Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Diese Technik ermöglicht es Forschern, im Alleingang Hochdurchsatzmessungen durchzuführen, um das Mahlzeitenvolumen von Hunderten von einzelnen Mücken zu vergleichen. Es kann adaptiv sein, um den Inhalt der Mahlzeit zu verändern oder das von verschiedenen Versuchsgruppen konsumierte Volumen zu vergleichen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, benutzerfreundlich und kostengünstig zu sein.

Für pharmakologische und genetische Manipulationen, zur Untersuchung der Blutfütterung von Mücken und des Fressverhaltens nach der Überschwemmung. Die Organisation ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Bereiten Sie das Setup und die Reagenzien im Voraus vor, damit Sie die Mahlzeiten schnell an die Mücken liefern können.

Zu Beginn werden 1,98 bis zwei Milliliter defibriniertes Schafsblut in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Wenn Sie eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung der Mahlzeitengröße durchführen, fügen Sie Fluoresceinlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,002 % hinzu und reduzieren Sie das Blutvolumen um die gleiche Menge wie das zugesetzte Fluorescein. Bewahren Sie einen Milliliter der endgültigen Mahlzeitenformulierung auf, um die Referenzstandardkurve zu erzeugen.

Alle Mahlzeiten und Lösungen, die Fluorescein enthalten, sollten in Alufolie eingewickelt oder im Dunkeln aufbewahrt werden. Um proteinfreie Kochsalzmehle zuzubereiten, kombinieren Sie 600 Mikroliter 400 Millimolar Natriumbicarbonat mit 1,39 Millilitern doppelt destilliertem Wasser in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn anschließend eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung der Mahlzeitengröße durchgeführt werden soll, Fluoreszeinlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,002 % zugeben, wobei das Wasservolumen um die gleiche Menge wie das zugesetzte Fluorescein reduziert wird.

Bewahren Sie mindestens einen Milliliter der endgültigen Mahlzeitformulierung mit 0,002 % Fluorescein auf, um die Referenzstandardkurve zu erzeugen. Legen Sie die zubereiteten Mahlzeiten beiseite, bis Sie bereit sind, sie zu liefern. Alle Mahlzeiten und Lösungen, die Fluorescein enthalten, sollten in Alufolie eingewickelt oder im Dunkeln aufbewahrt werden.

Setzen Sie die Versuchsgruppe der weiblichen Mücken in einen Behälter und decken Sie sie mit Netzen ab. Lassen Sie diese Weibchen sich in der Futterkammer akklimatisieren. Legen Sie eine Kontrollgruppe von nicht gefütterten Mücken beiseite, denen keine Mahlzeit angeboten wird.

Um ein GLI-Röhrchen zu konstruieren, füllen Sie ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 40 Millilitern 100%igem Glycerin. Versiegeln Sie das offene konische Rohr mit zwei Stücken Parafilm, um die Wahrscheinlichkeit eines Auslaufens zu minimieren. Optional können Sie den Parafilm mit Gummibändern an Ort und Stelle halten.

Drehen Sie das Rohr um, um sicherzustellen, dass keine Löcher oder Lücken vorhanden sind. Um das Essensliefergerät herzustellen, schneiden Sie mit einer scharfen Rasierklinge oder einem Lave ein zentriertes 2,5 Zentimeter großes Loch in den Schraubverschluss des konischen Rohrs. Dehnen Sie ein Stück Parafilm gleichmäßig, so dass es sich ungefähr verdoppelt.

Der Parafilm sollte dünn genug sein, dass Mücken ihn leicht durchdringen können, aber es sollten keine Lecks vorhanden sein. Versiegeln Sie die Außenfläche des Schraubverschlusses mit dem Parafilm, um das Loch vollständig abzudecken, und legen Sie die Kappe beiseite. Erhitzen Sie sowohl die verschlossene Tube mit Glycerin als auch die Blut- und Kochsalzmehle sowie ein 42 bis 45 Grad Celsius heißes Wasserbad für mindestens 15 Minuten.

Fügen Sie der erwärmten Mahlzeit ATP hinzu und wirbeln Sie sie gründlich ein. Pipettieren Sie zwei Milliliter der erwärmten Mahlzeit in die innere Kammer des Schraubverschlusses und setzen Sie das umgedrehte, mit Glycerin gefüllte konische Röhrchen vorsichtig darauf auf. Schrauben Sie die Kappe mit dem Mehl teilweise auf das mit Glycerin gefüllte Röhrchen, gerade genug, um ein Auslaufen des Mehls oder des Glycerins zu verhindern.

Legen Sie den zusammengebauten Lykanon auf den Mückenbehälter, tragen Sie Kohlendioxid auf und lassen Sie die Mücken mindestens 15 Minuten lang Zugang zum Futter, um maximale Fütterungsraten zu erreichen. Nach der Fütterung kann der GLI-Tubendeckel als biologisch gefährlicher Abfall entsorgt oder nach dem Einweichen in einer niedrigprozentigen Bleichlösung und gründlichem Spülen in Wasser wiederverwendet werden. Um eine Referenzstandardkurve zu erstellen, bereiten Sie eine serielle Verdünnung derselben Mahlzeit mit 0,002 % Fluorescein vor, die der Versuchsgruppe von Mücken angeboten wurde.

Um die erste Lösung der Standardkurve herzustellen, fügen Sie 50 Mikroliter Mehl mit 0,002 % Fluorescein zu 950 Mikrolitern PBS hinzu und wirbeln Sie es gründlich ein. Führen Sie für den Rest der Standardkurvenlösungen zweifache Verdünnungen durch, wobei Sie vor jeder Verdünnung gut vortexen. Pipettieren Sie 100 Mikroliter jeder der Standardkurvenlösungen in jede der acht Vertiefungen in der ersten Säule einer 96-Well-PCR-Platte.

Fügen Sie jeweils eine betäubte oder gefrorene, nicht gefütterte Kontrollmücke in jeden der gleichen acht Vertiefungen hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang in der zweiten Spalte der Platte, um eine Wiederholungsmessung durchzuführen. Geben Sie 100 Mikroliter PBS in jede verbleibende Vertiefung für die nicht gefütterte Kontroll- und Versuchsgruppe.

Als Negativkontrolle fügen Sie in jeder Vertiefung in den nächsten beiden Spalten der Platte eine nicht gefütterte Mücke hinzu. Geben Sie eine Mücke pro Vertiefung in die verbleibenden Vertiefungen aus den Versuchsgruppen, denen eine Mahlzeit angeboten wurde. Geben Sie drei Millimeter Borosilikatglasperlen in jede Vertiefung, wenn Sie das Gewebe mit dem Perlmühlen-Homogenisator aufbrechen.

Verschließen Sie die Platte sorgfältig und brechen Sie das Gewebe auf, zentrifugieren Sie die Platte dann ein bis zwei Minuten lang bei 2000 U/min, um das Lysat aufzufangen. Bereiten Sie eine schwarze 96-Well-Platte mit 180 Mikrolitern PBS in jeder Well vor. Geben Sie dann 20 Mikroliter Lysat in jede Vertiefung und mischen Sie.

Messen Sie die Fluoreszeinintensität mit einem Plattenlesegerät mit den Anregungskanälen 485 und 520 Sendekanälen. Generieren Sie die Referenzstandardkurve, indem Sie das bekannte Mehlvolumen gegen die entsprechende Fluoreszenzintensitätsmessung darstellen. Unter Verwendung der generierten Referenzstandardkurve extrapolieren Sie das Mahlzeitenvolumen, das von jeder der Mücken der Versuchsgruppe aufgenommen wurde.

Subtrahieren Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der unfütterten negativen Kontrollgruppe von der Fluoreszenzintensität jeder Versuchsgruppe, um die Autofluoreszenz des Gewebes zu Studienbeginn zu korrigieren. Um die Größe der Fluoreszeinmehl aus einem Blutfütterungsexperiment zu messen, wurde eine Standardkurve erstellt, indem die Fluoreszenzmesswerte aus den dafür vorgesehenen Referenzvertiefungen, die eine nicht gefütterte Mücke und ein bekanntes Volumen der Mahlzeit enthielten, mit 0,002 % Fluorescein aufgetragen wurden. Fluoreszenz Messwerte aus den verbleibenden Vertiefungen, die Mücken entweder aus der nicht gefütterten negativen Kontrollgruppe von Mücken oder aus der Versuchsgruppe von Mücken, denen eine Mahlzeit angeboten wurde, enthalten, werden mit dieser Standardkurve verglichen, um das verzehrte Mahlzeitenvolumen zu quantifizieren.

Obwohl allen Weibchen in der Versuchsgruppe die Blutmahlzeit angeboten wurde, fütterten einige Mücken und andere nicht. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Mahlzeiten mit verschiedenen Proteinzusammensetzungen zu liefern und zu quantifizieren. Hier sind Daten dargestellt, die mit Mahlzeiten mit Fluoricinzusatz gesammelt wurden.

Ein unabhängiges Experiment, bei dem Mücken nach dem Anbieten von Mahlzeiten ohne Fluoricin als gefüttert oder nicht gefüttert bewertet wurden, wurde ebenfalls durchgeführt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das Volumen der konsumierten Mahlzeiten mit Medikamenten zu bestimmen, die das Verhalten der Mückenwirte regulieren. In diesen Experimenten wurden den Weibchen Kochsalzlösung und ATP-Mahlzeiten mit einem humanen NPY-Zwei-Rezeptor-Agonisten angeboten.

Diese Technik wurde auch zur Messung des Nektar-Fressverhaltens verwendet, indem das Ly-Röhrchen gegen einen Wattebausch ausgetauscht wurde, der mit 10 % Saccharose und 0,002 % Fluorescein gesättigt war, was zeigte, dass sie zur Messung kleinerer oder variablerer Mahlzeitengrößen verwendet werden kann, die anhand von Gruppengewichtsmessungen nicht genau unterschieden werden können. Das Wichtigste bei der Durchführung dieses Protokolls ist, die Proben in Ereignissen zu organisieren und die nicht gefütterten Mücken und ein ML jeder Mahlzeit für die Erstellung der Standardkurve beiseite zu legen. Nach diesem Verfahren kann das Verhalten der Tiere nach der Blutfütterung beobachtet und die Verdauung verfolgt werden.

Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Veränderungen des Mahlzeitenkonsums bei gentechnisch veränderten Mücken zu bewerten. Es bietet auch eine unkomplizierte, schnelle und nicht-invasive Möglichkeit, Medikamente an Mücken zu verabreichen und ihre Auswirkungen auf das Verhalten zu testen.