Name: Untersuchung der Aktivität von Neuropeptiden und anderen Regulatoren des Ausscheidungssystems bei der erwachsenen Mücke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung des Ausscheidungssystems bei erwachsenen Aedes-Mücken. Dieses Protokoll zeigt Techniken zur Messung von Ionentransport und Flüssigkeitssekretion in Malpighischen Tubuli.

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Diese Forschung wurde durch Die Discovery Grants des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) für AD und J-PP finanziert. AL und FS erhielten NSERC CGS-M-Auszeichnungen zur Unterstützung ihrer Graduiertenforschung.

Nichts.

Bei der Einnahme einer Blutmahlzeit stehen hämatophage Insekten vor der Herausforderung von überschüssigen gelösten Stoffen und Wasser in ihrer Hämolymphe2. Um damit fertig zu werden, haben sie ein spezialisiertes Ausscheidungssystem, das durch hormonelle Faktoren streng kontrolliert wird, so dass die Insekten schnell eine postprandiale Diurese einleiten können. Der Ramsay-Assay und die Verwendung von ionenselektiven Mikroelektroden ermöglichen die Messung von Flüssigkeitssekretionsraten zusammen ...

Die Aufrechterhaltung des Salz- und Wasserspiegels bei Insekten ermöglicht es ihnen, in vielen ökologischen und ökologischen Nischen erfolgreich zu sein und dabei eine Vielzahl von Fütterungsstrategien zu nutzen1. Die meisten Insekten haben Mechanismen entwickelt, um die Zusammensetzung ihrer Hämolymphe in engen Grenzen zu regulieren, um den verschiedenen Herausforderungen standzuhalten, die mit ihrer jeweiligen Umgebung verbunden sind2. Terrestrische Insekten stehen oft vor der Herausforderung, Wasser zu sparen, und das Ausscheidungssystem wird einer Antidiurese unterzogen, um den Verlust von Wasser und einigen essentiellen Salzen zu verhindern und somit eine Austrocknung zu vermeiden. Im Gegensatz dazu tritt Diurese auf, wenn sich das Insekt ernährt und mit überschüssigem Wasser und möglicherweise Salzen herausgefordert wird3,4. Durch ihr spezialisiertes und hochaktives Ausscheidungssystem haben Insekten Regulationsmechanismen entwickelt, die ihren osmoregulatorischen Herausforderungen entgegenwirken. Bei erwachsenen Aedes aegypti-Mücken besteht das Ausscheidungssystem aus den Malpigh-Tubuli (MTs) und dem Hinterdarm, von denen letzteres aus dem vorderen Ileum und dem hinteren Rektum besteht5. MTs sind für die Erzeugung von Primärurin verantwortlich, der in der Regel reich an NaCl und / oder KCl ist. Der Primärurin wird dann durch sekretorische und reabsorbtive Prozesse modifiziert, während er stromabwärts des Tubulus wandert und in den Hinterdarm gelangt5. Die endgültigen Ausscheidungen können je nach Fütterungs-/Umweltbedingungen hyper- oder hypoosmomotisch zur Hämolymphe sein und sind mit toxischen und stickstoffhaltigen Abfällen angereichert2.
MTs sind ideal für die Untersuchung vieler Merkmale des Transports von Epithelflüssigkeit und gelösten Stoffen, da sie eine Vielzahl von Transport- und Ausscheidungsfunktionen ausführen2,6. Durch hormonelle Regulation2 funktionieren MTs, indem sie Ionen und andere gelöste Stoffe aus dem Blut in das Tubuluslumen7 absondern, wodurch ein osmotischer Gradient entsteht, der es ermöglicht, Wasser durch Aquaporine8,9 zu transportieren, die zusammen den Primärurin erzeugen, bevor sie sich in Richtung des reabsorptiven Hinterdarms bewegen2. So kann man durch das Sammeln der sezernierten Flüssigkeit aus isolierten MTs den transepithelialen Transport von Flüssigkeit und Ionen kontinuierlich überwachen. Die Messung der Sekretrate und der Urinzusammensetzung liefert Einblicke in die Mechanismen, die für den transepithelialen Ionen- und Flüssigkeitstransport verantwortlich sind. Eine beliebte Methode zur Untersuchung der Flüssigkeitssekretionsraten ist der Ramsay-Assay, der erstmals 195310 von Ramsay eingeführt wurde. Bei dieser Methode wird das distale (geschlossene) Ende des Tubulus mit einem Hormon (oder einer anderen Testverbindung / Droge) behandelt, während das proximale (offene) Ende um einen Stift in wassergesättigtem Paraffinöl gewickelt wird, das den Primärurin absondert und sich als Tröpfchen an der Spitze des Stiftes ansammelt. Isolierte MTs sind in der Lage, über lange Zeiträume (bis zu 24 h) unter optimierten In-vitro-Bedingungen zu überleben und zu funktionieren, was sie zu geeigneten und effizienten Modellen für die Flüssigkeitssekretionsmessung macht. Insekten haben offene Kreislaufsysteme, so dass die MTs leicht seziert und entfernt werden können, da sie normalerweise frei in der Hämolymphe schweben6. Mit Ausnahme von Blattläusen, denen MTs11 fehlen, kann die Anzahl der MTs in einer bestimmten Insektenart erheblich von vier bis hundert (fünf bei Aedes-Mücken) variieren, was mehrere Messungen von einem Insekt ermöglicht.
Die MTs in Aedes-Mücken bestehen wie andere endopterygote Insekten aus zwei Zelltypen, die ein einfaches Epithel bilden2,12; große Hauptzellen, die den aktiven Transport von Kationen (d.h. Na+ und K+) in das Lumen erleichtern, und dünne Sternzellen, die bei der transepithelialen Cl-Sekretion helfen13. Die MTs sind nicht innerviert2, sondern werden durch mehrere Hormone reguliert, darunter sowohl harntreibende als auch antidiuretische Faktoren, was die Kontrolle des Ionentransports (hauptsächlich Na +, K + und Cl-) und osmotisch verpflichtetem Wasser ermöglicht2. Zahlreiche Studien haben die hormonelle Regulation von Aedes MTs untersucht, um die Rolle endokriner Faktoren auf den transepithelialen Transport zu verstehen14,15,16,17,18. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt, zeigen die hierin enthaltenen Protokolle die Wirkungen verschiedener hormoneller Faktoren auf isolierte MTs von erwachsenen weiblichen A. aegypti-Mücken, einschließlich der diuretischen und antidiuretischen Kontrolle (Abbildung 1). Der Ramsay-Assay wird verwendet, um zu zeigen, wie ein antidiuretisches Hormon, AedaeCAPA-1, die Flüssigkeitssekretion von MTs hemmt, die durch das diuretische Hormon 31 (DH31) stimuliert werden (Abbildung 1).
Die geringere Größe von Insekten erforderte die Entwicklung von Mikromethoden zur Messung der Ionenaktivität und -konzentrationen in flüssigkeitsproben oder in der Nähe der Oberfläche isolierter Gewebe wie MTs und Darm. Es wurden unterschiedliche Methoden eingesetzt, darunter die Verwendung von Radioisotopen von Ionen19, die das Sammeln der sezernierten Flüssigkeitstropfen zur Messung der Ionenkonzentrationen erfordert20. Stimulierte Aedes-Tubuli in vitro sezernieren typischerweise ~ 0,5 nL / min21, so dass die Handhabung solch kleiner Volumina eine Herausforderung darstellen und möglicherweise Fehler bei der Übertragung verursachen kann. Infolgedessen wurden ionenselektive Mikroelektroden (ISMEs) ausgiebig verwendet, um Ionenkonzentrationen in sezernierten Tröpfchen von MTs in vitro zu messen. Bei diesem Verfahren werden eine Referenzelektrode und ISME, gefüllt mit der entsprechenden Verfülllösung und dem Ionophor, in das sezernierte Urintröpfchen positioniert, um die Ionenkonzentrationen zu bestimmen22. Adaptiert von Donini und Kollegen23, verwendet dieses aktuelle Protokoll ein Na+-selektives Ionophor, um die Ionenaktivität in sezernierten Tröpfchen aus stimulierten MTs in erwachsenen Aedes-Mücken zu messen. Da ionenselektive Mikroelektroden die Ionenaktivität messen, können diese Daten als Ionenkonzentrationen ausgedrückt werden, wobei davon ausgegangen wird, dass die Kalibrierlösungen und experimentellen Proben den gleichen Ionenaktivitätskoeffizienten aufweisen21 (Abbildung 1B,C).
Die Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) nutzt auch ISMEs, um Ionenkonzentrationsgradienten in der ungestörten Schicht zu messen, die an Organe, Gewebe oder Zellen angrenzt, die Ionen transportieren. Die ISMEs messen Spannungsgradienten, die dann verwendet werden können, um die Ionenkonzentrationsgradienten sowie die Richtung und Größe des Ionenflusses über das Organ, das Gewebe oder die Zelle zu berechnen20. Bei dieser Technik wird die ISME auf einem dreiachsigen Manipulator montiert, der von computergesteuerten Mikroschrittmotoren gesteuert wird, so dass seine 3D-Position bis auf Mikrometerebene gesteuert wird20. Spannungen werden an zwei Punkten innerhalb der ungetragenen Schicht mit einem Sampling-Protokoll gemessen, das in Computersoftware programmiert und gesteuert wird. Die beiden Punkte sind typischerweise durch einen Abstand von 20-100 μm getrennt, wobei ein Punkt innerhalb von 5-10 μm von der Oberfläche des Organs, Gewebes oder der Zelle und der zweite Punkt weitere 20-100 μm entfernt ist. Die Differenz in der Größe der Spannungen zwischen den beiden Punkten wird berechnet, um einen Spannungsgradienten24,25,26 zu erhalten, der dann verwendet wird, um den Konzentrationsgradienten und anschließend den Nettofluss unter Verwendung des Fickschen Gesetzes24,27 zu berechnen. Diese Methode ist nützlich, um den Transport spezifischer Ionen über verschiedene Regionen des Insektendarms und MTs oder zu bestimmten Zeitpunkten nach einer Blutmehl- oder Behandlungsexposition zu beurteilen. Mit dem SIET kann beispielsweise verstanden werden, wie absorptions- und sekretorische Prozesse im Ausscheidungssystem der Mücken durch Hormone reguliert werden28 sowie unterschiedliche Fressverhalten und Aufzuchtbedingungen25. Frühere Arbeiten unter Verwendung des SIET zeigten Stellen, die am Ionentransport entlang der Analpapillen und des Rektums von Larven und erwachsenen Moskitos beteiligt sind24,28. Das aktuelle Protokoll, das zuvor von Paluzzi und Kollegen26 beschrieben wurde, misst den Na+-Fluss über die rektalen Padepithelien des erwachsenen weiblichen Rektums (Abbildung 2).
Das letzte Segment des Moskito-Ausscheidungssystems erfordert eine koordinierte Muskelbewegung, um Nahrung zu mischen und Abfälle abzusondern26. Nicht resorbierbare Verdauungsprodukte aus dem Mitteldarm werden zusammen mit dem von den MTs abgesonderten Primärurin durch das Pylorusventil geleitet und an den Hinterdarm abgegeben2. Spontane Hinterdarmkontraktionen beginnen an der Pylorusklappe und treten in peristaltischen Wellen auf, die durch die koordinierte Kontraktion von kreisförmigen und longitudinalen Muskeln, die die Basaloberfläche von Epithelzellen umgeben, über das Ileum geleitet werden26. Schließlich helfen die Muskeln im Rektum, Abfall durch den Analkanal zu treiben und zu beseitigen. Obwohl die Hinterdarmmotilität von Insekten myogen ist und extrazelluläres Ca2+ benötigt, um spontane Kontraktionen zu erzeugen, können diese Prozesse auch neuronal reguliert werden26,29,30. Diese exogene Regulation durch das Nervensystem ist nach der Fütterung wichtig, da das Tier Abfälle aus dem Darm vertreiben und das Hämolymphengleichgewicht wiederherstellen muss31. Infolgedessen ist die Durchführung von In-vitro-Bioassays zur Identifizierung myostimulatorischer oder myoinhibitorischer Neuropeptide nützlich, um zu beurteilen, wie Neurochemikalien die Hinterdarmmotilität beeinflussen. Das aktuelle Protokoll, das von Lajevardi und Paluzzi28 durchgeführt wird, verwendet Videoaufnahmen, um die Ileummotilität als Reaktion auf Neuropeptide zu untersuchen (Abbildung 3). In ähnlicher Weise kann ein Kraftaufnehmer oder Impedanzwandler auch verwendet werden, um Kontraktionsspuren durch eine Datenerfassungssoftware zu beobachten32,33. Die Verwendung von Videotechnologie ermöglicht es uns jedoch, das Organ visuell zu beurteilen und anhand einer Teilmenge von Parametern weiter zu analysieren, um die Rolle von Hormonen bei der Hinterdarmmotilität zu identifizieren.
Die Verwendung dieser Techniken kann helfen, Faktoren zu charakterisieren, die den Flüssigkeits- und Ionentransport entlang des Ausscheidungssystems zusammen mit der Hinterdarmmotilität regulieren und koordinieren. Wichtig ist, dass eine funktionelle Verbindung zwischen der harntreibenden Reaktion der MTs und der Hinterdarmmotilität unterstützt wird, da diuretische Hormone wie DH31 und 5HT, die durch ihre Fähigkeit, die Flüssigkeitssekretion durch die MTs zu stimulieren, gekennzeichnet sind, auch myotrope Wirkungen entlang des Mückenrückdarms zeigen21,34,35 . Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer strengen Koordination zwischen den MTs und dem Hinterdarm bei Ereignissen wie der postprandialen Diurese bei Insekten, die eine schnelle Abfallbeseitigung erfordern.
Hierin werden der detaillierte Ansatz hinter der Ramsay-Assay-Technik zur Messung der Flüssigkeitssekretionsrate in der Mücke, A. aegypti, und die Verwendung von ionenselektiven Mikroelektroden zur Bestimmung der Na+ -Konzentrationen innerhalb der sezernierten Flüssigkeit der MTs beschrieben, die in Kombination die Bestimmung transepithelialer Ionentransportraten ermöglichen. Zusätzlich werden die Scanning Ion-selective Electrode Technique und die Hindgut contraction assays beschrieben, um den Ionenfluss bzw. die Motilität zu messen, was zur Aufklärung der hormonellen Regulation des Hinterdarms beiträgt (Abbildung 4).

<table><tbody><tr><td>1 mL</td><td>Spritzen Fisher Scientific</td><td>14955456</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen</td><td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td><td>C351008</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate Glaskapillarfilamentröhrchen (AD 1 mm, ID 0,58 mm, Länge 100 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>für ISME-Referenzelektroden</td></tr><tr><td>Borosillicat-Glas-Kapillarfilamentrohre (AD 2 mm, ID 1,12 mm, Länge 102 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B200F-4</td><td>für SIET-Referenzelektroden</td></tr><tr><td>Borosilcat-Glaskapillarrohre (OD 1,5 mm, ID 1,12 mm, Länge 100 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td>für ISME- und SIET-Elektroden</td></tr><tr><td>CO2 Pad</td><td>Diamed</td><td>GEN59-114</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyltrimethylsilylaminlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41716</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Custom</td><td></td><td>Kann von einer lokalen Maschinenwerkstatt hergestellt werden</td></tr><tr><td>Eisenchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette (Dumont # 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-748A</td><td></td></tr><tr><td>Hydratisiertes Mineralöl</td><td>Fisher Scientific</td><td>8042-47-5</td><td>Spezifische Marke ist nicht wichtig</td></tr><tr><td>INFINITY1-2CB Videokamera</td><td>Luminera</td><td>INFINITY1-2CB</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren (Links- und Rechtshänder)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MMJL und MMJR</td><td>Spezifische Marke ist nicht wichtig, solange hochwertiger Manipulator</td></tr><tr><td>Mineralöl, Licht</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-4</td><td></td></tr><tr><td>Winzige Stifte (0,1 mm Edelstahl)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nicht aushärtende Modelliermasse</td><td>Sargent Art</td><td></td><td>Spezifische Marke ist nicht wichtig</td></tr><tr><td>Olympus Lichtmikroskop (FÜR SIET)</td><td></td><td>Olympus kundenspezifisches System</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff Pasteur (Transfer) Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin Lösung (0,1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-005-M</td><td>84 kDa</td></tr><tr><td>Polyvinylchlorid (PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81395</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053-09</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>SIET-System</td><td>Anwendbare Elektronik</td><td>kundenspezifisches System</td><td>Details verfügbar unter: http://www.applicableelectronics.com/overview</td></tr><tr><td>Silberdraht</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumionophor II Cocktail A</td><td>Fluka</td><td>99357</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Polystyrol-Petrischalen (Kulturschalen)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012921</td><td>Jede Größe würde funktionieren, aber 60-mm-Schalen eignen sich sowohl zum Sezieren als auch Stereomikroskop</td></tr><tr><td>mit Okularmikrometer</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 Flaming Brown Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>FGPN7</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Chemical Company</td><td>NC9285739</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>VWR fortschrittlicher Heizplattenrührer - Aluminium</td><td>VWR</td><td>9578</td><td>Bestimmte Marke ist nicht wichtig</td></tr></tbody></table>

untersuchung der aktivität von neuropeptiden und anderen regulatoren des ausscheidungssystems bei der erwachsenen mücke

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studien zur Insektenphysiologie, insbesondere bei jenen Arten, die Vektoren von Krankheitserregern beim Menschen und anderen Wirbeltieren sind, bilden die Grundlage für die Entwicklung neuartiger Strategien zur Schädlingsbekämpfung. Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die routinemäßig verwendet werden, um die funktionelle Rolle von Neuropeptiden und anderen neuronalen Faktoren (dh biogenen Aminen) auf das Ausscheidungssystem der Mücke, Aedes aegypti, zu bestimmen. Die Malpighian Tubuli (MTs), die für die primäre Urinbildung verantwortlich sind, können stundenlang weiterarbeiten, wenn sie von der Mücke entfernt werden, was Flüssigkeitssekretionsmessungen nach Hormonbehandlungen ermöglicht. Als solches ist der Ramsay-Assay eine nützliche Technik zur Messung der Sekretionsraten von isolierten MTs. Ionenselektive Mikroelektroden (ISME) können sequentiell verwendet werden, um Ionenkonzentrationen (d.h. Na+ und K+) in der sezernierten Flüssigkeit zu messen. Dieser Assay ermöglicht die Messung mehrerer MTs zu einem bestimmten Zeitpunkt und bestimmt die Wirkungen verschiedener Hormone und Medikamente. Die Scanning Ion-selective Electrode Technique verwendet ISME, um die Spannung zu messen, die für die Ionenaktivität in der ungestörten Schicht neben der Oberfläche von ionentransportierenden Organen repräsentativ ist, um den transepithelialen Transport von Ionen in nahezu Echtzeit zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Hormonen und anderen Regulatoren bei der Ionenabsorption oder -sekretion über Epithelien zu verstehen. Hindgut-Kontraktionsassays sind auch ein nützliches Werkzeug, um myoaktive Neuropeptide zu charakterisieren, die die Fähigkeit dieses Organs, überschüssige Flüssigkeit und Abfälle zu entfernen, verbessern oder reduzieren können. Insgesamt geben diese Methoden Aufschluss darüber, wie das Ausscheidungssystem bei erwachsenen Moskitos reguliert wird. Dies ist wichtig, da die funktionelle Koordination der Ausscheidungsorgane entscheidend ist, um Herausforderungen wie Austrocknungsstress nach der Eklosion und vor der Suche nach einem geeigneten Wirbeltierwirt zur Gewinnung eines Blutmehls zu bewältigen.

Die Anwendung von DH31 gegen unstimulierte MTs führt zu einer signifikanten Erhöhung der Flüssigkeitssekretionsrate, was seine Rolle als harntreibendes Hormon bei Aedes-Mücken bestätigt (Abbildung 1A). Wenn Tubuli mit AedaeCAPA-1 behandelt werden, wird eine Verringerung der Sekretionsrate in DH31-stimulierten MTs beobachtet. Abbildung 1B zeigt die Verwendung von ionenselektiven Elektroden zur Messung der Na+ -Ko...

Dieses Protokoll beschreibt Methoden hinter dem Ramsay-Assay, ionenselektiven Mikroelektroden, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) und In-vitro-Kontraktionsassays, die zur Untersuchung des adulten Moskito-Ausscheidungssystems, bestehend aus den Malpigh-Tubuli und dem Hinterdarm, angewendet werden, um gemeinsam Ionen- und Flüssigkeitssekretionsraten, kontraktile Aktivität und transepithelialen Ionentransport zu messen.

Untersuchung der Aktivität von Neuropeptiden und anderen Regulatoren des Ausscheidungssystems bei der erwachsenen Mücke

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

Dieses Protokoll beschreibt Techniken, die von Kleintierphysiologen verwendet werden können, um die Rolle von Neuropeptiden und anderen hormonellen Faktoren aufzuklären, die das Verdauungs- und / oder Ausscheidungssystem regulieren. Diese Techniken ermöglichen Messungen von biologischen Proben in Mikrogröße, die sonst mit Techniken, die speziell für größere Tiermodelle entwickelt wurden, einschließlich beispielsweise Nagetieren und Teleus, nicht möglich wären. Diese Methode kann einen Einblick in die endokrine Regulation des Darms geben, einschließlich des Transports von Epithel- und glatter Muskulatur, die mit dem Magen-Darm-Trakt bei Insekten und bei ähnlich großen Nicht-Insektenarten assoziiert ist.Farwa Sajadi, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird die Nieren-Tuben-Verfahren des Insekts demonstrieren. Darüber hinaus wird ein ehemaliger Doktorand aus meinem Labor Aryan Lajevardi die hindgutfokussierten Protokolle demonstrieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Ramsay- und Kontraktionsassays-Gerichte für die Experimente.Verwenden Sie Pipetten und füllen Sie Vertiefungen mit bis zu 20 Mikrolitern Lösung. Für unstimulierte Kontrollen füllen Sie die Vertiefungen mit 20 Mikrolitern Aedes Kochsalzlösung Schneiders Medium. Sobald alle Bohrlöcher gefüllt sind, gießen Sie hydratisiertes Mineralöl in die Assay-Schale, bis die Bohrlöcher und Minutien-Pins untergetaucht sind.Nachdem Sie den Tubulus in den Brunnen getaucht haben, nehmen Sie das proximale Ende des Tubulus mit einer Pinzette auf, entfernen Sie es aus dem Badetröpfchen und wickeln Sie das Ende um den Stift. Wickeln Sie den Tubulus zweimal um den Stift, wobei die Länge des im Badetröpfchen verbleibenden Tubulus mit den anderen Tubuli übereinstimmt. Um eine natriumselektive Mikroelektrode herzustellen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Elektrode mit 100 Millimolar-Natriumchlorid zu füllen.Stellen Sie sicher, dass sich die Verfülllösung bis zur Spitze der Elektrode füllt. Wenn Luftblasen auftreten, streichen Sie vorsichtig mit der Mikroelektrode oder entfernen Sie die Lösung und füllen Sie sie wieder auf. Tauchen Sie eine 10 Mikroliter Pipettenspitze in die natriumselektive Ionophorlösung.Richten Sie die Elektrode senkrecht zur Pipette aus, legen Sie dann einen behandschuhten Finger über die Unterseite der Spitze, um Druck zu erzeugen und einen kleinen Tropfen Ionophor auszustoßen. Berühren Sie den Ionophortropfen vorsichtig an der Mikroelektrodenspitze und achten Sie darauf, ihn nicht zu brechen. Füllen Sie ein kleines Becherglas auf halbem Weg mit 100 Millimolar Natriumchlorid und legen Sie etwas Modelliermasse auf die Innenseite an der Oberseite des Becherglases.Nachdem der Ionophor aufgenommen wurde, legen Sie die Elektrodenspitze auf die Wand des Becherglases und lassen Sie die Spitzen im Natriumchlorid. Bewahren Sie ISME im Becherglas auf, bis es gebrauchsfertig ist. Um die ISME-Referenzelektrode herzustellen, füllen Sie eine Elektrode mit 500 Millimolkaliumchlorid auf und lagern Sie sie in einem Becherglas.Beschichten Sie die Elektrodenspitzen mit einer Lösung von etwa 3,5% Polyvinylchlorid, gelöst in Tetrahydrofuran, um eine Verschiebung des Ionophors beim Eintauchen in Paraffinöl zu vermeiden. Um die Natriumelektrode zu kalibrieren, legen Sie 10 Mikroliter Tröpfchen Natriumchlorid-Standardkonzentrationen auf den Rand der Ramsey-Schale mit den inkubierten Malpigh-Tubuli. Legen Sie die Standardtröpfchen zwei Zentimeter voneinander entfernt mit der höheren Konzentration darauf.Führen Sie sowohl die Referenzelektrode als auch die ionenselektive Elektrode über die Chloridsilberdrähte ein und befestigen Sie sie sicher mit Elektrodenhaltern, die an Mikromanipulatoren befestigt sind. Navigieren Sie beide Elektroden mit den Mikromanipulatoren zum 200 Millimol-Natriumchlorid-Tröpfchen und stellen Sie sicher, dass die Elektrospitzen den Boden der Schüssel nicht berühren. Schalten Sie das Elektrometer ein, um die Aufnahme zu starten und den Messwert stabilisieren zu lassen.Notieren Sie den Messwert und fahren Sie mit dem nächsten Standard fort. Nachdem Sie messungen der Flüssigkeitssekretionsrate durchgeführt haben, bewegen Sie die Referenz- und ionenselektiven Elektroden vorsichtig mit den Mikromanipulatoren in das sezernierte Tröpfchen. Schalten Sie die Aufzeichnung ein und lassen Sie den Messwert stabilisieren, und nehmen Sie dann auf.Schalten Sie den Ionen-/Polarographieverstärker IPA-2, das Lichtmikroskop und die Computer ein. Legen Sie die natriumselektive Mikroelektrode auf einen Halter, der aus einem Silberchloriddraht besteht, und befestigen Sie sie in der Buchse. Entfernen Sie eine Referenzelektrode mit dem Kaliumchlorid aus dem Becherglas, legen Sie einen Finger an ein Ende und neigen Sie die Glaskapillar zu diesem Finger, um zu verhindern, dass das Agar herausfällt.Legen Sie vorsichtig ein Ende in den Halter, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden. Wenn eine Blase vorhanden ist, entfernen Sie die Referenzelektrode, füllen Sie den Halter mit drei molaren Kaliumchloriden auf und wiederholen Sie den Vorgang. Setzen Sie den Elektrodenhalter in die Buchse ein.Nach der Kalibrierung sezieren Sie das Organ. Legen Sie die Poly-L-Lysin-Schale mit der sezierten Probe auf das Mikroskoptisch und führen Sie die Spitze der Referenzelektrode in die Kochsalzlösung ein. Tauchen Sie die Spitze der ionenselektiven Mikroelektrode in die Kochsalzlösung und achten Sie darauf, die Spitze nicht zu brechen.Verwenden Sie die manuellen Einstellknöpfe, um die Mikroelektrodenposition einzustellen, während Sie unter das Lichtmikroskop schauen. Stellen Sie die vertikale Position der Mikroelektrode so ein, dass sich ihre Spitze auf der gleichen Ebene wie das Organ oder Gewebe befindet, und drehen Sie dann den Motorschalter, um dies zu aktivieren. Bewegen Sie die Mikroelektrode mit den Pfeiltasten des Computers horizontal in eine Position, die drei Millimeter vom Gewebe entfernt ist, um Hintergrundaufnahmen zu messen.Wenn Sie fertig sind, beginnen Sie mit der Aufnahme, indem Sie F5 drücken, und erhalten Sie fünf Messungen der Hintergrundaktivität. Bewegen Sie die Mikroelektrodenspitze nahe an das Gewebe und achten Sie darauf, das Organ nicht zu durchbohren. Reduzieren Sie die Tastentreffempfindlichkeit, um die Mikroelektrodenspitze zwei Mikrometer direkt nach rechts zu platzieren, senkrecht zum Gewebe.Erhalten Sie drei Aufzeichnungen vor Ort entlang des Rektalpolsters, um den Ort der größten Ionenaktivität zu identifizieren, und erhalten Sie dann Baseline-Kochsalzlösungsmessungen an der Stelle, die die größte Aktivität aufweist. Um Hinterdarmkontraktionen aufzuzeichnen, füllen Sie eine der Vertiefungen in der Schale mit einem bekannten Volumen von Aedes-Kochsalzlösung. Nach der Sezierung den sezierten Hinterdarm, der am Mittleren Darm befestigt ist, vorsichtig in einen Brunnen in einer anderen Schüssel geben und darauf achten, dass das Ileum nicht eingeklemmt wird.Tauchen Sie den Darm in die Kochsalzlösung im Brunnen ein und legen Sie Minutien-Stifte in den Mittleren Darm und das Rektum. Das Ileum sollte nicht unter Spannung stehen und spontane Kontraktionen, die an der Pylorusklappe am vorderen Ileum entstehen, sollten beobachtet werden. Schließen Sie die Videokamera an das stereoskopische Mikroskop an.Legen Sie dann die Schale mit dem sezierten Organ unter das Mikroskop und nehmen Sie zwei Minuten lang ein Video auf. Die Anwendung von DH31 gegen unstimulierte Malpighian-Tubuli führt zu einer signifikanten Erhöhung der Flüssigkeitssekretionsrate, was seine Rolle als harntreibendes Hormon bei Aedes-Moskitos bestätigt. Wenn Tubuli mit AedaeCAPA-1 behandelt werden, wird eine Verringerung der Sekretionsrate in DH31 stimulierten Malpighian Tubuli beobachtet.Ionenselektive Elektroden wurden verwendet, um Natriumkonzentrationen in den sezernierten Tröpfchen zu messen. Die Behandlung von DH31 an den MTs hatte keinen Einfluss auf die Natriumkonzentration im sezernierten Tröpfchen. Mit der Anwendung von AedaeCAPA-1 wurde die Natriumkonzentration in der sezernierten Flüssigkeit jedoch signifikant erhöht.Darüber hinaus führte DH31 im Vergleich zu nicht stimulierten Kontrollen zu einer signifikant höheren Natriumtransportrate, während AedaeCAPA-1 diesen Anstieg der DH31-stimulierten Tubuli aufhob. Die SIET wurde verwendet, um Veränderungen im Natriumtransport entlang des rektalen Padepithels von erwachsenen weiblichen Moskitos zu beurteilen. Ein Leucokinin-Analogon wurde verwendet, um Veränderungen in der Natriumabsorption zu untersuchen, was zu einer vierfachen Abnahme der Natriumabsorption im Vergleich zur Salzkontrolle führte.Um die Rolle eines Neuropeptids Pyrokinin2 auf die Ileummotilität zu beurteilen, wurde ein Rhodnius prolixus-Analogon verwendet, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den im Mückenileum angereicherten A.aegypti PK2-Rezeptor aktiviert. Im Vergleich zu den Ausgangswerten hemmt PK2 signifikant die Ileumkontraktionen. Bei der Durchführung eines Ramsay-Assays mit Malpigh-Tubuli und der Messung der Ionen- oder Flüssigkeitssekretionsraten ist es unerlässlich, dass die Tubuli während der Dissektion oder während des Transfers in die Assay-Schale nicht beschädigt werden.Nach dem Ramsay-Assay können spezifische Membrantransporter entweder pharmakologisch oder molekular mit umgekehrten genetischen Techniken angesprochen werden, um ihren spezifischen Beitrag zum transepithelialen Transport von gelösten Stoffen im einfachen Epithel zu erkennen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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Die ausgewachsene Mückenspeicheldrüse (SG) ist für die Übertragung aller durch Mücken übertragenen Krankheitserreger auf ihre menschlichen Wirte, einschließlich Viren und Parasiten, erforderlich. Dieses Video zeigt die effiziente Isolierung der SGs von den Larven (L4) Anopheles gambiae-Mücken und die Vorbereitung der L4-SGs für die weitere Analyse.

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Es werden Verfahren zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mittels AC-DC-Elektropenetrographie beschrieben.

AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

Mikrobielle Gemeinschaften in Mücken sind vielversprechend für biologische Vektorkontrollstrategien. Die meisten Symbionten sind nicht kultivierbar und erfordern metagenomische Analysen. Wir beschreiben eine Methode zur Sezierung weiblicher Mücken und zur Trennung von Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen, um Kreuzkontaminationen zu verhindern, Mikrobiomstudien auf Organebene zu erleichtern und das Verständnis der Rolle von Mikroorganismen in der Mückenbiologie zu verbessern.

Präparierung von Mücken-Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen für Mikrobiomanalysen auf Organebene

Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung des Ausscheidungssystems bei erwachsenen Aedes-Mücken. Dieses Protokoll zeigt Techniken zur Messung von Ionentransport und Flüssigkeitssekretion in Malpighischen Tubuli.

Untersuchung der Aktivität von Neuropeptiden und anderen Regulatoren des Ausscheidungssystems bei der erwachsenen Mücke

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