Name: Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Dezellularisierung des murinen Kardiopulmonalkomplexes für Tissue Engineering. Diese Methode ermöglicht die Erhaltung der strukturellen Integrität der extrazellulären Matrix für biochemische und anatomische Analysen.

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Wir danken Prof. Ivana Novak und Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universität Kopenhagen) für den Zugang zum Mikroskop. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat unterstützt (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR und JTE); ein Promotionsstipendium der Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); der Schwedische Forschungsrat (2017-03389; CDM); die Schwedische Krebsgesellschaft, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj und 190007; CDM); Deutsche Krebshilfe(dpa) RR); und die Dänische Krebsgesellschaft (R204-A12454; RR).

Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.
HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das beste Bildgebungsergebnis und ermöglicht eine langfristige Probenlagerung. Es ist daher wichtig, alle Schritte steril zu halten. Daher müssen alle Instrumente und chirurgischen Materialien, einschließlich Naht, Mikronaht, Lösungen, Schläuche, Luer-Konnektoren und Katheter, steril sein. Oberflächen, einschließlich einer Polystyrolschale, müssen mit 70% Ethanol desinfiziert werden, und die Perfusion sollte vorzugsweise unter einer Laminar-Flow-Haube erfolgen. Alle Eingriffe finden bei Raumtemperatur statt, sofern nicht anders angegeben.
1. Postmortale Mikrochirurgie
<ol><li>Die Maus wird mit einer CO2-Kammer eingeschläfert .<ol>
<li>Legen Sie die Maus in eine 4-Liter-Kammer und beginnen Sie, sich mit 100% CO2 zu füllen, beginnend bei 0,2 l / min für 2 minuten, bis sie nach 3 Minuten einen Durchfluss von 0,8 l / min erreicht. Die Maus sollte während der ersten 2 Minuten bewusstlos werden, und dann sollte die Atmung aufhören (normalerweise etwa 5 Minuten, aber der Fluss kann bei Bedarf aufrechterhalten werden). Bestätigen Sie den Tod, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rasieren Sie Thorax, Bauch und Rücken der Maus mit der Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol. Die Rasur reduziert die Anzahl der Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von Haaren entweder auf Proben zur Bildgebung oder zur biochemischen Analyse erheblich.</li>
	<li>Befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und strecken Sie ihre Vorder- und Hinterbeine sowie kopf- und schwanz aus. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop.</li>
	<li>Mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster stellen Sie einen chirurgischen Zugang mit einem Hautschnitt her, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und seziert subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand ab.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere mit geradem Muster das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte ab und vervollständigen Sie dann eine Sternotomie, indem Sie das Brustbein entlang seiner langen Achse schneiden, dann beide Seiten der Brustwand anheben und festnageln, um den Kardiopulmonalkomplex freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer rundspitzigen Mikrozange (oder Dumont-Mikrozange) den Thymus und das umgebende Fettgewebe, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Dies wird die wichtigsten Schiffe enthüllen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Kauterisation, kauterisieren Sie die absteigende Cava-Vene und schneiden Sie mit einer geraden Musterschere die Speiseröhre.</li>
	<li>Trennen Sie mit einer scharfen Mikrozange die brachiozephalen Venen und die brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagadern und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern.</li>
	<li>Mit einem Mikronadelhalter, einer scharfen Mikrozange und einer 9-0-Naht werden Die Stiche über die Entstehung der brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagader und der linken Arteria subclavia gelegt.</li>
	<li>Kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.</li>
	<li>Trennen Sie die submandibulären Speicheldrüsen entlang der Mittellinie, um die Nackenmuskulatur und die Luftröhre freizulegen. Trennen Sie die Muskeln, um das Cricothyroid-Band freizulegen. Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden.</li>
	<li>Führen Sie einen 27 G-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt (d. H. Bis der Widerstand gegen den Katheter erreicht ist, und ziehen Sie sich dann 3 mm zurück). Achten Sie darauf, die Bronchien nicht zu stören. Legen Sie mit einer 6-0-Naht 3 Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.</li>
	<li>Schneiden Sie die Maus auf der Höhe des 12. Brustwirbels. Die absteigende Aorta verläuft anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Setzen Sie die untere Hälfte auseinander.</li>
	<li>Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer 9-0-Naht 4 Stiche um die Aorta, beginnend 5 mm unter der Katheterspitze.</li>
</ol>2. Dezellularisierung
<ol><li>Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und Luer-Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 min lang mit entionisiertem Wasser bei 200 μL/min perfundieren. Behalten Sie diese Durchflussrate während der Dezellularisation bei.</li>
	<li>Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC), verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es über Nacht.</li>
	<li>Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), das in deionisiertem Wasser verdünnt ist, und perfundieren Sie es 8 Stunden lang.</li>
	<li>Über Nacht mit entionisiertem Wasser perfundieren, um SDS und DOC für 24 h wegzuspülen.</li>
	<li>Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax mit einer gekrümmten Schere schneiden und in einem sterilen Kryorohr mit deionisiertem Wasser mit 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin und 0,3 μM Natriumazid bei 4 °C lagern. ECM-Gerüste können mindestens 12 Wochen gelagert werden1. Wenn das Gerüst für die biochemische Analyse (z. B. Massenspektrometrie) verwendet wird, schockieren Sie in flüssigem Stickstoff.</li>
</ol>3. Immunfärbung
<ol><li>Planen Sie die Bildgebung: Bestimmen Sie den primären Antikörper (oder die Antikörper) und die Kombination von fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern, um zueinander zu passen und die Laserlinien des Fluoreszenzmikroskops anzupassen.</li>
	<li>Blockieren Sie die Probe, indem Sie sie über Nacht in ein Kryotube mit 6% (v /v) Eselserum - 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) eintauchen.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit primären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.</li>
	<li>Waschen Sie 5 mal für 1 h jedes Mal in 0,05% Tween 20 in PBS (PBST).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.</li>
	<li>Waschen Sie 5 mal für 1 Stunde in 0,05% (PBST). Warten Sie 1 h zwischen den einzelnen Wäschen.</li>
	<li>Entionisiertes Wasser hinzufügen und bei 4 °C vor direktem Licht geschützt lagern. An diesem Punkt ist das Gerüst bereit zum Abbild.</li>
</ol>4. Bildgebung
<ol><li>Legen Sie die Probe in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Speicherlösung (PBS oder entionisiertes Wasser).</li>
	<li>Bereiten Sie das Ziel vor. Wir empfehlen die Verwendung eines Wasserimmersionsobjektivs.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.</li>
	<li>Wechseln Sie zur Computersteuerung. Schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochöffnung, Wellenlängen der Detektoren, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für z-stack fest und beginnen Sie mit der Erfassung. Wir empfehlen die Verwendung von Multiphotonen-Laseranregung, um die Gewebepenetration zu erhöhen und lichtstreuung, Bleichmittel und Gewebeschäden zu minimieren.</li>
</ol>5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
<ol><li>Entfernen Sie 1 Lungenlappen von einer eingeschläferten Maus.</li>
	<li>In eine 10 mm x 10 mm x 5 mm große Kryomform geben und mit ca. 500 μL OCT-Compound bedecken.</li>
	<li>Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten.</li>
	<li>Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus gemäß Schritt 2.5 aus.</li>
	<li>In eine Kryomol mit der größten Oberfläche nach unten geben und mit OCT-Verbindung gemäß Schritt 5.2 bedecken.</li>
	<li>Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten, bis etwas anderes erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden.</li>
	<li>Schneiden Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -20 °C in einem Kryostaten mit 5 μm Dicke und legen Sie Abschnitte auf Objektträger aus Glas und lagern Sie sie bei -80 °C.</li>
	<li>Bringen Sie die Folien auf Raumtemperatur, bis sie an der Luft getrocknet sind (ca. 20 min).</li>
	<li>Tauchen Sie kurz in PBS ein und fixieren Sie es, indem Sie die Objektträger 15 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd in PBS tauchen. Einmal in PBS für 5 min waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für 5 min.</li>
	<li>10 Min. in Mayers Hämatoxylinlösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.</li>
	<li>In einem Coplin-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Min. waschen.</li>
	<li>7 Min. in Eosin-Lösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.</li>
	<li>Tauchen Sie in 50% Ethanol, um überschüssiges Eosin zu entfernen und zu dehydrieren, indem Sie kurz in 70% Ethanol und in 96% und 100% Ethanol für 30 Sekunden eintauchen. Mehrmals in Xylol tauchen.</li>
	<li>Tragen Sie einige Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasdeckglas auf.</li>
	<li>Lassen Sie die Folien über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen.</li>
	<li>Scannen Sie Dias in einem Diascanner.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung von ...

Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.
Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastasen-assoziiertes natives ECM2 zu charakterisieren und zu isolieren. Da Tumoren keine richtige anatomische Vaskularisierung fehlt und Mäuse relativ kleine Organismen sind, wurden mikrochirurgische Verfahren entwickelt, um die Aorta retrograd zu katheterisieren, während die Zirkulation des Hauptgefäßes, das zu einem Tumor führt (z. B. die Lungenvenen), isoliert wird, wodurch der Reagenzfluss fokussiert und die Tumordezellularisation ermöglicht wird. Diese Methode erzeugt ECM-Gerüste mit einer konservierten Struktur2, die immungefärbt und abgebildet werden können, was eine ECM-Strukturkartierung im Submikrometer-Detail ermöglicht. Um dieses Protokoll durchzuführen, ist es notwendig, chirurgische und mikrochirurgische Fähigkeiten (Dissektion, Mikroernährung und Katheterisierung) zu erwerben, die eine mögliche Einschränkung seiner Verwendung darstellen können. Unseres Wissens stellt diese Methode den Stand der Technik für die native ECM-Strukturbildgebung dar2,3.

<table><tbody><tr><td>MICROSURGERY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Naht, Nadel mit dreieckigem Schnitt (Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 Mikronaht (Safil)</td><td>B Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Adson Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Adson-Pinzette mit</td><td>Zähnen Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Mikronadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Beatmungskammer für Mäuse-Euthanasie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinst-Laborwassersystem)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Tablett aus Polystyrol (~30 > 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seziermikroskop (Greenough, mit zweiarmigem Schwanenhals)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>Doppelendiger Mikroskopspatel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Mikropinzette (zwei)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Mikrozange mit 45°; Spitzen (zwei)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Haarschneider</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Halsey-Nadelhalter (mit Wolframkarbid-Backen)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Intravenöser 24-Gauge-Katheter (Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>Intravenöser 26-Gauge-Katheter (Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Schere (harter Schnitt, gerade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozange mit Ringspitzen (zwei)</td><td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofederschere (Vannas, gebogen)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Minicutter</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Häutung Periostotom</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln (27 Gauge; Mikrolanze)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>Papiertuch (steril) oder chirurgische Serviette&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zackenschere (CeramaCut, gerade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Spatel (Freer-Yasargil)</td><td>Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen (1 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021001</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen (10 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>Sehnenschere (Walton)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Meerschweinchen IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA(Albumin-Rinderfraktion V, Standardqualität, lyophilisiert)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV polyklonaler Antikörper (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>Wirt: Kaninchen</td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10&fach;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Wirt:</td></tr><tr><td>polyklonaler Ziegen-Periostin-Antikörper (ein freundliches Geschenk von Manuel Koch. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td><td>Wirt: Meerschweinchen</td></tr><tr><td>Skalpell Einweg mit Klinge Nr.11 (Stk. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>Serum (normales Eselsserum)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><<tr><td>strong>IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Detektoren (Hybrid-Detektor (Leica, HyD S-Modell) und Photomultiplier-Röhren (PMTs; )&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fluoreszenz-Lichtquelle&nbsp;</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroskop (inverses Multiphotonenmikroskop)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Objektiv (Lambdablau, 20&fach;, 0,70 numerische Apertur (NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Zwei-Photonen-Ti&ndash; Saphirlaser (Spectra-Physik, Mai Tai DeepSee Modell)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Weißlichtlaser (WLL)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DEZELLULARISIERUNG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol (absoluter Alkoholgehalt 99,9%); absoluter Alkoholgehalt muss mit deionisiertem Wasser auf 70% (vol/vol) eingestellt werden&nbsp;</td><td>Pflaumen</td>- <td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinstwassersystem für Labor)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Luer-zu-Schlauch-Verschraubungen (1/8 Zoll)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4, 10-fach, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe (mit 12 Kanälen)</td><td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch (mit 2 mm Innendurchmesser und 4 mm Außendurchmesser)</td><td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat (DOC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>H& E STAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>Plum</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>Absolute</td><td>ethanol Plum</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (24x50mm; 1000 Stück)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 Stück)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX Eindeckmedium</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Lösung alkoholisch 0,5%</td><td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Feather Mikrotomklinge Edelstahl, C35 (50 Stück)</td><td>Pfm medical</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger (25 x 75 mm; 144 Stück)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td>6319483</tr><tr><td>Mayers Hämatoxylin</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT Verbindung</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

dezellularisation des murinen kardiopulmonalkomplexes

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.
Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.

Kardiopulmonale Dezellularisation Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist <sup ...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.

Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Dieses Protokoll ist das Tor zur extrazellulären Matrix. Es ist Komplexität und ihre Struktur bis in den Submikron-Maßstab. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht also darin, dass sie es ermöglicht, eine extrazelluläre Matrix zu erhalten, die ihre strukturelle Integrität beibehält und so den Weg für biochemische und anatomische Analysen ebnet.Das Verfahren werden von Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten und Maria Rafaeva, derzeit in meinem Labor und Chris Madsen, der in meinem Labor war und die Arbeit an der Universität Lund fortsetzte, demonstriert. Beginnen Sie mit der Rasur des Brustkorbs, des Bauches und des Rückens der eingeschläferten Maus mit einer Haarschneidemaschine. Desinfizieren Sie den Bereich mit 70% Ethanol.Dann befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und verlängern Sie ihre vier Hinterbeine sowie kopf und schwanz. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop. Machen Sie mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster einen Hautschnitt, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und sezieren Sie subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.Verwenden Sie dann eine mikrochirurgische Schere, um die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand zu schneiden. Schneiden Sie das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte mit einer geraden Musterschere. Schließen Sie dann eine Sternotomie ab, indem Sie das Brustbein entlang seiner Längsachse schneiden.Heben und stiften Sie beide Seiten der Brustwand, um den kardiopulmonalen Komplex freizulegen. Verwenden Sie eine runde Mikrozange, um den Thymus und das umgebende Fettgewebe zu entfernen, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Und schneiden Sie die Speiseröhre mit einer Mikroschere ab.Trennen Sie die brachiozephalen Venen und die Arteria brachiocephalica mit einer scharfen Mikrozange. Trennen Sie dann die linken gemeinsamen Carotis- und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern. Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und eine scharfe Mikrozange und eine Neun-Oh-Naht, um Stiche über die Entstehung der brachiocephalen linken Halsschlagader und der linken Subclavia-Arterien zu legen, kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden. Führen Sie einen 27-Gauge-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt, wobei darauf zu achten ist, dass die Bronchien nicht gestört werden. Legen Sie mit einer Sechs-O-Naht drei Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.Schnitt die Maus auf Höhe des 12. Brustwirbels, verläuft die absteigende Aorta anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer Naht vier Stiche um die Aorta, beginnend fünf Millimeter unterhalb der Katheterspitze.Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und untere Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 Minuten lang mit entionisiertem Wasser bei 200 Mikrolitern pro Minute perfundieren. Wechseln Sie dann das Perfusionsmittel zu 0,5% DOC, verdünnen Sie es in deionisiertem Wasser und perfundieren Sie es über Nacht.Wechseln Sie am nächsten Tag das Perfusionsmittel auf 0,1% SDS, verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es acht Stunden lang. Dann 24 Stunden lang mit deionisiertem Wasser perfundieren, um das SDS und DOC wegzuspülen. Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax schneiden.Lagern Sie das Gewebe in einem sterilen Kryoröhrchen in deionisiertem Wasser mit 1% PenicillinStrptomycin und 0,3 mikromolarem Natriumazid bei vier Grad Celsius. Um eine Immunfärbung durchzuführen, blockieren Sie die Probe, indem Sie sie in einem Kryoröhrchen mit 6% Eselserum und 3% BSA über Nacht inkubieren. Dann mit primärem Antikörper in 3% Eselserum in PBS für 24 Stunden inkubieren.Nach der Inkubation die Probe fünfmal in PBST für eine Stunde pro Wäsche waschen. Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern in 3% Eselserum in PBS für 24 Stunden. Wiederholen Sie dann die Wäschen in PBST.Fügen Sie das ionisierte Wasser hinzu und lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius vor direktem Licht geschützt. Um die Probe abzubilden, legen Sie sie in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Lagerlösung. Stellen Sie das Objektiv ein und untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.Wechseln Sie zur Computersteuerung, schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochblende, Wellenlänge, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für den Z-Stack fest und beginnen Sie dann mit der Erfassung. Schneiden Sie einen Lungenlappen aus einer eingeschläferten Maus heraus und legen Sie ihn in eine 10 x 10 x fünf Millimeter große Kryoform.Bedecken Sie es mit etwa 500 Meilen Mikroliter OCT-Compound und frieren Sie es auf Trockeneis ein. Halten Sie die Probe auf dieser Temperatur. Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus heraus, legen Sie ihn in eine Kryoform mit der größten Oberfläche nach unten und bedecken Sie ihn mit OCT-Verbindung.Frieren Sie die Probe auf Trockeneis ein und halten Sie sie auf dieser Temperatur, bis dies anderweitig erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden. Verwenden Sie einen Kryostaten, um gefrorene Gewebeblöcke bei minus 20 Grad Celsius in fünf Mikrometerabschnitte zu schneiden.Und platzieren Sie die Abschnitte auf Glasklebeobjektträgern. Die Folien auf Raumtemperatur bringen, bis die Luft getrocknet ist. Tauchen Sie die Objektträger kurz in PBS ein, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten.Einmal in PBS waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für fünf Minuten pro Waschgang. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in die Hämatoxylinlösung von Myer ein. Als nächstes waschen Sie die Objektträger in einem Copeland-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Minuten und tauchen Sie sieben Minuten in Eosinlösung ein.Mehrmals in Xylol tauchen. Tragen Sie ein paar Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasabdeckungszettel auf. Lassen Sie die Dias über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen und scannen Sie sie dann in einem Diascanner.Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls sind Herz und Lunge sowie NX-Gewebe frei von Zellen. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung der ECM-Gerüste validiert werden. Die Gerüste behalten die Abmessungen von frischen Organen bei und ihre unverträgliche ECM-Struktur ist intakt.ECM-Gerüste zeigten eine erhöhte Durchlässigkeit und Lichtdurchdringbarkeit. Die Verwendung dieses Protokolls mit einem motorisierten Mikroskoptisch ermöglicht die dreidimensionale kachelte Abbildung ganzer Mount-Proben mit einer Auflösung im Submikrometerbereich. Es ist wichtig, den Fluss zu den interessierenden Organen zu meiden, um eine vollständige gleichmäßige Enteignung zu erreichen.Die mikrochirurgische Dissektion und Ligatur von Gefäßen muss wirksam sein. Und respektieren Sie gleichzeitig die Zielgewebe, um die native VCM-Struktur aufrechtzuerhalten. Nach diesem Verfahren werden die Gerüste für strukturelle ECM-Proteine angereichert und können für die Massenspektrometrie oder das Tissue Engineering verwendet werden.Diese Technik ebnet den Weg zur hochauflösenden Abbildung der extrazellulären Matrix.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Herstellung von dezellularisierten extrazellulären Matrix- oder EZM-Gerüsten durch Anwendung einer antegraden Perfusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem. Die strukturellen ECM-Gerüste können dann verwendet werden, um den ECM-Umbau im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen zu analysieren.

Dezellularisierung des kardiopulmonalen Komplexes: Eine Technik zur Dezellularisierung von Herz und Lunge aus dem Mausmodell

Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Die Dezellularisierung ganzer Organe erzeugt natürliche biologische Gerüste, die für die regenerative Medizin verwendet werden können. Die Beschreibung eines nichtmenschlichen Primatenmodells der Lungenregeneration wird vorgestellt, in dem ganze Lungen dezellularisiert und dann mit adulten Stammzellen und Endothelzellen in einem Bioreaktor besiedelt werden, der die Gefäßzirkulation und die Beatmung von Flüssigmedien erleichtert.

Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Die kardiale extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von Molekülen, die Schlüsselprozesse in Geweben und Organen zu orchestrieren, während dauerhafte physiologische Umbau lebenslang. Standardisierte Decellularization der fetalen und adulten Herzen ermöglicht vergleichende experimentelle Studien der beiden Gewebe in einem 3D Kontext durch die Erfassung von native Architektur und biomechanischen Eigenschaften.

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Diese Methode ermöglicht Decellularization ein komplexes solide Organ mit einem einfachen Protokoll basierend auf osmotischen Schock und Durchblutung des Ionischen Waschmittel mit minimalen Orgel Matrix Störung. Es verfügt über eine neuartige Decellularization-Technik für die Herzen der Menschen in einem unter Druck stehenden Beutel mit Echtzeit-Überwachung der Strömung Dynamik und zellulären Schutt Abfluss.

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

Klassischerweise wurde das Endokard des embryonalen Klappenprimordiums der Maus anhand transversaler, koronaler oder sagittaler Schnitte analysiert. Unser neuartiger Ansatz für die enface, zweidimensionale Bildgebung des Endokards in valvulogenen Regionen ermöglicht eine planare Polaritäts- und Zellumlagerungsanalyse des Endokards während der Klappenentwicklung.

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

Dieses Protokoll demonstriert die mikroskopiegesteuerte Isolierung und Immunfluoreszenzfärbung von murinen Pulmonalvenen. Wir bereiten Gewebeproben vor, die den linken Vorhof, die Lungenvenen und die entsprechende Lunge enthalten, und färben sie für kardiales Troponin T und Connexin 43.

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

In diesem Artikel wird beschrieben, wie biotechnologisch hergestellte Mauslungen mit Hilfe von Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsmethoden hergestellt werden können. Es wird auch die anschließende orthotope Lungentransplantation beschrieben.

Transplantation einer biotechnologisch hergestellten Lunge unter Verwendung von dezellularisierten Mauslungen und primären humanen Endothelzellen

Erfahren Sie die Dezellularisierung des murinen Kardiopulmonalkomplexes für Tissue Engineering. Diese Methode ermöglicht die Erhaltung der strukturellen Integrität der extrazellulären Matrix für biochemische und anatomische Analysen.

Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

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