Untersuchung von TGF-β Signalisierung und TGF-β-induzierten epitheliaal-mesenchymalen Übergang bei Brustkrebs und normalen Zellen
27. Oktober 2020
Wir beschreiben einen systematischen Workflow zur Untersuchung der TGF-β Signalisierung und tGF-β-induzierten EMT, indem wir die Protein- und Genexpression untersuchen, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Die Methoden umfassen Western Blotting, ein Luziferase Reporter Assay, qPCR, und Immunfluoreszenz Färbung.
TGF-beta ist ein Haupttreiber des Übergangs von Epithel zu Mesenchym, kurz EMT, der sowohl in normalen als auch in Krebszellen auftreten kann. Die Methoden, die in unserem Protokoll beschrieben sind, ermöglichen es den Forschern, den Einfluss von Modulatoren sowohl auf die TGF-beta-SMAD-Signalgebung als auch auf die TGF-beta-induzierte EMT zu messen. Die untransformierten NMuMG-Zellen, die aus einer Brustdrüse der Maus gewonnen wurden, sind ein häufig verwendetes Modellsystem für die TGF-beta-induzierte EMT.
TGF-beta provoziert in diesen Zellen, diesen NMuMG-Zellen eine sehr starke EMT-Reaktion. Eine ähnliche Reaktion ist auch bei Brustkrebszellen zu beobachten, wo sie zum Fortschreiten der Krebserkrankung beiträgt. Die kombinierte Färbung von epithelialem Mikro-E-Cadherin und die Organisation von filamentösem Aktin hilft, die morphologischen Veränderungen, die während des Übergangs von Epithel zu Mesenchym auftreten, zu validieren und besser sichtbar zu machen.
Der Erwerb eines mesenchymalen Phänotyps durch Krebszellen wurde mit einer erhöhten Fähigkeit der Zellen zur Migration, zum Eindringen und zur Metastasierung sowie mit einer Chemotherapieresistenz in Verbindung gebracht. Diese Methode kann wichtige Erkenntnisse über das Fortschreiten der Krebserkrankung, aber auch über andere Prozesse wie die Gewebefibrose liefern. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass die Zelldichte gut kontrolliert werden sollte.
Die hohe Dichte der Zellen erschwert den Übergang von Epithel zu Mesenchym. Mit dieser visuellen Demonstration erhalten die Forscher ein gutes Verständnis dafür, wie man TGF-beta-Signalwege und TGF-beta-induzierte EMT-Experimente durchführt. Um eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung von E-Cadherin durchzuführen, legen Sie zunächst sterile 18 Millimeter große quadratische Glasdeckgläser in Sechs-Well-Platten, ein Deckglas pro Well.
Säen Sie 100.000 NMuMG-Zellen mit zwei Millilitern vollständigem DMEM in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften. Nicht-transformierte NMuMG-Zellen werden häufig als Modellsystem zur Untersuchung der TGF-beta-induzierten EMT verwendet. Schieben Sie am nächsten Tag die Deckgläser mit den adhärenten Zellen vorsichtig auf eine neue Sechs-Well-Platte und geben Sie zwei Milliliter Kulturmedium in die Wells.
Behandeln Sie die Zellen zwei Tage lang mit Ligandenpuffer als Kontrolle oder fünf Nanogramm pro Milliliter TGF-beta. Der hinzugefügte Ligandenpuffer sollte das gleiche Volumen wie der hinzugefügte TGF-beta haben. Entfernen Sie nach der Behandlung das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit einem Milliliter vorgewärmtem PBS.
Fixieren Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter 4% Paraformaldehyd hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit einem Milliliter PBS. Permeabilisieren Sie die fixierten Zellen mit 0,1%Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Blockieren Sie die unspezifische Proteinbindung an Zellen mit 5 % BSA in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dann die Waschgänge mit PBS.
Geben Sie den primären Antikörper gegen E-Cadherin auf die Oberseite jedes Deckglases und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie jedes Deckglas dreimal mit PBS. Geben Sie den Sekundärantikörper Alexa Fluor 555 und das Phalloidin Alexa Fluor 488 oben auf jedes Deckglas auf.
Dann mit Alufolie abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Sekundärantikörper und waschen Sie das Deckglas dreimal mit PBS. Montieren Sie das Deckglas mit den Küvetten nach unten auf Glasobjektträger mit Einbettmedium mit DAPI und lagern Sie die gerahmten Objektträger in einer Box bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.
Beobachten Sie die Färbung mit der konfokalen SP8-Mikroskopie. In der MCF10A-Ras-Zelllinie stieg die Phosphorylierung von SMAD2 als Reaktion auf TGF-beta-Stimulation signifikant an, während die Expression von Gesamt-SMAD2 und 3 nicht beeinflusst wurde. TGF-beta induzierte auch deutlich den Luciferase-Reporter in der MCF10A-Ras-Zelllinie im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
Gut charakterisierte direkte transkriptionelle Genziele von TGF-beta, einschließlich SMAD7 und SERPINE1, wurden in TGF-beta-behandelten MCF10A-Ras-Brustzellen stark exprimiert. NMuMG-Epithelzellen, die mit TGF-beta behandelt wurden, veränderten sich von einer klassischen Epithelmorphologie zu einer spindelförmigen mesenchymalähnlichen Morphologie. In Übereinstimmung mit den morphologischen Veränderungen führte die TGF-beta-Behandlung zu einer Erhöhung der Proteinexpression mesenchymaler Marker.
Im Gegensatz dazu war E-Cadherin, ein epithelialer Marker, nach zweitägiger TGF-beta-Behandlung herunterreguliert. Quantitative real-time Polymerase-PCR wurde verwendet, um die Genexpression von EMT-Markern nach TGF-beta-Stimulation zu untersuchen. CDH1 war signifikant gesenkt, während die mesenchymalen Marker erhöht waren.
Nach TGF-beta-Stimulation exprimierten NMuMG-Zellen weniger E-Cadherin als die Zellen der Kontrollgruppe. Darüber hinaus bildeten die Zellen in Gegenwart von TGF-beta mehr Aktin-Stressfasern. Die Behandlung mit GW788388 hemmte die TGF-beta-induzierte SMAD2-Phosphorylierung dosisabhängig.
Zusätzlich wurde die TGF-beta-vermittelte Phosphorylierung von SMAD2 durch die Behandlung mit SB-431542 blockiert. Sowohl SB-431542 als auch GW788388 hemmten signifikant die TGF-beta-induzierte nukleäre Translokation und Akkumulation von SMAD2 und 3 in NMuMG-Zellen. Nach diesem Verfahren kann die Immunfluoreszenzfärbung anderer epithelialer bis mesenchymaler Makroproteine durchgeführt werden, indem die spezifischen primären und sekundären Antikörper verändert werden, um das Expressionsniveau und die Lokalisation dieser Proteine in der Zelle zu untersuchen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt einen systematischen Arbeitsablauf zur Untersuchung der TGF-β-Signalübertragung und der TGF-β-induzierten epithelialen zu mesenchymalen Transition (EMT) vor. Die verwendeten Methoden umfassen Western Blotting, Luciferase-Reportergen-Assays, qPCR und Immunfluoreszenzfärbungen zur Analyse der Protein- und Genexpression.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Signaltransduktion
- Krebsforschung
Hintergrund
- TGF-β ist ein zentraler Regulator der EMT, der sowohl normale als auch krebsöse Zellen beeinflusst.
- Die NMuMG-Zelllinie ist ein häufiges Modell zur Untersuchung der TGF-β-induzierten EMT.
- Die EMT ist mit einer erhöhten Zellmigration, Invasion und Metastasierung assoziiert.
- Das Verständnis der TGF-β-Signalübertragung kann Einblicke in die Krebsprogression und Gewebefibrose liefern.
Zweck der Studie
- Aufklärung der Mechanismen der TGF-β-Signalübertragung und ihrer Rolle bei der EMT.
- Beurteilung der Wirkungen verschiedener Modulatoren auf die TGF-β-Signalwege.
- Vorlage eines detaillierten Protokolls, mit dem Forscher diese Experimente reproduzieren können.
Verwendete Methoden
- Western-Blot-Analyse zur Untersuchung der Proteinexpression.
- Luciferase-Reportergen-Assays zur Messung der TGF-β-Signalaktivität.
- Quantitative PCR (qPCR) zur Analyse der Genexpression.
- Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung morphologischer Veränderungen und der Proteinlokalisation.
Hauptergebnisse
- Die Behandlung mit TGF-β löste eine signifikante EMT-Reaktion in NMuMG-Zellen aus.
- Es wurde eine Herunterregulierung von E-Cadherin und eine Hochregulierung mesenchymaler Marker beobachtet.
- Die Hemmung der SMAD2-Phosphorylierung wurde mittels spezifischer Inhibitoren erreicht.
- Mittels quantitativer PCR wurden Genexpressionsänderungen bestätigt, die mit einer EMT übereinstimmen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet ein umfassendes Protokoll zur Untersuchung der TGF-β-Signalübertragung.
- Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von TGF-β bei der EMT und der Krebsprogression.
- Dieser Arbeitsablauf kann für weitere Studien zur EMT und verwandten Prozessen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der TGF-β-Signalübertragung und ihrer Rolle bei der epithelialen-zu-mesenchymalen Transition (EMT) ist entscheidend, um die Zielvalidierung bei Brustkrebs sicherer zu gestalten und therapeutische Ansatzpunkte zu identifizieren, die auf mechanistischen Grundlagen beruhen. Dieses Protokoll ermöglicht eine quantitative Beurteilung der Pfadmodulation und stützt die Vorhersagekraft in der frühen Entdeckungsphase, indem molekulare Messgrößen mit phänotypischen EMT-Ergebnissen verknüpft werden. Der Ansatz bietet einen wiederverwendbaren Rahmen zur Bewertung der Wirkstoffeffekte auf biologische Vorgänge, die mit Invasion zusammenhängen, und unterstützt die Portfolio-Priorisierung sowie die mechanistische Risikobewertung in onkologischen Entwicklungsprogrammen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der TGF-β-Rezeptorkinase-Aktivität durch Messung der SMAD2-Phosphorylierung und unterstützt so das Testen von Target-Hypothesen.
- Operativer Wert: Bietet einen standardisierten Endpunkt zur Beurteilung der Hemmung des Signalwegs mithilfe von niedermolekularen Inhibitoren wie GW788388 und SB431542.
- Wissenschaftlicher Wert: Misst die transkriptionelle Aktivität über die Expression von SERPINE1 (PAI-1) und die Aktivität eines Luciferase-Reportergens, wodurch die Verbindung zwischen Signalübertragung und funktioneller Genregulation hergestellt wird.
- Operativer Wert: Erleichtert die Dosis-Wirkungs-Analyse der Effekte von Modulatoren auf Veränderungen von EMT-Markern und unterstützt die Validierung der Targetbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative, multiparametrische Messgrößen einschließlich Proteinlokalisierung (E-Cadherin), Aktin-Neuordnung und Expression mesenchymaler Marker für eine robuste Assay-Durchführung.
- Operativer Wert: Etabliert eine reproduzierbare, immunfluoreszenzbasierte Plattform zur Untersuchung von Substanzen, die die TGF-β-induzierte EMT in epithelialen Modellen hemmen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biomarkerbasierte Assay-Planung durch die Verfolgung der CDH1-Downregulation und der Upregulation mesenchymaler Marker als koordinierte EMT-Indikatoren.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Übertragung auf verschiedene Modelle (z. B. MCF10A-RAS, NMuMG, Py2T) zur systemübergreifenden Validierung von anti-EMT-Wirkstoffen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die TGF-β-Signalübertragung mit funktionalen EMT-Phänotypen, die mit Invasion, Migration und Therapieresistenz in Brustkrebsmodellen assoziiert sind.
- Operativer Wert: Bietet einen kontinuierlichen präklinischen Workflow von der Signalhemmung bis zur phänotypischen Umkehrung und unterstützt die translationale Abstimmung von Biomarkern.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Beurteilung der mesenchymalen-zu-epithelialen Transdifferenzierung (z. B. Py2T zu Adipozyten) als Maß für die Umkehrbarkeit des Signalwegs und die therapeutische Wirkung.
- Operativer Wert: Unterstützt die risikoadjustierte Entscheidungsfindung, indem sie die Zielmodulation mit nachgeschalteten biologischen Konsequenzen in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess, indem sie die Target-Validierung in der frühen Biologie ermöglicht, die Assay-Entwicklung für Screening-Kampagnen unterstützt und die präklinische Weiterentwicklung durch mechanistische Ent-Risikobewertung von EMT-getriebenen Phänotypen informiert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Rolle von TGF-β bei der EMT durch Messung der SMAD2/3-Phosphorylierung, nukleären Translokation und transkriptionellen Aktivität.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Auswertungen (z. B. qPCR, Immunfluoreszenz, Western Blot) zur Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf Signalübertragung und phänotypische Veränderungen.
- Analytik: Erzeugt normalisierte, vergleichbare Datensätze über verschiedene Bedingungen hinweg (Ligand, Inhibitor, Kontrolle), um datengestützte Zielstruktur-Priorisierung zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verknüpft die Hemmung des Signalwegs mit der Umkehrung von EMT-Markern und der Normalisierung der Morphologie und unterstützt so biomarkerbasierte Fortschrittskriterien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine modulare, anpassungsfähige Plattform, die auf verschiedene epitheliale und Krebszelllinien anwendbar ist und langfristig zur Validierung von Zielstrukturen und Signalwegen genutzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Zielinhibition mit der Unterdrückung von EMT-Kennzeichen verknüpft wird, wodurch mechanistische Unschärfen bei der Validierung onkologischer Zielstrukturen reduziert werden.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung durch definierte Protokolle für das Ansäen von Zellen, Behandlungszeitpunkte, Fixierung und Färbung und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitige Hinweise auf zielvermittelte Effekte auf die biologischen Vorgänge im Zusammenhang mit Invasion bereitgestellt werden, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in späteren Stadien verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem Zielstrukturenbindung und phänotypische Antwort parallel validiert werden, was eine effiziente Kapitalallokation unterstützt.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitativer Analyse von Proteinen beziehungsweise Nukleinsäuren.
- Setzt den Zugang zu Instrumenten für die Western-Blot-Analyse, qPCR, Luciferase-Assay und konfokale Mikroskopie voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Zelldichte und der TGF-β-Dosierung, um eine konsistente EMT-Induktion über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Beinhaltet die Optimierung der Antikörperkonzentrationen und Blockierbedingungen, um unspezifische Signale in der Immunfluoreszenz zu minimieren.
- Ist durch die Notwendigkeit einer sorgfältigen Titration von Inhibitoren (z. B. GW788388, SB431542) begrenzt, um eine Off-Target-Zytotoxizität bei hohen Dosen zu vermeiden.
