Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie
13. April 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.
Das folgende Protokoll zeigt, wie man ein Neutronen-Spin-Echo-Experiment aufbaut, um die Zwischenstreufunktion zu messen und die Dynamik von Proteinen in Lösung zu untersuchen. Der Hauptvorteil der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie ist ihre Fähigkeit, die Neuanordnung von Proteindomänen und Subdomänen auf der Pico-zu-Nanosekunden-Zeitskala zu untersuchen, was der Bereich der Zeitlupe in Proteinen in ihrer fast natürlichen Umgebung und in der überfüllten Proteinlösung ist. Neutron Spin Echo ist auch empfindlich gegenüber der Isotopenkonfiguration, was sehr spezifische und gezielte Studien mit Kontrastabgleich ermöglicht.
Einblicke in die Dynamik der Proteindomäne sind ein wichtiger Teil der biophysikalischen Forschung in der anhaltenden schwierigen Aufgabe, die Domänenbewegungen der Proteine mit ihrer biologischen Funktionalität zu kommunizieren. Das hier vorgestellte Protokoll kann im Allgemeinen auf jede Neutronen-Spin-Echo-Messung angewendet werden, die am SNS-NSE-Spektrometer durchgeführt wird, unabhängig von der Wahl der Proben, wenn man sich im Bereich der Materialien für weiche Materie aufhält. Um das Experiment einzurichten, wählen Sie zunächst die Dicke der Zellprobenladung aus, basierend auf der Konzentration der Proteinprobe, der für die Messung erforderlichen Temperatur und der verfügbaren Lösungsmenge.
Reinigen Sie die Zelle mit phosphatfreiem Geschirrspülmittel, deionisiertem Wasser und 70% Diethanol. Trocknen Sie die Zelle im Konvektionsofen. Laden Sie vier Milliliter Proteinlösung in die Zelle und schließen Sie sie mit Kappen.
Verwenden Sie Wachsfilm oder ein anderes Dichtmittel, um die Probenzellen zu versiegeln. Vier Milliliter Dialysepuffer in einen identischen Behälter wie die Proteinprobe geben und versiegeln. Transportieren Sie die Proben zur Balkenlinie.
Schließen Sie den Verschluss und betreten Sie den Höhlenbereich des Spektrometergehäuses. Montieren Sie die Probenzelle auf dem Aluminium-Probenhalter, indem Sie die Schrauben und die Halteplatten festziehen. Montieren Sie die Graphitprobe und die Aluminiumoxidpulverprobe, die in einem identischen Behälter wie die Proteinprobe geladen sind.
Platzieren Sie den gleichen Halter, indem Sie ihn vorsichtig in die Dose des Temperaturantriebssystems schieben. Schließen Sie den Deckel des Temperaturantriebssystems und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert ein, indem Sie auf den interaktiven Bildschirm des Temperaturantriebssystems zugreifen. Montieren Sie die Neutronenkamera für die Ausrichtung der Proben am Strahl.
Um die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie-Daten zu sammeln, richten Sie die Probe im Neutronenstrahl mit der Neutronenkamera und den vier unabhängigen Probenöffnungen aus. Öffnen Sie die Spallations-Neutronenquelle, die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie-Datenerfassungssoftware, und sammeln Sie Probenstatistiken, indem Sie Bruchscans für die gewünschten Streuwinkel und Wellenlängen durchführen. Richten Sie die Messparameter basierend auf den für jede Probe gesammelten Statistiken ein, indem Sie die vom Assisting Instrument Scientist bereitgestellten Messmakros bearbeiten.
Starten Sie den Scan, indem Sie den Protokollnamen an der Eingabeaufforderung eingeben und Echos für das Beispiel erfassen. Melden Sie sich mit den ORNL-Benutzeranmeldeinformationen beim Neutron Sciences Remote Analysis-Cluster an und drücken Sie die Schaltfläche Sitzung starten. Öffnen Sie im Benutzerverzeichnis ein Terminalfenster und geben Sie den Befehl software setup ein.
Geben Sie als Nächstes den Umgebungsbefehl ein. Erstellen Sie einen Ordner für die Datenreduktion im Basisverzeichnis und kopieren Sie die bereitgestellten Skripts und Makros aus dem freigegebenen Verzeichnis. Bearbeiten, umbenennen und speichern Sie das bereitgestellte Reduktionsmakro entsprechend.
Geben Sie drspine" an der Eingabeaufforderung ein und drücken Sie die Eingabetaste, um die Softwarereduktionsumgebung zu starten. Geben Sie den Namen des Reduktionsmakros in die Eingabeaufforderung in der Softwareumgebung ein, und drücken Sie die EINGABETASTE. Bearbeiten Sie das vom Assisting Instrument Scientist bereitgestellte Python-Skript mit den Namen der reduzierten Dateidaten.
Bearbeiten Sie die Funktion so, dass sie aus der bereitgestellten Bibliothek passt. Geben Sie den Namen des bearbeiteten Skripts an der Eingabeaufforderung ein, und drücken Sie die EINGABETASTE, um reduzierte NSE-Daten zu lesen, anzupassen und zu plotten. Die von NSE gemessene Zwischenstreufunktion für IgG- und MBP-Proteine zeigt eine deutliche Abweichung von einem einfachen diffusionsähnlichen Relaxationsprozess auf der kurzen Vier-Jahres-Zeitskala, was auf die Zugänglichkeit der internen Dynamik von Proteinen durch NSE und die Notwendigkeit eines komplexeren Modells zur Beschreibung der beobachteten dynamischen Prozesse hinweist.
Die Ergebnisse von Berechnungen der Zwischenstreufunktionen, die durch atomare Modellierung beider Proteine unter Verwendung von Modellen von entwickelt wurden, stimmten hervorragend mit den experimentellen NSE-Daten überein. Die Ergebnisse zeigten, dass eine langsamere Dynamik, die bei längeren Kürschnerzeiten beobachtet wird, auf die gesamten translationalen und rotationalen Diffusionsprozesse zurückzuführen ist, während die auf den kurzen Zeitskalen beobachtete Dynamik auf die Dynamik von Proteindomänen zurückzuführen ist. Eine wichtige Sache, an die man sich erinnern sollte, ist der Bedarf an gut vorbereiteten und sauberen Proben für NSE-Messungen.
Ein gutes Sample für ein Spin Echo hat ein Flip-Verhältnis von mehr als drei, was dem Verhältnis zwischen kohärenter und inkohärenter Streuung des Samples entspricht. Auch während der Probenvorbereitung und des Ladens der Proben in die NSE-Zellen sollte die Probenlösung sicher und frei von chemischen oder biologischen Kreuzkontaminationen aufbewahrt werden. Aus Sicherheitsgründen sollte der Eintritt in das Spektrometergehäuse erst nach dem Schließen des Verschlusses versucht werden, und es wurde eine zusätzliche halbe Stunde Zeit für die Strahlungskühlung des Gehäuses eingeräumt.
Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung wird empfohlen, um die Form und die Struktur von Proteinen in einer konzentrierten Lösung zu beurteilen. Es kann vor oder parallel zum NSE-Experiment durchgeführt werden. Zusätzliche Methoden wie dynamische Lichtstreuung und Viskositätsmessungen liefern Informationen über die translationale Diffusion und die hydrodynamische Wechselwirkung innerhalb der konzentrierten Proteinlösung und werden ebenfalls empfohlen.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung eines Neutron Spin Echo-Experiments zur Untersuchung der Proteindynamik in Lösung. Es hebt die Fähigkeit der Technik hervor, Proteindomänen-Umlagerungen auf der Zeitskala von Pico- bis Nanosekunden zu beobachten, was für das Verständnis ihrer biologischen Funktionen entscheidend ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biophysik
- Proteindynamik
- Neutron Spin Echo Spektroskopie
Hintergrund
- Proteindynamik ist wesentlich für das Verständnis ihrer Funktionalität.
- Neutron Spin Echo ist empfindlich gegenüber isotopen Konfigurationen.
- Die Technik ermöglicht gezielte Studien mittels Kontrastanpassung.
- Die Untersuchung von Proteinbewegungen in nahezu natürlichen Umgebungen ist kritisch.
Zweck der Studie
- Um die intermediäre Streufunktion von Proteinen zu messen.
- Um die Dynamik von Proteindomänen und Subdomänen zu untersuchen.
- Um Einblicke in die Beziehung zwischen Proteinbewegungen und biologischer Funktionalität zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Einrichtung von Neutron Spin Echo-Experimenten.
- Messung der Proteindynamik in Lösung.
- Auswahl der Probenzellendicke basierend auf der Proteinkonzentration.
- Temperaturkontrolle während der Messungen.
Hauptergebnisse
- Demonstrierte die Fähigkeit, langsame Bewegungen in Proteinen zu beobachten.
- Bot einen Rahmen für die Untersuchung verschiedener weicher Materiematerialien.
- Hevorgehoben die Bedeutung der Probenvorbereitung in Experimenten.
- Zeigte die Effektivität von Neutron Spin Echo in der biophysikalischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Neutron Spin Echo ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Proteindynamik.
- Das Protokoll kann für verschiedene Proteinproben angepasst werden.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können das Verständnis der Proteinfunktionalität verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Neutron Spin Echo Spectroscopy enables biopharma R&D to probe protein domain dynamics on pico to nanosecond timescales in near-native solution conditions, addressing a critical gap between static crystal structures and functional protein behavior. This capability supports target validation by revealing mechanistic insights into protein flexibility and conformational changes that underlie biological activity, informing early-stage hypothesis testing and de-risking. The method provides quantitative, reproducible data on internal protein motions, enhancing predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by characterizing protein domain rearrangements linked to functional mechanisms.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of subdomain dynamics in solution.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic basis of protein activity and reducing ambiguity in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by defining dynamic baselines of protein behavior.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility through quantitative intermediate scattering function measurements.
- Screening Readiness: Delivers scalable, platform-compatible outputs for reliable compound screening in crowded solution environments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase dynamics to preclinical validation via disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by isolating internal protein dynamics from overall diffusion processes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by establishing structure-dynamics-function relationships in near-physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing dynamic phenotypic readouts that complement structural and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein domain motions on functionally relevant timescales.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, quantitative outputs enabling cross-condition comparison.
- Analytics: Yields intermediate scattering function and fitted model parameters that quantify internal vs. diffusive motions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by characterizing dynamics in crowded protein solutions mimicking cellular environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for dynamic phenotyping across multiple protein targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein function.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of dynamic measurements across protein systems.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early mechanistic insight.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on dynamic phenotypic profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysics, neutron scattering, and protein sample handling.
- Depends on access to Neutron Spin Echo spectrometers and supporting infrastructure for data reduction.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, sealing, and contamination control protocols.
- Involves adaptation considerations for varying protein concentrations, buffer conditions, and temperature ranges.
- Includes practical limitations such as need for high flip ratio (>3), radiation safety protocols, and complementary techniques like SANS for structural context.
