Name: Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Messung des cochleären Blutflusses in Mäusen mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Struktur- und Funktionsänderungen unter normalen und pathologischen Bedingungen.

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Diese Forschung wurde von NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) und Medical Research Foundation der Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi) unterstützt.

HINWEIS: Dies ist eine Operation ohne Überleben. Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oregon Health & Science University überprüft und genehmigt (IACUC-Zulassungsnummer: TR01_IP00000968).
1. Vorbereitung der fluoreszenzmarkierten Blutzellen
<ol><li>Betäuben Sie die Spendermäuse (männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von ~6 Wochen) mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von Ketamin / Xylazin-Anästhesielösung (5 ml / kg, siehe Materialtabelle). HINWEIS: Dieses Anästhesieprotokoll ist sehr zuverlässig und hält den systemischen Blutdruck aufrecht.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf den Rücken, öffnen Sie die Haut und legen Sie die Brusthöhle mit einer Pinzette und einer Sezierschere frei. Schneiden Sie das Zwerchfell auf, greifen Sie mit einer Klemmschere an der Basis des Brustbeins, schneiden Sie durch den Brustkorb und heben Sie es an, um das Herz freizulegen. Sammeln Sie 1 ml Blut in Heparin (15 IE / ml Blut) durch Herzpunktion und zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 3 min bei 4 ° C. Euthanasieren Sie die Maus durch zervikale Dislokation nach der Blutentnahme.</li>
	<li>Entfernen Sie das Plasma, waschen Sie das Blutzellenpellet mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie 3x bei 3000 × g für 3 min bei 4 °C.</li>
	<li>Beschriften Sie die Blutzellen mit 1 ml 20 mM DiO oder Dil in PBS und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur23,24.</li>
	<li>Zentrifugieren und waschen Sie die markierten Blutzellen mit 1 ml PBS, zentrifugieren Sie 3x bei 3000 × g für 3 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 30% Hämatokrit mit ~0,9 ml PBS (Endvolumen ~ 1,3 ml) vor der Injektion.</li>
</ol>2. Operation zur Schaffung eines offenen Fensters 25
<ol><li>Bereiten Sie die sterilen chirurgischen Instrumente und die Bildgebungsplattform vor, und legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang (Abbildung 1A). Betäuben Sie die Mäuse (männliche C57BL / 6J-Mäuse im Alter von ~ 6 Wochen) wie in Schritt 1.1 beschrieben und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pfotenreflex und den allgemeinen Muskeltonus überwachen. Legen Sie das Tier auf das warme Heizkissen und halten Sie die Rektaltemperatur bei 37 °C.</li>
	<li>Legen Sie den Tierschwanz in das CODATM-Überwachungssystem zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag (siehe Materialtabelle). Zeichnen Sie den systolischen Blutdruck, den diastolischen Blutdruck und den mittleren Blutdruck (MBP) des Tieres im anästhesierten Zustand auf. HINWEIS: Es ist kein Unterschied bei der tierischen MBP im anästhesierten und nicht anästhesierten Zustand zu sehen (107 ± 11 mmHg vs. 97 ± 7 mmHg). Die Herzfrequenz des Tieres ist unter Narkose stabil, wenn auch niedriger (immer noch im normalen Bereich) als im nicht betäubten Zustand (357 ± 12 bmp vs. 709 ± 3 bmp). Ein leicht erhöhter Herzschlag sollte bei Tieren in Fesselhaltung26 erwartet werden.</li>
	<li>Öffnen Sie die linke Paukenbulle über einen lateralen und ventralen Zugang unter einem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle), wobei das Trommelfell und die Gehörknöchelchen intakt bleiben21.<ol><li>Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres, wobei der Kopf immobilisiert und positioniert ist, um die Bewegung zu minimieren (Abbildung 1B). Entfernen Sie die linke Unterkieferdrüse und den hinteren Bauch des Digastriummuskels und kauterisieren. HINWEIS: Unterkutan injizieren Sie Buprenorphin in 0,05 mg/kg, um die Schmerzen während der Operation zu reduzieren.</li>
		<li>Lokalisieren und exponieren Sie die knöcherne Bulle, indem Sie den sternocleidomastoideus Muskel und den Gesichtsnerv identifizieren, die sich vor der Bulle erstrecken.</li>
		<li>Öffnen Sie die knöcherne Bulle mit einer 30-G-Nadel und entfernen Sie den umgebenden Knochen vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette, um eine klare Sicht auf die Cochlea und die Arteria stapedialis zu ermöglichen, deren medialer Rand über dem Rand der runden Fensternische liegt und anterior superior zum ovalen Fenster führt (Abbildung 1C, D). HINWEIS: Die Tracheotomie wird durchgeführt, um die Atemwege ungehindert zu halten, und sollte nur durchgeführt werden, wenn das Tier während der Operation ein Atemproblem hat. Im Allgemeinen haben die meisten Tiere unter Narkose eine glatte Atmung. Wenn Tiere jedoch während der Operation eine Tracheotomie erhielten, sollte der aufgezeichnete Blutfluss nicht für einen Vergleich verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie eine kleine Messerklinge (speziell gefrästes #16-Skalpell), um den seitlichen Wandknochen an der Apex-Mitteldrehung der Maus-Cochlea, etwa 1,25 mm von der Spitze entfernt, abzukratzen, bis eine dünne Stelle gerissen ist. Entfernen Sie die Knochenspäne mit kleinen Drahthaken (Abbildung 1E).</li>
	<li>Decken Sie das Gefäßfenster mit einem geschnittenen Deckglas ab, um normale physiologische Bedingungen zu erhalten, und bieten Sie eine optische Ansicht für die Aufnahme von Gefäßbildern. HINWEIS: Alle Verfahren sind mit Vorsicht durchzuführen. Neben der Überwachung der Körpertemperatur sollten auch die Vitalfunktionen des Tieres, einschließlich Blutdruck und Herzschlag, während der gesamten Operation überwacht werden.</li>
</ol>3. Bildgebung von CoBF unter FIVM
<ol><li>Machen Sie einen ~1 cm langen Schnitt entlang der rechten Vena saphena, um das Gefäß freizulegen (Abbildung 1F).</li>
	<li>100 μL der FITC-Dextran-Lösung (2000 kDa, 40 mg/ml in PBS) und 100 μL einer Blutzellsuspension (30% Hämatokrit) nacheinander durch die Stammvene in das Tier infundiert werden (Abbildung 1G), um die Visualisierung der Blutgefäße und die Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit zu ermöglichen.</li>
	<li>Beobachten Sie den Blutfluss in Echtzeit direkt auf einem Videomonitor 5 Minuten nach der Injektion. Abbildung der Blutgefäße mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand (B.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 numerische Apertur) und einem Lampengehäuse mit einem Mehrband-Anregungsfilter und einem kompatiblen Emissionsfilter (Table of Materials) ausgestattet ist. Nehmen Sie das Video mit einer hochauflösenden digitalen Schwarzweißkamera (Table of Materials) mit 2 Bildern / s auf. Erfassen Sie mehr als 350 Bilder pro Video, um eine erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten. HINWEIS: Blutgefäße sowohl des Spiralbandes als auch der Stria vascularis können durch Einstellen des optischen Fokus abgebildet werden (Supplemental Video 1).</li>
</ol>4. Videoanalyse
<ol><li>Messen Sie den Gefäßdurchmesser mit einer geeigneten Software (Table of Materials) und bestimmen Sie den Abstand zwischen zwei festen Punkten über das Gefäß in den aufgenommenen Bildern.</li>
	<li>Berechnen Sie die Blutflussgeschwindigkeit aus aufgenommenen Videobildern, indem Sie die Bewegung markierter Blutzellen in der räumlichen Entfernung zwischen Bildpositionenverfolgen 27.<ol><li>Öffnen Sie das Video des Blutflusses in der Software (Fidschi [ImageJ] wurde in diesem Protokoll verwendet) und stellen Sie die Skala der Bilder ein.</li>
		<li>Verfolgen Sie die ausgewählten DiO-gefärbten Blutzellen mit der Tracking-Funktion. Verwenden Sie die Entfernung, die sich die Zellen bewegt haben, und das Zeitintervall zwischen den Bildbildern im Video zur automatischen Berechnung der Strömungsgeschwindigkeit.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie den Volumenstrom (F) nach folgender Gleichung: F = V × A. (V: Geschwindigkeit; A: Querschnittsfläche des Schiffes).</li>
</ol>5. Lärmbelastung
<ol><li>Setzen Sie die Tiere in Maschendrahtkäfige. Setzen Sie sie Breitbandrauschen bei 120 dB Schalldruckpegel in einer Schallexpositionskabine für 3 h und für weitere 3 h am nächsten Tag aus. HINWEIS: Dieses Lärmexpositionsregime, das routinemäßig in diesem Labor angewendet wird, führt zu einem dauerhaften Verlust der Cochlea-Empfindlichkeit28.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit zeigt, wie Kapillaren in der Cochlea-Seitenwand (und in der Stria vascularis) eines Mausmodells mit Fluorophormarkierung in einer offenen Gefäßfensterpräparation unter einem FIVM-System sichtbar gemacht werden können. Das Mausmodell ist weit verbreitet und wird als Säugetiermodell zur Untersuchung der menschlichen Gesundheit und Krankheit bevorzugt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein praktikabler Ansatz zur Bildgebung und Untersuchung von CoBF in der Mausseitenwand (insbesondere in der Striaa vascularis...

Die normale Funktion der Mikrozirkulation in der lateralen Cochlea-Wand (die den Großteil der Kapillaren im Spiralband und in der Stria vascularis umfasst) ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Hörfunktion1. Abnorme CoBF ist an der Pathophysiologie vieler Innenohrerkrankungen beteiligt, einschließlich lärmbedingtem Hörverlust, Ohrhydrops und Presbyakusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Die Visualisierung der intravitalen CoBF ermöglicht ein besseres Verständnis der Zusammenhänge zwischen Hörfunktion und cochlea-vaskulärer Pathologie.
Obwohl die Komplexität und Lage der Cochlea im Schläfenbein eine direkte Visualisierung und Messung von CoBF ausschließt, wurden verschiedene Methoden zur Beurteilung von CoBF entwickelt, darunter Laser-Doppler-Durchflussmessung (LDF)10,11,12, Magnetresonanztomographie (MRT)13, intravitale Fluoreszenzmikroskopie (FIVM)14, Fluoreszenzmikroskopie (FME)15, endoskopische Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI)16 und Ansätze, die auf der Injektion markierter Marker und radioaktiv markierter Mikrosphären in den Blutkreislauf basieren (optische Mikroangiographie, OMAG)17,18,19,20. Keine dieser Methoden hat jedoch eine absolute Echtzeitverfolgung von Änderungen in CoBF in vivo ermöglicht, mit Ausnahme von FIVM. FIVM, in Kombination mit einem Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, ist ein Ansatz, der bei Meerschweinchen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen von verschiedenen Laboratorien verwendet und validiert wurde 14,21,22.
Eine FIVM-Methode wurde erfolgreich etabliert, um die strukturellen und funktionellen Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation in der Maus unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran als Kontrastmittel und einem Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen - entweder DiO (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat, grün) oder Dil (1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyaninperchlorat, rot) - zur Vormarkierung von Blutzellen, zur Visualisierung von Gefäßen und zur Verfolgung der Blutflussgeschwindigkeit. In der vorliegenden Studie wurde das Protokoll dieser Methode zur Bildgebung und Quantifizierung von Veränderungen der CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen (z. B. nach Lärmexposition) beschrieben. Diese Technik gibt dem Forscher die notwendigen Werkzeuge an die Hand, um die zugrunde liegenden Mechanismen von CoBF im Zusammenhang mit Hörstörungen und Pathologie in der Stria vascularis zu untersuchen, insbesondere wenn sie in Verbindung mit leicht verfügbaren transgenen Mausmodellen angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>0,9% Natriumchlorid</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1966-02</td><td>0,6 mL (für 1 mL)</td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td>20 &micro; M</td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocyanin perchloratDio (3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocyanin perchlorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292</td><td>20 &micro; M</td></tr><tr><td>CODA Monitorsystem</td><td>Kent scientific</td><td></td><td>CODA Monitor, zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperaturregler</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Messung des Gefäßdurchmessers</td></tr><tr><td>FITC-dextran (2000 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000s</td><td>40 mg/ml</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektion, USP MDV</td><td>Mylan</td><td>NDC 67457-374-12</td><td>5000 USP-Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Katathesie (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0702-1</td><td>0,2 mL (für 1 mL)</td></tr><tr><td>Mikroskop Objektiv</td><td>Mitutoyo</td><td>378-823-5</td><td>Modell: M Plan Apo NIR 10x</td></tr><tr><td>ORCA-ER Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Modell: C4742-80-12AG</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>2085387</td><td></td></tr><tr><td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x verdünnt für den Gebrauch)</td><td>Lloyd</td><td>LPFL04821</td><td>0,2 mL (für 1 mL)</td></tr><tr><td>Zoom Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Modell: SZ61, Fluoreszenzmikroskop</td></tr></tbody></table>

messung des restrischen blutflusses in maus-cochlea mittels offenem gefäßfenster und intravitaler fluoreszenzmikroskopie

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Die Schalltransduktion ist metabolisch anspruchsvoll, und die normale Funktion der Mikrovaskulatur in der Seitenwand ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des endocochleären Potenzials, des Ionentransports und des Flüssigkeitshaushalts. Es wird berichtet, dass verschiedene Formen von Hörstörungen eine abnormale Mikrozirkulation in der Cochlea beinhalten. Die Untersuchung, wie sich die Pathologie des Cochlea-Blutflusses (CoBF) auf die Hörfunktion auswirkt, ist aufgrund des Mangels an praktikablen Abfragemethoden und des schwierigen Zugangs zum Innenohr eine Herausforderung. Ein offenes Gefäßfenster in der lateralen Cochlea-Wand, kombiniert mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, wurde zur Untersuchung von CoBF-Veränderungen in vivo verwendet, hauptsächlich jedoch bei Meerschweinchen und erst kürzlich in der Maus. Dieser Artikel und das zugehörige Video beschreiben die offene Gefäßfenstermethode zur Visualisierung des Blutflusses in der Maus-Cochlea. Zu den Details gehören 1) Herstellung der fluoreszenzmarkierten Blutzellsuspension von Mäusen; 2) Konstruktion eines offenen Gefäßfensters für die intravitale Mikroskopie in einer anästhesierten Maus und 3) Messung der Blutflussgeschwindigkeit und des Blutvolumens mittels einer Offline-Aufzeichnung der Bildgebung. Die Methode wird im Videoformat präsentiert, um zu zeigen, wie der Open-Window-Ansatz in der Maus verwendet werden kann, um strukturelle und funktionelle Veränderungen in der Cochlea-Mikrozirkulation unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.

Nach chirurgischer Exposition der Cochlea-Kapillaren in der Seitenwand (Abbildung 1) war eine intravitale hochauflösende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung von Dil-markierten Blutzellen in FITC-Dextran-markierten Gefäßen durch ein offenes Gefäßfenster möglich. Abbildung 2A ist ein repräsentatives Bild, das unter FIVM aufgenommen wurde und die Kapillaren der Cochlea-Apex-Middle Turn Seitenwand der Maus zeigt. Die Lumina dieser ...

Ein offener Gefäßfensteransatz mit fluoreszierenden Tracern bietet eine ausreichende Auflösung für die Messung des Cochlea-Blutflusses (CoBF). Die Methode erleichtert die Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen von CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen.

Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Eine normale Blutversorgung der Cochlea ist von entscheidender Bedeutung für die Cochlea Morbus Menière, insbesondere für die Aufrechterhaltung des Cochlea-Potenzials in Innenräumen, das die wesentliche treibende Kraft für die Transaktion von Haarzellen ist. Diese Funktion der Durchblutung wurde eng mit verschiedenen Formen von Hörverlust in Verbindung gebracht. Ein besseres Verständnis des Cochlea-Blutflusses ermöglicht eine effektivere Behandlung von Hörstörungen, die auf Blutflussstörungen zurückzuführen sind.Die direkte Blutflussmessung ist jedoch aufgrund der Schwierigkeit, das Innenohr zu beurteilen, sehr schwierig. Techniken zur Beurteilung des Cochlea-Blutflusses befinden sich derzeit noch in der Entwicklung. Hier demonstrieren wir eine der neuesten Methoden, die in unserem Labor etabliert wurden, öffnen das Muskelfenster in der Anpassung mit einem hochauflösenden Fluoreszenzmikroskop, um den Cochlea-Blutfluss bei Kleintierarten wie Mäusen einzuschränken.Die Anwendung dieser Technik mit transgenetischen Massenmodellen hat das Potenzial, die Forschung voranzutreiben, um die Zusammenhänge zwischen der Hörfunktion und der Pathologie im Zusammenhang mit dem Cochlea-Blutfluss bei intravaskulärem Risiko zu entschlüsseln. Unsere Verfahren sollten mit Vorsicht durchgeführt werden. Zusätzlich zu den momentanen Körperblutungen müssen die Vitalfunktionen des Tieres, einschließlich Blutdruck und Herzschlag, während der Operation überwacht werden.Beginnen Sie mit dem Sammeln von etwa einem Millimeter Blut in Heparin durch Herzpunktion. Zentrifugieren Sie das Blut bei 3000 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Plasma und waschen Sie dann das Blutzellenpellet dreimal mit einem Milliliter PBS durch Zentrifugieren bei 3000 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.Markieren Sie die Blutzellen mit einem Milliliter 20 Mikromolar DiO oder Dil in PBS und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die markierten Blutzellen mit einem Milliliter PBS und zentrifugieren Sie dreimal bei 3000 mal G für drei Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet vor der Injektion in 30% Hämatokrit mit etwa 0,9 Milliliter PBS.Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente und Bildgebungsplattform vor und legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang. Überwachen Sie den schlechten Reflex und den allgemeinen Muskeltonus der anästhesierten Mäuse, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen. Legen Sie das Tier auf das warme Heizkissen und seinen Schwanz in das Monitorsystem zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag.Halten Sie die rektale Temperatur bei 37 Grad Celsius und zeichnen Sie den systolischen Blutdruck, den diastolischen Blutdruck und den mittleren Blutdruck des Tieres im betäubten Zustand auf. Öffnen Sie die linke Paukenbulle über einen seitlichen und ventalen Zugang unter einem Stereomikroskop, wobei das Trommelfell und die Gehörknöchelchen intakt bleiben. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres mit immobilisiertem Kopf, um die Bewegung zu minimieren.Entfernen Sie die linke Unterkieferdrüse und den hinteren Bauch des Digastrmuskels und kauterisieren. Lokalisieren und exponieren Sie die knöcherne Bulle, indem Sie den sternocleidomastoideus Muskel und den Gesichtsnerv identifizieren, die sich vor der Bulle erstrecken. Öffnen Sie die knöcherne Bulle mit einer 30-Gauge-Nadel und entfernen Sie den umgebenden Knochen vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette, um eine freie Sicht auf die Cochlea- und Stapedialarterie mit ihrem medialen Rand zu erhalten, der über dem Rand der runden Fensternische liegt und eine vordere Oberseite zum ovalen Fenster verursacht.Verwenden Sie eine kleine Messerklinge, um den seitlichen Wandknochen an der Spitze der mittleren Drehung der Mauscochlea etwa 1,25 Millimeter von der Spitze entfernt abzukratzen, bis eine dünne Stelle gerissen ist. Entfernen Sie die Knochenspäne mit kleinen Drahthaken. Decken Sie das Gefäßfenster mit einem geschnittenen Abdeckglas ab, um normale physiologische Bedingungen zu erhalten, und bieten Sie eine optische Ansicht für die Aufnahme von Gefäßbildern.Machen Sie einen Zentimeterschnitt entlang der rechten Stammvene, um das Gefäß freizulegen. Gießen Sie nacheinander jeweils 100 Mikroliter der FITC-Dextran-Lösung und der Blutzellsuspension durch die Stammvene in das Tier, um die Visualisierung der Blutgefäße und die Verfolgung des Blutflusses zu ermöglichen. Beobachten Sie den Blutfluss fünf Minuten nach der Injektion in Echtzeit auf einem Videomonitor.Bilden Sie die Blutgefäße mit einem Fluoreszenzmikroskop ab, das mit einem Objektiv für große Arbeitsentfernungen und einem Lampengehäuse ausgestattet ist, das einen Mehrband-Anregungsfilter und einen kompatiblen Emissionsfilter enthält. Nehmen Sie das Video mit einer hochauflösenden digitalen Schwarzweißkamera auf, die mehr als 350 Bilder pro Video aufnimmt. Um eine erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten.Messen Sie den Gefäßdurchmesser mit einer geeigneten Software und bestimmen Sie den Abstand zwischen zwei festen Punkten über das Gefäß in den aufgenommenen Bildern. Öffnen Sie das Video des Blutflusses in der Software und stellen Sie die Skala der Bilder ein. Verfolgen Sie die ausgewählten DiO-gefärbten Blutzellen mit der Tracking-Funktion.Verwenden Sie dann die Entfernung, die sich die Zellen bewegt haben, und das Zeitintervall zwischen den Bildbildern im Video zur automatischen Berechnung der Strömungsgeschwindigkeit. Berechnen Sie den Volumenstrom anhand der im Textmanuskript angegebenen Gleichung. Um das Lärmexpositionsmodell vor der Blutflussaufzeichnung zu erstellen, setzen Sie die Tiere in Maschendrahtkäfige und setzen sie drei Stunden lang Breitbandlärm bei 120 Dezibel Schalldruckpegel in einer Schallexpositionskabine aus.Dann für weitere drei Stunden am nächsten Tag. Zeichnen Sie den Blutfluss zwei Wochen nach der Lärmbelastung auf. Nach chirurgischer Exposition der Cochlea-Kapillaren in der Seitenwand wurde eine intravitale hochauflösende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung von DiL-markierten Blutzellen in FITC-Dextran-markierten Gefäßen durch ein offenes Gefäßfenster durchgeführt.DiL-markierte Blutzellen in Stria Gefäßen, die mit FITC Dextran markiert sind, sind hier dargestellt. Dio-markierte Blutzellen, die mit FITC Dextran markiert sind, zeigen, dass die Gefäßdichte des Spiralbandes spärlicher ist als die des dichteren Stria vascularis. Hochauflösende IVM zeigt die Blutflussmuster in Kontroll- und Lärmgruppen.Das gestörte Muster der Durchblutung ist in den lärmexponierten Gruppen zu sehen. Zu den Anomalien gehörten ein verringerter Gefäßdurchmesser und eine erhöhte Variation des Gefäßdurchmessers. Die Blutflussgeschwindigkeiten in den Kontroll- und Lärm-exponierten Gruppen wurden berechnet, indem die Wurzeln der DiO-markierten Blutzellen verfolgt wurden.Die Blutgeschwindigkeit und das Blutvolumen in der lärmexponierten Gruppe waren signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Die erfolgreiche Etablierung des offenen Gefäßfensters erfordert ein hohes Maß an chirurgischem Geschick. Beim Entfernen des Knochens der Cochlea-Seitenwand ist Vorsicht geboten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine neue vielseitige Methode zur Beobachtung der Mikrozirkulation wird vorgestellt. Es gilt als geeignet für eine langfristige Beobachtung und für die Kombination mit pharmacophysiological oder molekularbiologische Eingriffe.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

Kortikale Durchblutung Dynamik kann in vivo durch bildgebende fluoreszierenden Dextran Farbstoffe in die Schwanzvene von Nagetieren, die mit 2-Photonen-Mikroskopie injiziert untersucht werden. Dieses Video zeigt, wie man Bild Blutfluss Dynamik in Neokortex der Maus über einen mit Glas überdachten kranialen Fenster Vorbereitung.

Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Dieses Video demonstriert die intravitale Fluoreszenzmikroskopie-Technik zur Untersuchung der Thrombusbildung in einem Mausmodell. Der Maus wird ein mit Fluorophor markiertes Polysaccharid injiziert, um die Durchblutung zu überwachen. Bei Beleuchtung mit einem hochintensiven Licht führt die phototoxische Induktion einer Verletzung in den Mikrogefäßen des Ohrs zur Bildung eines Thrombus, was durch die Visualisierung der Obstruktion im Blutfluss bestätigt wird.

Intravitale Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der mikrovaskulären Thrombusbildung

Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

Intravitalmikroskopie kann bei Tieren verwendet werden, um retinale Gefäßdurchmesser, Blutbahngeschwindigkeiten und den gesamten retinalen Blutfluss sichtbar zu machen und zu messen.

Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen

Dieser Artikel berichtet über eine detaillierte Methode zur dynamischen Messung und Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit in einzelnen Blutgefäßen des Lebergefäßsystems der Maus unter Verwendung der intravitalen mikroskopischen Bildgebung in Kombination mit einer spezifischen Methodik zur Bildaufnahme und -analyse.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Die Live-Zell-Bildgebung der markierten Blutzellen im Augenkreis kann Informationen über Entzündungen und Ischämie bei diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration liefern. Ein Protokoll zur Etikettierung von Blutzellen und Bild der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation ist beschrieben.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Das retinale Gefäßsystem der Maus ist besonders interessant, um die Mechanismen der Gefäßmusterbildung zu verstehen. Dieses Protokoll misst automatisch den Durchmesser von Netzhautgefäßen der Maus aus fluoreszierenden Angiographie-Fundusbildern in einem festen Abstand zur Sehscheibe.

Messung des retinalen Gefäßdurchmessers aus Fluoreszenzangiographie-Bildern der Maus

Erfahren Sie die Messung des cochleären Blutflusses in Mäusen mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Struktur- und Funktionsänderungen unter normalen und pathologischen Bedingungen.

Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie

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