Name: Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting zur Durchführung einer Strukturanalyse höherer Ordnung von Proteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie laserfreies Hydroxylradikal-Protein-Footprinting für Strukturanalysen höherer Ordnung. Diese Methode mit Inline-Radikaldosimetrie verbessert Reproduzierbarkeit und spart Zeit sowie Proben.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 und R44GM125420) finanziert.

1. Einbau des Kapillarrohrs
<ol><li>Mit einem Kieselsäurespaltenstein 250 μm Innendurchmesser (ID) Silica-Kapillare auf 27 Zoll spalten. Überprüfen Sie die Kapillarenden auf einen sauberen, geraden Schnitt.</li>
	<li>Erstellen Sie zwei Fenster mit einer Länge von etwa 15 mm, indem Sie die Polyimidbeschichtung verbrennen. Ausgehend vom "unteren Ende" ist das erste Photolysefenster 90 mm vom "unteren Ende" und das zweite Dosimeterfenster 225 mm vom "unteren Ende" entfernt. HINWEIS: Sobald die Beschichtung weggebrannt ist, ist die Kapillare sehr zerbrechlich.</li>
	<li>Schrauben Sie die Mutter und die Ferrule an Port 5 ab und setzen Sie das "untere Ende" der Kapillare direkt hinter dem konischen Ende der Ferrule ein (Abbildung 1A).</li>
	<li>Entfernen Sie auf dem Photolysemodul die Photolyse-Zellkappe, indem Sie sie gerade herausziehen, und entfernen Sie dann die magnetisch montierte Metallmaske, die die Kapillare an Ort und Stelle hält. ACHTUNG: Im Inneren der Photolyse-Zellkappe befindet sich ein gekrümmter Spiegel, lassen Sie nichts den Spiegel berühren.</li>
	<li>Öffnen Sie auf dem Dosimetermodul die Dosimeterzelle, indem Sie auf die Lasche auf der linken Seite drücken und die Dosimeterzelle nach rechts öffnen. Entfernen Sie die magnetisch angebrachten Clips, die die Kapillare an Ort und Stelle halten.</li>
	<li>Legen Sie die Kapillare in den gerillten Kanal in der Basis der Photolysezelle. Zentrieren Sie das Kapillarfenster mit dem Photolysezellenfenster. Während Sie die Kapillare mit einer Hand in Position halten, fügen Sie die magnetische Maske hinzu, um die Kapillare an Ort und Stelle zu halten. Setzen Sie die Photolysekappe wieder in Position.</li>
	<li>Legen Sie die Kapillare in den gerillten Kanal in der Basis der Dosimeterzelle. Zentrieren Sie das zweite Kapillarfenster auf die kleine Öffnung in der Mitte der Dosimeter-Zellbasis. Während Sie die Kapillare mit einer Hand in Position halten, platzieren Sie die beiden magnetischen Clips in Position, um die Kapillare an Ort und Stelle zu halten. Schließen Sie die Dosimeterzelle, bis sie auf Geschlossen klickt.</li>
	<li>Führen Sie die Kapillare durch die Rändelmutter auf den Kapillarlift des Produktkollektors ein (Abbildung 1B). Verlängern Sie die Kapillare bis knapp über den Boden der Durchstechflasche. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Kapillare den Boden der Durchstechflasche erreicht, um sicherzustellen, dass die Kapillare während eines Experiments in die Abschrecklösung eingetaucht ist.</li>
</ol>2. Einbau einer Injektionsschleife
<ol><li>Verwenden Sie Teflonschläuche mit einem Außendurchmesser von 1/16" und einem Innendurchmesser von 0,015" (381 μm). Folgen Sie Gleichung 1, um die Länge des Schlauches zu berechnen, der für das gewünschte Volumen benötigt wird, indem Sie Gleichung 1 verwenden. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg"> Dabei ist L die Länge des Schlauches in Millimetern, V das gewünschte Volumen in Mikrolitern und d der Rohrinnendurchmesser in Millimetern. Für ein Injektionsvolumen von 25 μL und einen Innendurchmesser von 381 μm muss die Schlauchlänge ca. 219,3 mm beträgen. HINWEIS: Für Volumina unter 20 μL verwenden Sie PTFE-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,01".</li>
	<li>Schneiden Sie den Teflonschlauch mit einem Rohrschneider auf die erforderliche Länge. Überprüfen Sie die Enden des Rohres auf einen sauberen, geraden Schnitt.</li>
	<li>Setzen Sie ein Ende der neuen Injektionsschlaufe durch eine der Muttern ein und legen Sie eine neue Ferrule auf das Ende des Rohrs. Halten Sie die Ferrule und die Mutter an Ort und Stelle und führen Sie das Rohr in Port 3 des Einspritzventils ein, bis es im Ventil auf den Boden fällt. Halten Sie das Röhrchen fest und ziehen Sie den Mutterfinger fest. Ziehen Sie die Mutter mit einem Schraubenschlüssel 1/4 Umdrehung weiter an. Entfernen und überprüfen Sie die Baugruppe. HINWEIS: Wenn die Ferrule nicht in Position fixiert ist, installieren Sie sie neu und ziehen Sie sie 1/8 weiter an. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Ende der Schleife.</li>
	<li>Sobald beide Enden eine Mutter und eine feste Ferrule haben, schrauben Sie ein Ende lose an Port 3 und das andere Ende an Port 6 (Abbildung 1C). Sobald Sie in Position sind, ziehen Sie beide Seiten fest, um den Finger fest zu machen, dann drehen Sie sich 1/4 mit einem Schraubenschlüssel am Finger vorbei.</li>
</ol>3. Initialisieren Sie das Photolysesystem
<ol><li>Schalten Sie die Photolysemodule in der folgenden Reihenfolge ein: (1) Fluidikmodul (2) Photolysemodul (3) Dosimetriemodul (4) Produktkollektor und schließlich (5) den Systemcomputer und starten Sie die Steuerungssoftware HINWEIS: Lassen Sie dem Dosimeter-Modul mindestens eine halbe Stunde Zeit, um sich von einem Kaltstart aufzuwärmen.</li>
	<li>Den Schlauch vollständig von der Position "Ventil" an der Spritzenpumpe (Abbildung 1D) in 10 ml Puffer tauchen. Legen Sie den Schlauch aus der Position "Abfall" (Abbildung 1D) und den Schlauch von Port 2 auf den Spritzenanschluss (Abbildung 1C) in einen leeren Behälter, um Abfälle zu sammeln. HINWEIS: Verwenden Sie den Puffer, in dem Ihr Protein suspendiert wird. Ein empfohlener Puffer ist 10 mM NaPO4.</li>
	<li>Legen Sie auf dem Produktkollektorkarussell 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen an die mit H und 6 gekennzeichnete Position.</li>
	<li>Wenn Sie eine 250 μm ID-Kapillare verwenden, stellen Sie den Lastdurchfluss auf 500 μL/min, den Verarbeitungsdurchfluss auf 7,5 μL/min und den Abfalldurchfluss auf 500 μL/min ein.</li>
	<li>Berechnen Sie die Blitzverzögerung, die Produktzeit und die Verschwendungszeit für die Verwendung des halbautomatischen Modus mit Gleichung 2. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg"> Dabei ist t die Zeit in Minuten, s der Kapillarabstand in Millimetern, d der Innendurchmesser der Kapillare in Millimetern und f die Durchflussrate in μL/min.<ol>
<li>Für die Blitzverzögerung beträgt der Abstand vom "unteren Ende" der Kapillare zum ersten Fenster, das etwa 90 mm betragen sollte. Mit 250 μm ID-Kapillare und einer Verarbeitungsdurchflussrate von 7,5 μL/min gelangt die Probe in etwa 35 Sekunden zum Photolysefenster. Lassen Sie zwei Blitze bei 1 Hz auftreten, bevor die Samples ankommen, also stellen Sie die Blitzverzögerung auf 33 Sekunden ein.</li>
		<li>Geben Sie für die Produktzeit die Zeit ein, die die injizierte Lösung benötigen wird, um vom Injektionsventil zum Ende der Kapillare zu fließen. Für eine 27" lange 250 μm ID-Kapillare stellen Sie die Produktzeit auf 4,5 Minuten ein.</li>
		<li>Geben Sie für die Verschwendungszeit die Zeit ein, die das Gesamtvolumen der injizierten Lösung benötigen wird, um gesammelt zu werden. Zu diesem Zeitpunkt wechselt der Produktsammler von der Produktposition zur Abfalldurchstechflasche. Bei einem Injektionsvolumen von 25 μL und einem Durchfluss von 7,5 μL/min wird die Verschwendungszeit auf 7,8 Minuten eingestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie die Injektionsschleife fünfmal aus, indem Sie 25 μL HPLC-Wasser in den Injektionsanschluss injizieren, wobei das Einspritzventil auf die Lastposition eingestellt ist.</li>
	<li>Drehen Sie das Einspritzventil manuell in die Einspritzposition, um den Rest des Systems zu spülen. Wählen Sie in der Steuerungssoftware Prozess (Aus), um mit dem Fließen von Wasser zu beginnen. Heben Sie während des Fließens den Kapillarlift des Produktkollektors an, indem Sie unter dem Produktkollektor Nach oben auswählen, damit Sie das Ende der Kapillare sehen können. Fließen Sie Wasser durch die Kapillare, bis sich ein Tröpfchen bildet. HINWEIS: Wenn sich kein Tröpfchen bildet, überprüfen Sie das Injektorventil auf Lecks. Wenn es ein Leck gibt, lösen Sie die Mutter, setzen Sie die Kapillare wieder ein und schrauben Sie sie wieder an.</li>
</ol>4. Bestimmen Sie die tatsächliche ▪OH-Ausbeute, um radikalische Aufrascheffekte aus dem Puffer zu testen.
<ol><li>Starten Sie in der Steuerungssoftware den Ablauf, indem Sie Prozess (Aus) auswählen. Stellen Sie auf der Registerkarte Einstellungen die Blitzspannung auf 0 V ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Manuelle Steuerung im Abschnitt Dosimeterdaten die Option Daten starten + AutoZeroaus.</li>
	<li>Wählen Sie die Position für die Produktfläschchen (H) und die Abfallfläschchen (6).</li>
	<li>Wählen Sie Bereit,drehen Sie das Einspritzventil manuell in die Lastposition herunter und injizieren Sie 25 μL 1 mM Adenin mit 100 mMH2O2 in den Einspritzanschluss. Nach der Injektion drehen Sie das Einspritzventil manuell in die Einspritzposition. HINWEIS: Dadurch wird das System automatisch veranlasst, den Durchfluss zu starten, die Plasmaquelle einzuschalten und die Dosimetriedaten zu erfassen.</li>
	<li>Fahren Sie die Spannung hoch, indem Sie zur Registerkarte Einstellungen navigieren und die Blitzspannung ändern. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 mit 500 V, 750 V, 1000 V und 1250 V. Führen Sie das Ablesen der Adeninabsorption bei jeder Spannung in Triplikaten durch.</li>
	<li>Wählen Sie die Registerkarte Berechnungen, um die durchschnittliche Absorption jeder Probe zu bestimmen. Klicken Sie zunächst auf Auswählen, und wählen Sie dann manuell den Anfang und das Ende der Spitzenabsorption aus. Geben Sie im verfügbaren Bereich eine Beschreibung des Beispiels ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle erfassten Daten. HINWEIS: Blasen können sich bilden, die zu einem Anstieg des Dosimeterwerts führen. Wenn Sie Daten auswählen, um die durchschnittliche Absorption zu bestimmen, lassen Sie Bereiche mit Blasen weg.</li>
	<li>Kopieren und einfügen Sie Daten in Excel, um die durchschnittliche Änderung der Adeninabsorption für jede Spannung zu berechnen und so die effektive ▪OH-Ausbeute zu bestimmen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6, wenn mehrere Probenbedingungen (unterschiedliche Puffer/Additive) verwendet werden, um die effektive ▪OH-Ausbeute für jede Bedingung zu normalisieren.</li>
</ol>5. Modifikation des Proteins, um Veränderungen in der Struktur höherer Ordnung zu erkennen.
<ol><li>Mischen Sie 4 mM Adenin mit 20 μM Protein in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis, um eine Lösung mit 2 mM Adenin und 10 μM Protein herzustellen.</li>
	<li>Machen Sie die Abschrecklösung mit 0,3 mg / ml Katalase, um überschüssiges Wasserstoffperoxid abzubauen, und 35 mM Methioninamid, um verbleibende Reste abzuschrecken. Aliquot 25 μL Abschrecklösung in eine 200 μL Mikroröhrchen, so dass ein gleiches Volumen an Abschreckung und das markierte Produkt gemischt wird.</li>
	<li>H2O2auf200 mM verdünnen und auf Eis halten.</li>
	<li>Starten Sie auf der Registerkarte "Steuerungssoftware" die Blitzspannung bei 0 V, um eine Hintergrundoxidation zu bestimmen.</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Manuelle Steuerung die Option Startdaten + AutoZero, gefolgt von Prozess (Aus),dann Bereit, und drehen Sie schließlich das Einspritzventil auf die Lastposition herunter.</li>
	<li>Legen Sie eine Abschrecklösung in Position 1 auf das Produktsammelkarussell. Ändern Sie in der Systemsteuerungssoftware die Produktfläschchen in 1.</li>
	<li>Unmittelbar vor der Injektion werden 12,5 μL der Adenin- und Proteinmischung mit 12,5 μLH2O2gemischt, um eine Endkonzentration von 1 mM Adenin, 5 μM Protein und 100 mMH2O2zu erzielen. Zum Mischen vorsichtig auf und ab pipetten, schnell herunterdrehen und innerhalb von 10 Sekunden nach dem Mischen 25 μL mit dem Injektionsanschluss injizieren.</li>
	<li>Schalten Sie das Einspritzventil in die Injektionsposition und warten Sie, während die Probe verarbeitet wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Erfassung mit 500 V, 750 V, 1000 V und 1250 V. Führen Sie jede Spannungsmessung in dreifacher Ausführung durch.</li>
	<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption wie in Schritt 4.5 beschrieben. Kopieren Sie alle Daten und fügen Sie sie in Excel ein.</li>
</ol>6. Fahren Sie das System herunter
<ol><li>Nachdem alle Proben entnommen wurden, spülen Sie den Spritzenanschluss und die Probenschleife aus, indem Sie das Injektionsventil auf die Lastposition herunterstellen und fünfmal 25 μL HPLC-Wasser einspritzen.</li>
	<li>Drehen Sie das Einspritzventil in die Einspritzposition, um den Rest des Systems mit HPLC-Wasser zu spülen.</li>
	<li>Stoppen Sie den Durchfluss, schließen Sie die Systemsteuerungssoftware und schalten Sie die Module aus, beginnend mit dem Produktkollektor, dem Dosimetermodul, dem Photolysemodul und schließlich dem Fluidikmodul.</li>
</ol>7. Probenvorbereitung und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie
<ol><li>Denaturieren Sie das Protein, indem Sie Proben bei 80 °C für 20 min in Gegenwart von 50 mM Tris und 1 mM CaCl2inkubieren. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab und fügen Sie 1:20 Trypsin zu Protein hinzu. Verdauen Sie das Protein über Nacht bei 37 °C mit Probenmischung. Am nächsten Morgen beenden Sie den Trypsinaufschluss, indem Sie die Proben 10 Minuten lang auf 95 °C erhitzen.</li>
	<li>Detektieren Sie Peptide mit einem hochauflösenden LC-MS/MS-System, das mit einem UPLC-System verbunden ist.</li>
	<li>Die Probe zuerst auf die Fallensäule laden (300 μm ID X 5 mm 100 Å Porengröße, 5 μm Partikelgröße) und bei 5,0 μL/ml für 3 min mit Wasser gewaschen, das 2% Lösungsmittel B (Acetonitril und 0,1% Ameisensäure) enthält.</li>
	<li>Trennen Sie die Peptide auf einer C18-Nanokolumne (0,75 mm x 150 mm, 2 μm Partikelgröße, 100 Å Porengröße) bei einer Durchflussrate von 300 nL/min mit einem Gradienten zwischen Lösungsmittel A (Wasser mit 0,1% Ameisensäure) und Lösungsmittel B. Der Gradient für die Pepteidelution besteht aus einem linearen Anstieg von 2 auf 35% B über 22 min, der über 5 min auf 95% B hochgefahren und für 3 min gehalten wird, um die Säule zu waschen, und dann über 3 min auf 2% B zurückgeführt und für 9 min gehalten wird, um die Säule wieder auszugleichen.</li>
	<li>Erfassen Sie die Daten im positiven Ionenmodus. Stellen Sie die Sprühspannung auf 2400 V und die Temperatur des Ionenübertragungsrohrs auf 300 °C ein.</li>
	<li>Erfassen Sie die vollständigen MS-Scans von 250-2000 m / z, gefolgt von acht nachfolgenden datenabhängigen MS / MS-Scans auf den acht häufigsten Peptidionen. Verwenden Sie kollisionsinduzierte Dissoziation bei 35% normalisierter Energie, um die Peptide zu fragmentieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie alle unveränderten Peptide, die aus der MS/MS-Analyse mit einer verfügbaren Proteinanalysesoftware nachgewiesen wurden, anhand der erforderlichen FASTA-Datei, die die Proteinsequenz und das relevante proteolytische Enzym enthält.</li>
	<li>Suchen und quantifizieren Sie modifizierte Peptide mit einer HRPF-Datenverarbeitungssoftware. Das Ausmaß der Oxidation für jedes identifizierte Peptid wird berechnet, indem die summierte chromatographische Peakfläche eines modifizierten Peptids durch die gesamte chromatographische Peakfläche dieses Peptids dividiert wird, die mit Gleichung 3 modifiziert und unverändert wurde. P = [I(einzeln oxidiert) X 1 + I (doppelt oxidiert) X 2 + I(dreifach oxidiert) X 3 + .../[Iunoxidiert + I(einzeln oxidiert) + I(doppelt oxidiert) + I(dreifach oxidiert) ...] wobei P die durchschnittliche Anzahl von Oxidationsereignissen pro Peptidmolekül bezeichnet und I die Spitzenfläche des unoxidierten Peptids (Iunoxidiert) und des Peptids mit n Oxidationsereignissen darstellt.</li>
</ol>8. Für eine Differenzstudie wiederholen Sie die Schritte 5-7 unter der zweiten Bedingung.
HINWEIS: Um die Reproduzierbarkeit zu bestätigen, werden zwei biologische Replikate zusätzlich zu technischen Triplikaten für jede Bedingung empfohlen.

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E.E.C., J.S.S. und S.R.W. legen eine bedeutende finanzielle Beteiligung an GenNext Technologies, Inc. bekannt, einem Unternehmen in der Frühphase, das Technologien für die Proteinstrukturanalyse höherer Ordnung kommerzialisieren möchte. Die zur Verfügung gestellten repräsentativen Daten wurden von S.K.M. überprüft, die keinen finanziellen Interessenkonflikt hat.

Es gibt mehrere kritische Schritte, um die korrekte Markierung von Proteinen während eines HRPF-Experiments sicherzustellen. Zunächst werden eine geeignete Durchflussrate und eine geeignete Quellblitzrate ausgewählt, um sicherzustellen, dass jeder Bolus der Probe einmal bestrahlt wird. Dies stellt sicher, dass das Protein einem einzigen Bolus neu gebildeter ▪OH ausgesetzt wird. Sobald ein Protein oxidiert ist, kann die Proteinstruktur höherer Ordnung verändert werden. Um sicher zu sein, dass die native Protein...

Proteinkonformation und die damit verbundene Struktur höherer Ordnung (HOS) sind die Hauptdeterminanten der richtigen biologischen Funktion und des abweichenden Verhaltens1. Gleiches gilt für Biopharmazeutika, deren Struktur und funktionelle Aktivität von verschiedenen Aspekten ihrer Produktion und Umgebung abhängt. Biopharmazeutische Veränderungen in HOS wurden mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen (ADR) in Verbindung gebracht, die auf unerwünschte Pharmakologie und immunologisches Ansprechen des Patienten zurückzuführen sind2,3. Das Auftreten von ADRs hat die biopharmazeutische Industrie auf die entscheidende Rolle aufmerksam gemacht, die protein HOS für die Sicherheit und Wirksamkeit von Biotherapeutika spielt, und sie haben den Bedarf an neuen und verbesserten HOS-Analysen festgestellt4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) ist eine vielversprechende Technik, um die Veränderung des Proteins HOS zu verfolgen. HRPF beinhaltet die irreversible Markierung der Außenseite eines Proteins mit ▪OH, gefolgt von einer Massenspektrometrie (MS) -Analyse, um die lösungsmittelzugängliche Oberfläche des Proteins5,6,7zu identifizieren . HRPF wurde erfolgreich eingesetzt, um Defekte im Protein HOS und seine Funktion8,9, charakterisieren die HOS von monoklonalen Antikörpern (mAb)10,11,12,13, bestimmen die Bindung Kd eines Liganden14und vieles mehr15,16,17,18,19. Eine gängige Methode zur Erzeugung der ▪OH für HRPF ist die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (FPOP), bei der hochenergetische, schnelle UV-Laser verwendet werden,um ▪ OH aus der Photolyse vonH2O2herzustellen. In den meisten Fällen verwendet FPOP teure Excimer-Laser mit gefährlichem Gas (KrF), die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern, um Atem- und Augenverletzungen zu vermeiden20. Um Inhalationsgefahren zu vermeiden, haben andere Frequenzvervierfachte Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd: YAG)21verwendet, die den Einsatz von giftigen Gasen eliminieren, aber immer noch teuer sind, erhebliche Betriebskenntnisse erfordern und umfangreiche Streulichtsteuerungen erfordern, um Benutzer vor Augenverletzungen zu schützen.
Obwohl mit HRPF umfangreiche Informationen gewonnen werden können, wurde eine breite Akzeptanz in der Biopharmazie nicht erreicht. Zwei Hindernisse für die begrenzte HRPF-Einführung sind: 1) die Verwendung gefährlicher und teurer Laser, die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern20; und 2) die Unreproduzierbarkeit von HRPF, die durch Hintergrundabfangen von ▪OH verursacht wird, die vergleichende Studieneinschränken 22. Um den Lasereinsatz zu ersetzen, wurde eine Hochgeschwindigkeits-Plasmablitz-Photolyseeinheit mit hoher Energie entwickelt, um FPOP auf einfache Weise sicher durchzuführen. Um die Irreproduzierbarkeit von HRPF-Experimenten zu verbessern, wird eine Echtzeit-Radikaldosimetrie implementiert.
Die Praxis der HRPF wurde durch die Irreproduzierbarkeit eingeschränkt, die auf die Hintergrundabfängerung von ▪OH22zurückzuführen ist. Während ▪OH ausgezeichnete Sonden der Proteintopographie sind, reagieren sie auch mit vielen Bestandteilen, die in Präparaten gefunden werden, so dass es notwendig ist, die effektive Konzentration von Radikalen zu messen, die zur Oxidation eines Zielproteins zur Verfügung stehen. Variationen in der Puffervorbereitung, Wasserstoffperoxidkonzentration, Ligandeneigenschaften oder Photolyse können zu Oxidationsunterschieden zwischen Kontroll- und Experimentellengruppen führen, die in HOS-Differentialstudien zu Mehrdeutigkeiten führen. Die Hinzufügung der Echtzeit-Radikaldosimetrie ermöglicht die Anpassung des Effekts ▪OH-Last und erhöht somit die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit während eines HRPF-Experiments. Die Verwendung der Radikaldosimetrie in FPOP wurde an anderer Stelle23,24,25beschrieben und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung26ausführlich diskutiert. Hier beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen Flash-Photolysesystems und einer Echtzeitdosimetrie zur Markierung von Apo-Myoglobin (aMb) von Pferden und vergleichen die Niveaus der Peptidoxidation in einem FPOP-Experiment mit denen, die bei verwendung eines Excimer-Lasers erhalten wurden.

<table><tbody><tr><td>15 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>jede Marke ist ausreichend</td></tr><tr><td>50 & Mikro; L SGE Gasdichte Spritzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 Nanosäule (0,75 mm X 150 mm, 2 & Mikro; m)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (v/v), LC/MS-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomyoglobin</td><td>Sigma-Aldrich</td> Katalase Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task Wischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>jeder 30%ige Wasserstoffperoxidgehalt ist ausreichend</td></tr><tr><td>Methioninamid</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer</td><td>andere hochauflösende Instrumente (z. B. Q exactive Orbitrap oder Orbitrap Fusion) können verwendet werden</td></tr><tr><td>: Pierce Trypsin-Protease, MS Grade</td><td>Thermo</td><td>Scientific 90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Spaltstein, 1" x 1" x 1/32"</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>jeder Kapillarschlauchschneider ausreichend ist</td></tr>: <tr><td>UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (v/v), LC/MS</td><td>Grade Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, LC/MS</td><td>Grade Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

laserfreies hydroxylradikalprotein-footprinting zur durchführung einer strukturanalyse höherer ordnung von proteinen

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) ist eine aufstrebende und vielversprechende Strukturanalysetechnik höherer Ordnung, die Informationen über Veränderungen der Proteinstruktur, Protein-Protein-Interaktionen oder Protein-Liganden-Interaktionen liefert. HRPF verwendet Hydroxylradikale(▪OH), um die lösungsmittelzugängliche Oberfläche eines Proteins irreversibel zu kennzeichnen. Die inhärente Komplexität, die Kosten und die Gefährlichkeit der HrPF-Durchführung haben die breite Akzeptanz in der Biopharmazie erheblich eingeschränkt. Zu diesen Faktoren gehören: 1) die Verwendung komplizierter, gefährlicher und teurer Laser, die erhebliche Sicherheitsvorkehrungen erfordern; und 2) die Irreproduzierbarkeit von HRPF, die durch Hintergrundabfangen von ▪OH verursacht wird, die vergleichende Studien einschränken. Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll für den Betrieb eines laserfreien HRPF-Systems. Dieses laserfreie HRPF-System nutzt eine hochenergetische Hochdruck-Plasma-Lichtquellen-Blitzoxidationstechnologie mit Inline-Radikaldosimetrie. Die Plasmalichtquelle ist sicherer, einfacher zu bedienen und effizienter bei der Erzeugung von Hydroxylradikalen als laserbasierte HRPF-Systeme, und das Inline-Radikaldosimeter erhöht die Reproduzierbarkeit von Studien. In Kombination adressiert und überwindet das laserfreie HRPF-System die genannten Mängel und Grenzen laserbasierter Techniken.

Die Hochdruck-Plasmaquelle in Verbindung mit Echtzeit-Dosimetrie ermöglicht eine bessere Kontrolle ▪OH-Ausbeute, um Veränderungen in der Proteinstruktur höherer Ordnung genauer zu beobachten. Die Zugabe von Adenin ermöglicht ein effektives Echtzeit-Radikaldosimeter. Bei der Oxidation verliert Adenin die UV-Absorption bei 265 nm (Abbildung 2A). Die Änderung der Adeninabsorption steht in direktem Zusammenhang mit der Konzentration der für HRPF verfügbaren Radikale und bietet somit d...

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Verwendung von Inline-Radikaldosimetrie und einer Plasmalichtquelle vor, um Flash-Oxidationsprotein-Footprinting durchzuführen. Diese Methode ersetzt den gefährlichen UV-Laser, um die Reproduzierbarkeit der schnellen photochemischen Oxidation von Proteinstudien zu vereinfachen und zu verbessern.

Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting zur Durchführung einer Strukturanalyse höherer Ordnung von Proteinen

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting macht die Identifizierung von Proteininteraktionsstellen und Regionen der Bestätigungsveränderung viel einfacher und beschleunigt die Forschung in Proteinaggregations-, Struktur- und Stabilitätsstudien. Mit der Inline-Radikaldosimetrie können Benutzer die effektive Hydroxylradikalbelastung in Echtzeit einstellen, und mit der Echtzeit-Radikaldosimetrie können Sie experimentelle Zeit und wertvolle Proben sparen und gleichzeitig die Reproduzierbarkeit der Markierung verbessern. Um zu beginnen, spalten Sie eine Kieselsäurekapillar mit einem Innendurchmesser von 250 Mikrometern auf 27 Zoll mit einem Kieselsäurespaltenstein und überprüfen Sie die Enden der Kapillare auf einen sauberen und geraden Schnitt.Erstellen Sie zwei Fenster von etwa 15 Millimetern Länge. Vom unteren Ende der Kapillare brennen Sie die Polyimidbeschichtung 90 Millimeter hoch, um das Photolysefenster und 225 Millimeter für das Dosimeterfenster zu erzeugen. Setzen Sie das untere Ende der Kapillare direkt hinter dem konischen Ende einer Mutter und ferrule ein.Fügen Sie die Kapillare zu Port fünf hinzu und ziehen Sie sie mit einem Schraubenschlüssel knapp hinter dem Finger fest. Entfernen Sie die Photolyse-Zellkappe des Photolysemoduls, indem Sie sie gerade herausziehen, und entfernen Sie dann die magnetisch montierte Metallmaske, die die Kapillare an Ort und Stelle hält. Öffnen Sie die Dosimeterzelle, indem Sie auf die Lasche auf der linken Seite drücken und die Dosimeterzelle nach rechts öffnen.Entfernen Sie die magnetisch angebrachten Clips, die die Kapillare an Ort und Stelle halten. Platzieren Sie dann die Kapillare in den gerillten Kanal an der Basis der Photolysezelle und zentrieren Sie das Kapillarfenster mit dem Photolysezellfenster. Halten Sie die Kapillare in Position und fügen Sie die magnetische Maske hinzu.Setzen Sie die Photolysekappe wieder in Position. Legen Sie die Kapillare in den gerillten Kanal an der Basis der Dosimeterzelle und zentrieren Sie das zweite Kapillarfenster auf der kleinen Öffnung in der Mitte der Dosimeterzelle. Während Sie die Kapillare mit einer Hand in Position halten, platzieren Sie die beiden magnetischen Clips in Position, um die Kapillare an Ort und Stelle zu halten.Schließen Sie die Dosimeterzelle, bis sie auf Geschlossen klickt. Führen Sie schließlich die Kapillare durch den gerändelten Knopf auf dem Kapillarlift des Produktkollektors ein und verlängern Sie die Kapillare bis knapp über den Boden der Durchstechflasche. Schneiden Sie die gewünschte Länge des Teflonschlauchs mit einem Cutter und überprüfen Sie die Enden auf einen sauberen geraden Schnitt.Führen Sie ein Ende der neuen Injektionsschlaufe durch eine der Muttern ein und legen Sie eine neue Ferrule auf das Ende des Rohrs. Halten Sie die Mutter und die Ferrule an Ort und Stelle, während Sie das Rohr in Anschluss sechs des Einspritzventils einführen, bis es aus ist. Ziehen Sie die Mutter mit einem Schraubenschlüssel fest und vergewissern Sie sich dann, dass die Mutter und die Ferrule sicher an Ort und Stelle sind.Sobald beide Enden eine Mutter und eine feste Ferrule haben, schrauben Sie locker ein Ende an Port drei und das andere Ende an Port sechs. Sobald Sie in Position sind, ziehen Sie beide Seiten fest, um den Finger fest zu machen, dann drehen Sie sich ein Viertel mit einem Schraubenschlüssel an den Fingern vorbei. Schalten Sie das laserfreie HRPF-System ein, indem Sie das Fluidikmodul starten, gefolgt von dem Photolysemodul, dem Dosimetermodul, dem Produktkollektor und dem Systemcomputer.Starten Sie die Systemsoftware. Tauchen Sie den Schlauch vollständig in 10 Milliliter Puffer von der Ventilposition der Spritzenpumpe ein. Leiten Sie den Schlauch von der Abfallposition und den Schlauch von Port zwei auf dem Spritzenhafen in einen leeren Behälter, um Abfälle zu sammeln.Legen Sie 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen an die Position HN6 auf dem Produktkollektorkarussell. Spülen Sie die Injektionsschleife fünfmal aus, indem Sie 25 Mikroliter HPLC-Wasser mit dem Ventil in die Lastposition einspritzen. Drehen Sie das Einspritzventil manuell, um den Rest des Systems zu spülen.Wählen Sie in der Steuerungssoftware Prozess aus, um mit dem Fließen von Wasser zu beginnen, bis sich ein Tropfen bildet. Stellen Sie eine Lösung mit zwei millimolaren Adeninen und 10 mikromollen Proteinen vor. Dann machen Sie eine Abschrecklösung mit 0,3 Milligramm pro Milliliter Katalase und 35 Millimolarmethianinamid.Aliquot 25 Mikroliter Abschrecklösung in eine 200 Mikroliter Mikroröhre. Verdünnen Sie Wasserstoffperoxid auf 200 Millimolar und halten Sie es auf Eis. Starten Sie die Blitzspannung bei null Volt an der Steuerungssoftware.Diese Null-Volt-Kontrolle bestimmt jede Hintergrundoxidation auf dem interessierenden Protein. Wählen Sie AutoZero starten, gefolgt von Verarbeiten und dann Bereit. Drehen Sie abschließend das Einspritzventil in die Lastposition.Platzieren Sie die Abschrecklösung in Position eins auf dem Produktkollektorkarussell und wechseln Sie dann die Produktfläschchen in eine auf der Systemsteuerungssoftware. Unmittelbar vor der Injektion 12,5 Mikroliter der Adenin- und Proteinmischung mit 12,5 Mikrolitern Wasserstoffperoxid mischen. Pipetten Sie die Mischung auf und ab, um sie zu mischen, und drehen Sie sie dann schnell herunter.25 Mikroliter dieser Lösung mit dem Injektionsanschluss innerhalb von 10 Sekunden nach dem Mischen injizieren. Schalten Sie das Einspritzventil in die Injektionsposition und warten Sie, während die Probe verarbeitet wird. Drehen Sie die Blitzspannung an der Steuerungssoftware auf 750 Volt und wiederholen Sie die Beschriftungsschritte.Notieren Sie dann die Absorption jeder Probe. Klicken Sie zunächst auf Auswählen, und wählen Sie dann manuell den Anfang und das Ende der Spitzenabsorption aus. Geben Sie im verfügbaren Bereich eine Beschreibung des Beispiels ein.Wiederholen Sie dies für alle erfassten Daten. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, um die durchschnittliche Änderung der Adeninabsorption für jede Spannung zu berechnen. Nachdem alle Proben entnommen wurden, spülen Sie den Spritzenanschluss und die Probenschleife aus, indem Sie das Injektionsventil auf die Lastposition herunterstellen und fünfmal 25 Mikroliter HPLC-Wasser injizieren.Drehen Sie das Einspritzventil in die Einspritzposition, um den Rest des Systems mit HPLC-Wasser zu spülen. Stoppen Sie nach dem Spülen den Durchfluss, verlassen Sie die Systemsteuerungssoftware und schalten Sie die Module aus, beginnend mit dem Produktkollektor, dem Dosimetermodul, dem Photolysemodul und schließlich dem Fluidikmodul. Nach der Oxidation nimmt das für die Dosimetrie verwendete Adenin die UV-Absorption um 265 Nanometer ab.Puffer 2 enthält einen Radikalfänger, der die Änderung der Adeninaufnahme im Vergleich zu Puffer 1 verringert. Apomyoglobin wurde in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Adenin bei vier steigenden Plasmalampenspannungen modifiziert. Sechs Peptide wurden nachgewiesen, mit einem linearen Anstieg der Oxidation in Bezug auf die Änderung der Adeninabsorption bei 265 Nanometern.Diese sechs oxidierten Peptide sind auf einer Kristallstruktur von Myoglobin markiert. Das Ausmaß der Oxidation, das von der Hochdruck-Plasmalampe detektiert wird, ist viel höher als bei der laserbasierten Methode. Dieser Anstieg ergibt sich aus dem breiten UV-Emissionsspektrum der Hochdruck-Plasmalampe.Durch die Erzeugung eines breiten UV-Spektrums überlappt die Hochdruck-Plasmalampe die Absorptionsdomäne von Wasserstoffperoxid besser, was zu einer effizienteren Produktion von Hydroxylradikalen durch die Photolyse von Wasserstoffperoxid im Vergleich zum Kr F Excimer Laser und Nd YAG Laser führt. Die Hochdruck-Plasmalampe erhöht die Produktion von Hydroxylradikalen signifikant über das hinaus, was typischerweise mit einem Kr F Excimer Laser beobachtet wird. Die Verwendung von 100-Millimolarperoxid kann zu einer hohen Hintergrundoxidation führen.Wenn das Proteinsystem anfällig für peroxidinduzierte Oxidation ist, verringern Sie die Konzentration auf bis zu 10 Millimolar. Das irreversible Label von HRPF ermöglicht die nachgelagerte Probenhandhabung, einschließlich langer Proteaseaufschlüsse, Sie können Tandem-Massen-Tags für Multiplexing hinzufügen und 2D-Chromatographie durchführen, um die Peptiderkennung und die Konkoordinatenstrukturinformationen zu verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Mg (II)-abhängige Bildung von RNA Tertiärstruktur durch zwei Methoden der Hydroxyl-Radikal footprinting quantifizieren.

Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von &quot;peroxidativer&quot; und &quot;Oxidativer &#39;Hydroxylradikal Footprinting

Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Protein-Konformation und Dynamik sind der Schlüssel zum Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Wasserstoffaustausch gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie ist eine vielseitige Methode, um die Konformationsänderungen Dynamik von Proteinen als auch studieren Charakterisierung von Protein-Ligand und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Kontaktschnittstellen und allosterische Effekte.

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

In vivo schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IV-FPOP) ist eine Hydroxyl-Radikal-Protein-Footprinting-Technik, die die Kartierung der Proteinstruktur in ihrer heimischen Umgebung ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Montage und Einrichtung des mikrofluidischen Strömungssystems IV-FPOP.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Hier charakterisieren wir Proteinstruktur und Interaktionsstellen in lebenden Zellen mit einer Protein-Footprinting-Technik, die als zellschnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IC-FPOP) bezeichnet wird.

Charakterisierung zellulärer Proteine mit in-zelliger schneller photochemischer Oxidation von Proteinen

Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen ist eine aufkommende Technik zur strukturellen Charakterisierung von Proteinen. Verschiedene Lösungsmittelzusätze und Liganden haben unterschiedliche Hydroxyl-Radikal-Aufräumeigenschaften. Um die Proteinstruktur unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, ist eine Echtzeitkompensation von Hydroxylradikalen, die in der Reaktion erzeugt werden, erforderlich, um die Reaktionsbedingungen zu normalisieren.

Ermöglicht Echtzeitkompensation bei schnellen photochemischen Oxidationen von Proteinen zur Bestimmung von Proteintopographie-Änderungen

Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.

Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Eine neue statische Plattform wird verwendet, um Proteinstruktur- und Interaktionsstellen in der nativen Zellumgebung zu charakterisieren, indem eine Protein-Footprinting-Technik verwendet wird, die als schnelle photochemische Oxidation von Proteinen (IC-FPOP) in der Zelle bezeichnet wird.

Plattform-Inkubator mit beweglicher XY-Stufe: Eine neue Plattform zur Implementierung der in-Cell schnellen photochemischen Oxidation von Proteinen

Erfahren Sie laserfreies Hydroxylradikal-Protein-Footprinting für Strukturanalysen höherer Ordnung. Diese Methode mit Inline-Radikaldosimetrie verbessert Reproduzierbarkeit und spart Zeit sowie Proben.

Laserfreies Hydroxylradikalprotein-Footprinting zur Durchführung einer Strukturanalyse höherer Ordnung von Proteinen

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