PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase
26. September 2020
Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.
Dieses Protokoll zur Aufreinigung des Enzyms Tryptophansynthase aus Salmonella typhimurium ist schnell, einfach und kurz. Die Ammoniaksulfat-Fraktionierung und die Größenausschlusschromatographie ermöglichen es, den Wildtyp- und mutierten Tryptophan-Synthase-Komplex an einem einzigen Tag zu reinigen. Diese Technik kann zur Aufreinigung anderer verwandter Proteine angewendet werden, da die Ammoniaksulfatfraktionierung und die Größenausschlusschromatographie üblicherweise zur Aufreinigung von nicht markierten Proteinen verwendet werden.
Zu Beginn zerkleinern Sie das Zellpellet durch Beschallung auf einem Eiswasserbad bei 80 % Amplitude für 20 Zyklen mit 10-Sekunden-Impulsen und 20-Sekunden-Pausen. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 30.000 g für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu entfernen. Die geklärte Überstandsfraktion wird mit einem 0,45-Mikrometer-Filter bei Raumtemperatur filtriert.
Geben Sie langsam kleine Mengen Ammoniumsulfat zum Filtrat, bis eine Sättigung von 20 % erreicht ist. Führen Sie eine Ammoniumsulfat-Fraktionierung bei 25 Grad Celsius durch und rühren Sie die Lösung 10 Minuten lang vorsichtig um, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Die Lösung wird erneut 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand zur weiteren Verwendung in einen sauberen Kolben überführt.
Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 20 Millilitern Probenpuffer und bereiten Sie eine Probe für die Ausführung von SDS-PAGE vor. Fügen Sie dem Überstand Ammoniumsulfat hinzu, bis eine Sättigung von 30 % erreicht ist, und rühren Sie die Lösung um, um Blasen zu vermeiden. Die Lösung wird erneut 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand zur weiteren Verwendung in einen sauberen Kolben gegeben.
Resuspendieren Sie die erhaltene 40%ige Pelletfraktion vorsichtig in 10 Millilitern Probenpuffer zwei und bereiten Sie eine Probe für die Ausführung von SDS-PAGE vor. Dann mikrozentrifugieren Sie die 40%ige Proteinprobe bei 10.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und laden Sie den erhaltenen Überstand auf eine zuvor äquilibrierte HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-Säule, die an einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie-Instrument mit einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute befestigt ist. Beurteilen Sie die gesammelten Peakfraktionen und die Ammoniumsulfatfraktionen auf einem 12%igen SDS-PAGE-Gel, das mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt ist.
Konzentrieren Sie den Wildtyp- oder mutierten Alpha-Zwei-Beta-2-Salmonella typhimurium-Tryptophan-Synthase-Komplex mit einem 100-Kilodalton-Zentrifugalfilter, indem Sie ihn bei 3.000 μm bei vier Grad Celsius drehen. Übertragen Sie das konzentrierte Protein in ein frisches Zwei-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad, um Aggregate zu entfernen. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration der Probe werden 0,5 Milliliter Aliquots mit 20 bis 25 Milligramm pro Milliliter hergestellt.
Schockfrosten Sie sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei minus 80 Grad. Bereiten Sie eine fünf Milliliter schwere Stammlösung von 200 Millimolar Spermin in Wasser vor und lagern Sie sie in 500 Mikroliter Aliquots bei minus 20 Grad. Bereiten Sie dann eine 50-Milliliter-Stammlösung mit 30 % Polyethylenglykol 8.000 in Wasser vor und bewahren Sie 25 Milliliter in einem 50-Milliliter-Einwegzentrifugenkolben bei 25 Grad Celsius auf.
Bereiten Sie 25-Milliliter-Stammlösungen aus einem molaren Cäsiumchlorid und Natriumchlorid in Wasser vor und halten Sie sie bei 25 Grad Celsius. Bereiten Sie drei Sätze von 50-Milliliter-Stammlösungen von einmolarem Bizin vor und titrieren Sie es mit Cäsiumhydroxid oder Natriumhydroxid, um gepufferte Lösungen mit einem pH-Wert von 7,6, 7,8 und acht zu erhalten. Halten Sie 25-Milliliter-Aliquots der Lösungen bei vier Grad Celsius.
Tauen Sie eine Probe des Alpha-2-Beta-2-Salmonella typhimurium-Tryptophan-Synthase-Komplexes in einem Eisbad auf. Dann mikrozentrifugieren Sie es bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Die klare Überstandsfraktion wird in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt.
Schätzen Sie die Proteinkonzentration des Überstands und verdünnen Sie die Aliquote auf 15 Milligramm pro Milliliter mit 50 Millimolar Bicin Cäsiumhydroxid oder Bicin Natriumhydroxid mit einem pH-Wert von 7,8, das 50 Millimolar Cäsium oder Natriumchlorid enthält. Bereiten Sie 500 Mikroliter Reservoirlösungen für drei 24-Well-Tropfplatten in sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Variieren Sie die Konzentration von PEG 8, 000 und Spermin und ändern Sie den pH-Wert des Puffers, wie im Textmanuskript für jedes Set beschrieben.
Verschließen Sie die Röhrchen und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang kräftig ein, bevor Sie sie 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius bei 10.000 g zentrifugieren, um Luftblasen zu entfernen. Geben Sie 500 Mikroliter dieser Lösung in jedes Reservoir. Geben Sie fünf Mikroliter Proteinlösung mit 15 Mikrogramm pro Liter in jede sitzende Tropfvertiefung mit einer P-10-Mikropipette ab.
Geben Sie dann jeweils fünf Mikroliter der entsprechenden Reservoirlösung in den Proteintropfen. Vermeiden Sie Luftblasen beim Mischen und pipettieren Sie nicht auf und ab. Decken Sie zum Schluss die Platte mit transparentem Klebeband ab und lagern Sie sie bei 25 Grad.
Die Kristalle erscheinen in zwei bis fünf Tagen und wachsen innerhalb von zwei Wochen zu ihren vollen Dimensionen heran. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die alpha-Untereinheit und die beta-Untereinheit der Salmonella typhimurium-Tryptophan-Synthase in den modifizierten pET-SUMO-Vektor zu subklonen. Repräsentative SDS-PAGE-Ergebnisse von zwei starken Banden, die dem His6-SUMO-alpha- und dem His6-SUMO-beta-Tryptophan-Synthase-Fusionsprotein entsprechen, sind hier dargestellt.
Jedes Protein wurde durch Nickel-Nitriotriessigsäure-Affinitätschromatographie und Ammoniumsulfat-Fällung gereinigt, gefolgt von der His-SUMO-Tag-Spaltung, der Entfernung von His-SUMO-Tag-Spuren und der Messung der Proteinkonzentration. Das Elutionsprofil der alpha-Untereinheit, der beta-Untereinheit und des alpha-zwei beta-zwei Salmonella typhimurium-tryptophan-Synthase-Komplexes auf SEC und die Reinheit ihrer Peakfraktionen sind hier dargestellt. Nach der Generierung mutierter Formen des Tryptophansynthase-Komplexes wurde die Ammoniumsulfat-Fraktionierung verwendet, um die Kontaminantenproteine aus dem heterologen Expressionssystem zu entfernen.
Hier ist ein repräsentatives Elutionsprofil mit einer relativen Elutionsposition des alpha-zwei beta-zwei Salmonella typhimurium tryptophan-Synthase-Komplexes auf einer Ausschlusschromatographiesäule dargestellt. Die Reinheit der ausgeschlossenen Peakfraktionen wurde vor dem Pooling mit SDS-PAGE analysiert. Große Einkristalle wurden durch eine Feinkristallisationsoptimierung durch Variation von PEG 8.000 und Sperminkonzentrationen sowie dem pH-Wert des Bicinpuffers erhalten.
Kristalle mit unterschiedlichen Morphologien erschienen innerhalb von zwei bis fünf Tagen und wuchsen innerhalb von zwei Wochen zu voller Größe heran. Die Validierung von Elektronendichtekarten für die Kristallstruktur des Wildtyp-alpha-two-beta-zwei-Salmonella typhimurium-tryptophan-Synthase-Komplexes wurde nach Verfeinerung der Kristallstruktur aufgeklärt. Wenn Sie dieses Protokoll durchführen, führen Sie die ersten Reinigungsschritte bei Raumtemperatur so bald wie möglich durch, um einen Verlust der Tryptophansynthase-Aktivität zu vermeiden.
Es wird erwartet, dass die Kristallstrukturen der Mutanten neue Einblicke in den Mechanismus und die Rolle von Schlüsselresten bei der L-Tryptophan-Synthese liefern.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Expression und Reinigung der Tryptophan-Synthase aus Salmonella typhimurium vorgestellt. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Reinigung sowohl von Wildtyp- als auch von mutierten Protein-Komplexen innerhalb eines einzigen Tages.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biokemie
- Proteinaufreinigung
- Enzymcharakterisierung
Hintergrund
- Die Tryptophan-Synthase ist ein essentielles Enzym in der Biosynthese von Tryptophan.
- Salmonella typhimurium dient als Modellorganismus für die Untersuchung dieses Enzyms.
- Effiziente Reinigungsmethoden sind entscheidend für biochemische Studien.
- Zu den gängigen Techniken gehören die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und die Größenausschlusschromatographie.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines optimierten Protokolls zur Reinigung der Tryptophan-Synthase.
- Möglichmachung der Untersuchung sowohl der Wildtyp- als auch mutierter Formen des Enzyms.
- Bereitstellung einer Methode, die auch auf andere verwandte Proteine anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Gezielte Mutagenese
- Proteingexpression in Escherichia coli
- Affinitätschromatographie
- Gelfiltrationschromatographie
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht die Reinigung innerhalb eines einzigen Tages.
- Sowohl die Wildtyp- als auch mutierte Tryptophan-Synthase können effektiv gereinigt werden.
- Die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und die Gelpermeationschromatographie sind zentrale Schritte.
- Die Methode ist anpassbar, um andere nicht markierte Proteine zu reinigen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet ein schnelles und effizientes Verfahren zur Reinigung der Tryptophan-Synthase.
- Es kann weiterführende Untersuchungen zur Enzymfunktion und -struktur erleichtern.
- Die beschriebenen Methoden sind vielseitig für andere Proteinreinigungsaufgaben einsetzbar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schnelle Reinigung von Wildtyp- und Mutanten-Tryptophan-Synthase-Komplexen ermöglicht effiziente strukturelle und funktionelle Untersuchungen von PLP-abhängigen Enzymen und unterstützt die Zielvalidierung in der frühen Entdeckungsphase. Der optimierte Workflow verkürzt die Zeitspannen für die Proteinproduktion und beschleunigt den Übergang von Hits zu Leitstrukturen in enzymbasierten Wirkstoffentwicklungsprogrammen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit, indem er hochreine, reproduzierbare Proteinproben für die mechanistische Ent风险分析 und die Assay-Entwicklung bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung katalytischer Mechanismen und allosterischen Verhaltens der Tryptophan-Synthase, um therapeutische Hypothesen zu überprüfen.
- Operativer Wert: Erleichtert die Herstellung reiner Wildtyp- und Mutantenkomplexe für strukturbasierte Zielentrisikobewertung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht standardisierte Proteinpräparationen mit hoher Ausbeute, die für die Entwicklung biochemischer und biophysikalischer Assays geeignet sind.
- Operationaler Wert: Stellt eine Konsistenz zwischen den Proteinchargen hinsichtlich Reinheit und Konzentration sicher, was für die Reproduzierbarkeit von Assays entscheidend ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Target-Validierung bis zu präklinischen Studien, indem strukturelle Analysen von mutierten Formen ermöglicht werden, die mit funktionellen Veränderungen verknüpft sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Herstellung gut charakterisierter Proteinvarianten, um Struktur-Funktions-Beziehungen in krankheitsrelevanten Kontexten zu untersuchen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem sie gereinigte Protein-Komplexe für nachgeschaltete Anwendungen in der Enzymologie und Strukturbiologie bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch schnellen Zugriff auf Wildtyp- und Mutanten-Enzymkomplexe.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Aufreinigung löslicher, aktiver Proteine, die für Ligandenbindungs- und Aktivitätsassays geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt quantitative Ergebnisse wie Angaben zur Protein-Ausbeute und Reinheit, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch bei der Zielvalidierung unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit präklinischer Arbeit, indem sie Proteinproben für mechanistische Studien bereitstellt, die die Zielstrukturauswahl beeinflussen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Aufreinigungsplattform, die auf andere nicht markierte Proteine über mehrere Projekte hinweg anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem strukturelle Erkenntnisse mechanistische Unklarheiten verringern.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit der Proteinproduktion und reduziert die Variabilität der experimentellen Ergebnisse.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem Proteinproduktionszeiträume verkürzt und die parallele Prüfung mehrerer Mutanten ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Targets, indem zuverlässige strukturelle und funktionelle Daten früh im Entdeckungsprozess bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in Molekularbiologie, Proteinexpression und chromatographischen Reinigungstechniken voraus.
- Hängt vom Zugang zu Ultraschallgeräten, Zentrifugen, FPLC-Systemen und SDS-PAGE-Ausrüstung für die Analyse ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Ammoniumsulfat-Fraktionierung und SEC-Protokollen, um die Reproduzierbarkeit über verschiedene Labore hinweg sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung der Methode auf unterschiedliche Proteinsysteme, insbesondere hinsichtlich Pufferbedingungen und Salzkonzentrationen.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit, die ersten Schritte unverzüglich durchzuführen, um einen Aktivitätsverlust der Tryptophan-Synthase während der Reinigung zu vermeiden.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Purification of Wild Type or Mutant Form of α2β2 StTS Complex
3:53
Optimized Crystallization for Wild Type and Mutant Form of the α2β2 StTS Comple
6:49
Results: Purification of the α- and β -Subunits of the Tryptophan Synthase and the Wild Type and Mutant α2β2 StTS Complexes
8:50
Conclusion
