Eine antegrade Perfusionsmethode zur Kardiomyozytenisolation von Mäusen
19. Mai 2021
Wir entwickelten eine einfacheMethode zur Isolierung hochwertiger einzelner Mausherzzellen durch die antegrade Perfusionstechnik. Diese Methode ist Langendorff-frei und nützlich zur Isolierung von ventrikulären und vorhofialen Myozyten oder interstitiellen Zellen, wie Herzfibroblasten oder Vorläuferzellen.
Wir haben eine einfache Langendorff-freie Methode entwickelt, um einzelne Mausherzzellen durch eine antegrade Verpackungstechnik zu isolieren. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Herzzellen von juvenilen zu älteren Mäusen. Die retrograde Perfusion auf Langendorff-Basis gilt als Goldstandard für die Isolierung von Herzmyozyten bei verschiedenen Versuchstieren.
Die Kannulation des LTA ist bei Mäusen aufgrund ihrer geringen Größe jedoch technisch schwierig. Für die Mausherzernte öffnen Sie nach bestätigung der Euthanasie und Rasur des Bauches die Brusthöhle schnell, um das Herz freizulegen, und verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, wobei die Spitze auf ungefähr die Größe des Herzens zugeschnitten ist, um das Herz in die Pipette zu saugen. Heben Sie die Pipette an, um genügend Platz zum Einsetzen einer gekrümmten Schere zu schaffen, und verwenden Sie die Schere, um das Herz von der Rückenseite zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Vorhöfe nicht zu beschädigen.
Legen Sie das Herz sofort für etwa eine Minute in ein 30-Milliliter-Glasbecherglas, das eiskaltes CIB-EGTA enthält. Wenn die Kontraktionen aufgehört haben, legen Sie das Herz in eine 35-Milliliter-Kulturschale mit eiskaltem CIB-EGTA und entfernen Sie die Lunge und anderes sichtbares Gewebe. Legen Sie das grob gereinigte Herz auf einen Herzständer, der mit gekühlter CIB-EGTA-Spitze gefüllt ist, mit der Seite nach unten und stellen Sie den Ständer unter ein stereoskopisches Mikroskop.
Entfernen Sie das Fett und das Bindegewebe um die Aorta herum. Wenn die Länge der geschnittenen Aorta zu lang ist, schneiden Sie die Aorta direkt unter der Brachiocephalusarterie ab und richten Sie das Herz so aus, dass die vordere Oberfläche nach vorne zeigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Ende der Aorta anzuheben, und verwenden Sie eine kleine Gefäßklemme, um die Aorta in der Nähe der Vorhöfe zu klemmen, während Sie sanft auf die Vorhöfe drücken.
Dann legen Sie das eingeklemmte Herz auf eine Perfusionsplatte mit der vorderen Seite nach oben und hydratisieren Sie das Herz mit ein paar Tropfen CIB-EGTA. Für eine antegrade Perfusion laden Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit vorgewärmtem CIB-EGTA, die mit einem flexiblen Verlängerungsrohr und einer markierten Injektionsnadel verbunden ist, auf die Infusionspumpe und starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Minute. Wenn die Nadel und die Pumpe gefüllt sind, legen Sie die Injektionsnadel auf die Perfusionsplatte mit der kürzeren Seite der diagonalen Form nach vorne und schieben Sie die Nadel, bis sie nur noch die Spitze des Herzens berührt.
Führen Sie die Nadel vorsichtig in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels in die Kammer ein, ohne die Nadel von der Platte zu verdrehen oder zu lösen, und beobachten Sie die Markierung, um die Tiefe des Nadeleinführungs zu schätzen. Wenn die Nadeleinführung abgeschlossen ist, sollte Blut aus der Koronararterie fließen. Verwenden Sie Klebeband, um die Injektionsnadel an der Platte zu befestigen und die Pumpendrehzahl auf einen Milliliter pro Minute zu erhöhen.
Wenn das Herz erfolgreich durchblutet wird, sollte der Fluss des Puffers in der Kapillare direkt unter dem Epikard sichtbar sein. Nach zwei bis drei Millilitern CIB-EGTA-Perfusion ersetzen Sie den Perfusionspuffer durch eine Enzymmischung. Nachdem ein bis zwei Milliliter durchblutet wurden, erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 1,5 Milliliter pro Minute.
Verwenden Sie eine Pipette, um das angesammelte bluthaltige Perfusat, das aus dem Herzen fließt, bei Bedarf zu entfernen und die Perfusion zu stoppen, wenn das Gesamtvolumen des perfundierten Enzyms 10 Milliliter erreicht. Am Ende der Perfusion 10 Milliliter Enzymmischung von der Spritze in eine 60-Millimeter-Kulturschale auf einer Heizmatte übertragen und 20 Milligramm BSA in die Schüssel geben. Schwenken Sie die Schüssel vorsichtig, um das Pulver aufzulösen und entfernen Sie die Injektionsnadel und die Klemme vom Herzen.
Entfernen Sie die Ventrikel und Vorhöfe aus dem Herzen und legen Sie das Gewebe in die BSA-ergänzte Enzymmischung. Um die ventrikulären Myozyten zu isolieren, verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um das Epikard zu greifen und ziehen Sie die Ventrikel vorsichtig in kleine Stücke. Wenn alle Ventrikelfragmente erzeugt wurden, dispergieren Sie die Zellen etwa 30 Mal mit sanftem Pipettieren und filtern Sie die unverdauten Trümmer durch ein 100 Mikrometer-Netzzellsieb in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Nach der Zentrifugation das Kardiomyozytenpellet in vorgewärmter CIB, ergänzt mit Kalzium und BSA, wieder aufsetzen und die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren die gefällten Kardiomyozyten in einem geeigneten Volumen zellresuspensionslösung für ihre Erhaltung bei 37 Grad Celsius bis zur nachgeschalteten Analyse. Um die Vorhoffyrozyten zu isolieren, übertragen Sie die Vorhöfe in einen Behälter mit vorgewarmter CIB, der mit Kalzium und BSA ergänzt wird, und zerreißen Sie die Vorhöfe in Stücke, wie gezeigt.
Verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, die auf 10 Mikroliter eingestellt ist, um das Gewebe durch Pipettieren zu stören und die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Dann resuspendieren Sie die Vorhoffnungszelle in einem geeigneten Volumen der Zellresuspensionslösung. In diesem Bild können frisch isolierte ventrikuläre Myozyten beobachtet werden.
Dieses Isolationsverfahren führt zu einer Ausbeute von 70 bis 80% stäbchenförmiger ruheventrikulärer Myozyten von acht bis 10 Wochen alten Mäusen innerhalb von etwa fünf Stunden nach der Isolierung. Das Verhältnis von frisch isolierten lebensfähigen Zellen ist bei Mäusen, die älter als zwei Jahre sind, niedriger. Die in den ventrikulären und vorhoflichen Myozyten aufgezeichneten Aktionspotentiale ähneln denen, die in Zellen gemessen wurden, die mit der Langendorff-basierten Methode gewonnen wurden.
Die immunanreichernde Analyse kann verwendet werden, um die Organisation der sarkomerischen Struktur der ventrikulären Myozyten und die Umwandlung der kardialen Fibroblasten in Myofibroblasten nach Subkultur zu beurteilen. Die Western-Blot-Analyse wird empfohlen, um die spezifische Expression von Proteinen von Interesse in den Vorhöfen und Ventrikeln nach der Verarbeitung zu bestimmen. Nach der Perfusion mit Enzymen können Proteine aus den Vorhöfen und Ventrikeln leicht im Lysepuffer mit leichter Kraft zur Proteinextraktion homogenisiert werden.
Es ist wichtig, die Richtung und die Tiefe des Nadeleinführungs zu kontrollieren. Achten Sie beim Einführen der Nadel in den linken Ventrikel darauf, das Ventrikelseptum nicht zu durchbohren oder in die Klappe einzudringen. Sie können die Zusammensetzung des Perfusats je nach Zweck des Experiments ändern.
Zum Beispiel kann ein EGTA-ergänztes Reinigungsmittel verwendet werden, um ein zellfreies Gerüst des Herzens herzustellen.
Übersicht
Diese Studie beschäftigt sich mit der Herausforderung, einzelne Herzzellen von Mäusen zu isolieren, was für die kardiale Forschung von entscheidender Bedeutung ist. Die Autoren entwickelten eine Langendorff-freie Methode unter Verwendung einer antegraden Perfusion, um Zellen effizient aus Mäusen verschiedenen Alters zu isolieren und verbesserten dadurch den Zugang zu spezifischen kardialen Zelltypen erheblich.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Herzzell-Isolierung
- Maus-Herzbiologie
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Die traditionellen Langendorff-Methoden stoßen bei Mäusen aufgrund ihrer Größe auf technische Schwierigkeiten.
- Die Zellisolation ist entscheidend für das Verständnis der Herzfunktion und -pathologie.
- Die Entwicklung zugänglicher Methoden profitiert ein breites Spektrum kardiologischer Untersuchungen.
Verwendete Methoden
- Antegrade Perfusions-Technik
- Maus-Modellsystem
- Verwendung spezifischer Puffer und Enzyme zur Zell-Dissociation
Hauptergebnisse
- Effiziente Isolierung von ventrikulären und atrialen Kardiomyozyten mit hoher Zellviabilität (70–80 % Ausbeute).
- Zellaktionspotentiale, die denen aus Langendorff-Methoden entsprechen.
- Detaillierte Verfahrensschritte für eine optimale Zellgewinnung.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine vereinfachte, effektive Methode zur Isolierung von Herzzellen aus Mäuseherzen vor.
- Der Ansatz ist von Bedeutung für die Weiterentwicklung von Methoden in der Herzforschung.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die effiziente Isolierung lebensfähiger Kardiomyozyten aus Mausherzen ist eine entscheidende Voraussetzung für frühe Entdeckungen und mechanistische Untersuchungen in der kardiovaskulären Arzneimittelforschung. Die antegrade Perfusionsmethode beseitigt die technischen Hürden der Langendorff-basierten retrograden Perfusion und ermöglicht so einen breiteren Zugang zu hochwertigen Herzzellen über ein größeres Spektrum an Mausalterstufen hinweg. Diese Fähigkeit unterstützt robuste Target-Validierungen und funktionelle Assays und wirkt sich damit direkt auf das Vorhersagevertrauen in kardiovaskulären Forschungs- und Entwicklungs-Pipelines aus.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung kardialspezifischer Hypothesen unter Verwendung frisch isolierter ventrikulärer und atrialer Kardiomyozyten.
- Unterstützt die biologische Entschärfung von Risiken, indem Zellen mit hoher Vitalität für funktionelle und molekulare Assays bereitgestellt werden.
- Erleichtert mechanistische Studien an kardialen Zelltypen und verbessert so die Vorhersagesicherheit bei der Target-Auswahl.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare Isolierung von Kardiomyozyten und Fibroblasten für die Entwicklung nachgeschalteter Assays.
- Liefert quantitative Zellausbeuten, die für elektrophysiologische und Proteinexpressionsanalysen geeignet sind.
- Ermöglicht die Herstellung validierter kardialer Zellsysteme für die Wirkstoffscreening und funktionelle Messungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Isolierung von juvenilem bis altem Mausgewebe und ist somit mit krankheitsrelevanten kardialen Modellen kompatibel.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente Zellqualität und -viabilität.
- Unterstützt translationsmedizinische Biomarker-Studien durch Verträglichkeit mit Immunfärbungen und Western Blot-Analysen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese antegrade Perfusionsmethode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine zuverlässige Quelle primärer Herzzellen für die Hypothesenprüfung, Assay-Entwicklung und die mechanistische Risikominderung bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht eine robuste Nullhypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen unter Verwendung frisch isolierter Kardiomyozyten.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Zellpräparationen zur Assay-Standardisierung und Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Unterstützt quantitative Messungen wie die Aufnahme von Aktionspotentialen und die Profilierung der Proteinausprägung.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Abstimmung mit Krankheitsmodellen und die Validierung von Biomarkern durch hochwertige Zellisolierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft ein skalierbares, standardisiertes Protokoll, das über verschiedene Forschungsteams und Modellsysteme hinweg anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung kardialer Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Arbeitsabläufen zur Isolierung kardialer Zellen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und reduziert biologische Risiken in fortgeschrittenen kardiovaskulären Projektportfolios.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von kardialen Entdeckungsprogrammen.
Durchführungsaspekte
- Benötigt technische Expertise in der mikrochirurgischen Dissektion und Perfusion unter Stereomikroskopie.
- Erfordert Zugang zu Infusionspumpen, Heizmatten und analytischer Infrastruktur für nachgeschaltete Assays.
- Setzt eine standardisierte Durchführung der Perfusion und des Zellhandlings über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Kann an verschiedene Mausalter angepasst werden, jedoch kann die Zellausbeute und -lebensfähigkeit bei älteren Tieren abnehmen.
- Die sorgfältige Kontrolle der Nadeleindringtiefe und der Zusammensetzung des Perfusats ist für die Reproduzierbarkeit unerlässlich.
