Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von reinem Assemblierungs-kompetentem Tubulin mit definierten posttranslationalen Modifikationen in Mengen, die ausreichen, um ganze In-vitro-Experimente durchzuführen. Dieses Protokoll, das auf Zyklen der Tubulinpolymerisation und Depolymerisation basiert, ist in jedem zellbiologischen Labor einfach durchzuführen. Es ermöglicht die Erzeugung guter Mengen an Tubulin mit sehr wenig praktischer Zeit.

Um Tubulin aus Suspensionskulturen zu reinigen, beleben und amplifizieren Sie neun Tage vor der Tubulinvorbereitung den gewünschten Zelltyp, um sechs konfluente 15-Zentimeter-Schalen zu erhalten. Acht Tage vor der Tubulinvorbereitung geben Sie einen Liter vorgewärmtes Medium in jede Spinnerflasche pro Schale unter einem Zellkulturschrank und stellen Sie die Spinner auf einen Rührtisch im Inneren des Zellkultur-Inkubators. Lassen Sie die seitlichen Spinnerkappen leicht geöffnet, damit sich das Medium an die Atmosphäre des Inkubators anpassen kann.

Verwenden Sie am nächsten Tag die Zellen aus den konfluenten Schalen, um die Spinnerflaschen zu impfen. Stellen Sie die Spinnerflaschen für eine Woche mit leicht geöffneten seitlichen Ventilen in den Inkubator. Um die Zellen zu ernten, werden die Kulturen aus den Spinnerflaschen in Ein-Liter-Zentrifugenflaschen überführt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt.

Jedes Pellet wird in 10 Millilitern eiskaltem PBS resuspendiert und die resuspendierten Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation bei vier Grad Celsius zusammengefasst. Für ein 10-Milliliter-Zellpellet fügen Sie dem Pellet 10 Milliliter Lysepuffer hinzu und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um die Zellen wieder zu suspendieren. Um Tubulin aus adhärenten Zellkulturen zu reinigen, beleben und amplifizieren Sie den gewünschten Zelltyp, um am Tag der Tubulinvorbereitung 10 konfluente 15-Zentimeter-Schalen zu erhalten.

Um die adhärenten Zellen zu entnehmen, indem drei Schalen gleichzeitig behandelt werden, kippen Sie die Kulturschalen, um das Medium zu entfernen, während eine zweite Person die Zellen vorsichtig mit sieben Millilitern PBS-EDTA wäscht. Nach dem Waschen sollte die zweite Person die Zellen mit fünf Millilitern PBS-EDTA pro Schale behandeln, bevor eine dritte Person die Zellen mit einem Zellheber vorsichtig an einen Rand der Schale schieben lässt. Wenn die Zellen abgelöst wurden, geben Sie die Zellen aus allen drei Schalen in ein 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis und spülen Sie jede Platte mit weiteren zwei Millilitern PBS-EDTA aus, um die verbleibenden Zellen zu sammeln.

Nach dem Sammeln der Zellen durch Zentrifugation wird der Überstand verworfen, um das Volumen des Zellpellets zu bestimmen. Fügen Sie den Lysepuffer hinzu, suspendieren Sie die Zellen wieder und geben Sie sie in ein 14-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Beschallen Sie die Zellen für ca. 45 Impulse.

Für die Lyse des Mausgehirns fügen Sie 500 Mikroliter lizenzierten Puffers zu einem einzelnen Gehirn hinzu, das von einer erwachsenen Maus entnommen wurde, und verwenden Sie einen Gewebemixer, um das Gewebe zu lysieren. Nachdem Sie das Lysat mit einem 1/100 seines Volumens auf ein gleiches Volumen von 2X Laemmli erhalten haben, puffern Sie die Lösung fünf Minuten lang auf. Lagern Sie es bis zur Quantifizierung bei minus 20 Grad Celsius.

Entnehmen Sie auf diese Weise bei jedem Schritt der Tubulinvorbereitung eine Probe. Um das Lysat zu klären, zentrifugieren Sie die Probe und übertragen Sie den klaren Überstand mit einer langen Nadel vorsichtig in ein neues Röhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass die obere Schwimmschicht nicht entsteht. Nach der Lysatklärung ist es wichtig, das im Überstand schwimmende Material zu entfernen, da es sonst die Effizienz der Tubulinreinigung negativ beeinflussen könnte.

Um Tubulin aus dem geklärten Lysat zu polymerisieren, mischen Sie das gesamte Volumen des Überstands eins mit einem 1/200-Volumen von 0,2 molaren GTP und einem halben Volumen warmem Glycerin in einem entsprechend großen Röhrchen. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und legen Sie sie für 20 Minuten in ein 30 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein neues Röhrchen umgefüllt. Um die im zweiten Pellet vorhandenen Mikrotubuli zu depolymerisieren, wird das Pellet fünf Minuten lang auf Eis in eiskaltem BRB 80 resuspendiert. Pipettieren Sie die Probe zuerst mit einer P1000-Pipette, dann mit einer P200-Pipette alle fünf Minuten für 20 Minuten auf Eis.

Sobald die Probe homogen ist, wird sie zentrifugiert und der erhaltene Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Um Mikrotubuli-assoziierte Proteine aus dem Tubulin zu entfernen, mischen Sie das gesamte Volumen des Überstands drei mit einem gleichen Volumen vorgewärmtem Molrohr S, dem gleichen Volumen vorgewärmtem Glycerin und einem 1/100 Volumen von 0,2 molaren GTP. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei 30 Grad Celsius, bevor Sie sie zentrifugieren.

Übertragen Sie den Mikrotubuli-assoziierten proteinhaltigen Überstand vier in ein neues Röhrchen, das Pellet enthält polymerisierte Mikrotubuli. Nach Durchführung einer dritten Polymerisation und Depolymerisation kann die Menge des geernteten Tubulins durch SDS-Seitenanalyse quantifiziert werden. Der Erfolg des Reinigungsprozesses kann auf einer Seite mit gefärbtem Sicherheitsdatenblatt von Coomassie bestätigt werden.

Eine geringere als erwartete Ausbeute des gereinigten Tubulins kann auf eine ineffiziente Tubulinpolymerisation zurückzuführen sein, was sich in einer geringeren Menge an Tubulin in der zweiten, vierten und sechsten Pelletfraktion und einer höheren Menge in der zweiten, vierten und sechsten Überstandsfraktion zeigt. Um das gereinigte Tubulin zu quantifizieren, können die Proben neben bekannten Mengen an Rinderserumalbumin durchgeführt werden. Die quantitative Densitometrie der Proteinbanden ermöglicht dann die Berechnung der Menge an gereinigtem Tubulin.

Der Modifikationsstatus des Tubulins kann durch Immunblot-Analyse der Proben bestätigt werden. Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen. Mit diesem Tubulin können wir in vitro Rekonstitutionsexperimente durchführen, die es uns ermöglichen, den Einfluss von Tubulinmodifikationen auf die Eigenschaften der Mikrotuben sowie auf ihre Wechselwirkungen mit Mikrotubuli-assoziierten Proteinen zu bestimmen.