung und quantitativer Histologie, dynamische Veränderungen in der Glukose-Stoffwechsel in Mausmodellen von Lungenkrebs zu messen

Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Lernen Sie eine computerbasierte Bildanalysemethode zur präzisen Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell. Dieses Protokoll reduziert menschliche Zählfehler und liefert schnellere, konsistentere Ergebnisse für die präklinische Krebsforschung.

Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

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