Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine
22. September 2020
Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.
Alle Membranproteine sind wichtige Angriffspunkte in der Wirkstoffforschung. Die Produktion von Membranproteinen im größten Maßstab ist nach wie vor ein Engpass bei der Durchführung biochemischer, biophysikalischer und struktureller Membranproteinstudien. Mit dieser Methode können Membranproteine in-vitro effizient synthetisiert und gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit mit einer hohen Erfolgsquote hergestellt werden.
Nach Zugabe der entsprechenden Reagenzien, einschließlich des zellfreien Expressionsplasmids, zur Erzeugung eines Transkriptionsreaktionsgemisches wird der Röhrcheninhalt durch sanfte Umkehrung oder Klopfen gemischt und eine schnelle Drehung in einer Mikrozentrifuge durchgeführt. Nach dem Schleudern inkubieren Sie das Gemisch der Transkriptionsreaktion sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einem Mischen und einem Schleuderschritt. Zur Herstellung des Translationspuffers wird die Stammlösung mit frischem Reinstwasser verdünnt.
Verwenden Sie für die Translation in kleinem Maßstab 100-Mikroliter-Dialysebecher, die mit Reinstwasser gewaschen werden, um das Glycerin von der Dialysemembran zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter Reinstwasser in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie einen Dialysebecher mit kleinem Maßstab in das Röhrchen ein. Geben Sie dann 500 Mikroliter Reinstwasser in die Tasse für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Zur Herstellung von Liposomen wird eine Lipidlösung mit 50 mg Lipiden in einen Verdampfungskolben gegeben. Stellen Sie den Kolben in einen Rotationsverdampfer, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Wenn auf der Oberfläche des Kolbenbodens eine dünne, gleichmäßig verteilte Lipidschicht gebildet wurde, wird der Kolben über Nacht unter Unterdruck in einen Vakuumexsikkator überführt, um das Lösungsmittel vollständig zu entfernen.
Nehmen Sie am nächsten Morgen die Kolben aus dem Exsikkator und überprüfen Sie den dünnen Lipidfilm. Geben Sie einen Milliliter Translationspuffer in den Kolben und drehen Sie den Kolben, um den Puffer über den dünnen Lipidfilm zu verteilen. Nach fünf Minuten wird der Kolben mit Ultraschall beschallt, wobei der Winkel gelegentlich geändert wird, damit die Lösung die gesamte Lipidfilmoberfläche berühren kann.
Die Beschallung wird gestoppt, wenn das Lipid vollständig aus dem Kolben entfernt wird und die Liposomensuspension gleichmäßig wird. Übertragen Sie dann die Liposomensuspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bevor Sie eine In-vitro-Proteintranslation durchführen, lassen Sie ein Röhrchen mit Weizenkeimextrakt aus einer Lagerung bei minus 80 Grad einige Minuten lang bei Raumtemperatur in Wasser schwimmen, um das Material schnell aufzutauen.
Nach dem Auftauen des Extrakts den Tubeninhalt sofort durch leichtes Indrehen mischen. Dann schleudern Sie nach unten und legen Sie das Rohr auf Eis. Fügen Sie den Weizenkeimextrakt, die mRNA und die Liposomen hinzu, um ein Translationsreaktionsgemisch zu erzeugen.
Mischen Sie den Röhrcheninhalt durch sanftes Wenden oder Klopfen und führen Sie eine schnelle Drehung in einer Mikrozentrifuge durch. Um eine In-vitro-Proteintranslation in kleinem Maßstab durchzuführen, entfernen Sie das Wasser aus dem Dialysebecher und dem Röhrchen und geben Sie einen Milliliter Translationspuffer in das Röhrchen und 300 Mikroliter in den Becher. Nehmen Sie 60 Mikroliter Translationsreaktionsgemisch.
Führen Sie die Pipettenspitze in den Translationspuffer im Dialysebecher ein. Dann spritzen Sie die Mischung langsam und sanft ein. Das Reaktionsgemisch mit höherer Dichte sinkt spontan auf den Boden des Bechers und bildet eine Schicht.
Decken Sie den Becher mit einem Deckel ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Um eine großflächige Translation durchzuführen, geben Sie 22 Milliliter Translationspuffer in ein 25-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie einen Zwei-Milliliter-Dialysebecher in das Röhrchen ein. Geben Sie zwei Milliliter Translationspuffer in den Dialysebecher.
Nehmen Sie 500 Mikroliter des Translationsreaktionsgemisches, injizieren Sie das Gemisch langsam und vorsichtig in den Translationspuffer im Becher. Inkubieren Sie die Reaktionen 24 Stunden lang bei 15 Grad Celsius. Am nächsten Tag mischen Sie die Reaktion im Dialysebecher durch Pipettieren gründlich und überführen die rohen Proteoliposomensuspensionen in neue Röhrchen.
Um die Proteoliposomen zu reinigen, sedimentieren Sie das Proteoliposom in den Rohsuspensionen durch Zentrieren. Waschen Sie dann das Proteoliposom, indem Sie dreimal in der entsprechenden Menge eiskalten PBS-Puffers resuspendieren. Nach dem Waschen die Proteoliposomenpellets in einem kleinen Volumen PBS gründlich resuspendieren und das Suspensionsvolumen mit einer Mikropipette messen.
Fügen Sie dann PBS hinzu, um die Lautstärke der Suspension anzupassen. Übertragen Sie jede Suspension in ein neues Mikroröhrchen. Um eine SDS-Seitenanalyse einzurichten, fügen Sie 70 Mikroliter Wasser und 40 Mikroliter dreifach konzentrierten SDS-Seiten-Probenpuffer zu 10 Mikrolitern jeder Proteoliposomensuspension hinzu.
Richten Sie ein SDS-Seitengel mit fünf bis 20 % Gradient in einer Elektrophoresekammer ein. Beladen Sie das Gel mit zwei Mikrolitern des Proteingrößenmarkers, drei, sechs und 12 Mikrolitern jeder Proteoliposomenprobe und 10 Mikrolitern Rinderserumalbuminstandards. Führen Sie nach dem Laden der Proben die Elektrophorese durch und färben Sie das Gel anschließend mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue.
Zum Schluss entfärben Sie das Gel in heißem Wasser unter leichtem Schütteln und scannen das Gelbild. Unter Verwendung dieses Protokolls, wie gezeigt, kann eine Vielzahl von Membranproteinen mit drei oder mehr Transmembranhelices in kurzer Zeit leicht als Proteoliposomen hergestellt werden. Bei diesem Doppelschicht-Dialyseverfahren kann eine kontinuierliche Zufuhr von Substraten und die Entfernung des Nebenprodukts sowohl an der Ober- als auch an der Unterseite des Reaktionsgemisches über einen langen Zeitraum effizient durchgeführt werden, was zu einer hervorragenden Translationseffizienz führt.
Die Doppelschicht-Dialysemethode führt zu einer vier- bis 10-fachen Steigerung der Produktivität im Vergleich zur alleinigen Verwendung der Doppelschicht- oder Dialysemethoden. Die Sammlung der synthetisierten Proteoliposomen durch Zentrifizierung und ihre teilweise Aufreinigung mit einem Waschpuffer verkürzt den Aufreinigungsprozess der Membranproteine erheblich. Dieses zellfreie System ist einfach zu manipulieren und hochgradig skalierbar.
Es kann auch zur Herstellung von Gedächtnisproteinen verwendet werden, die mit anderen Methoden nur schwer zu exprimieren sind. Diese Methode ist äußerst hilfreich für Untersuchungen und Experimente, die Membranproteine wie Antimembranprotein, Antikörperproduktion, SPR, Elisa und AlphaScreen verwenden oder darauf abzielen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente zellfreie Methode zur Herstellung hochwertiger Proteoliposomen unter Verwendung eines zellfreien Weizensystems und Liposomen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse von Membranproteinen und unterstützt die Identifizierung von Arzneimittelzielen sowie die Entwicklung von Antikörpern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Wirkstoffforschung
Hintergrund
- Membranproteine sind entscheidende Zielstrukturen in der Wirkstoffforschung.
- Die großtechnische Herstellung von Membranproteinen stellt eine erhebliche Engstelle dar.
- Diese Methode ermöglicht die In-vitro-Synthese von Membranproteinen.
- Sie erlaubt die effiziente Herstellung gereinigter Proteoliposomen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Synthese von Membranproteinen bereitstellen.
- Die Analyse der Funktionen von Membranproteinen erleichtern.
- Die Entwicklung neuer Wirkstoffziele und Antikörper unterstützen.
Verwendete Methoden
- Ein plasmidfreies Expressionssystem wird hinzugefügt, um ein Transkriptionsreaktionsgemisch herzustellen.
- Das Gemisch wird vorsichtig invertiert oder angeklopft und in einer Mikrozentrifuge kurz aufgezentrifugiert.
- Die Inkubation des Transkriptionsreaktionsgemischs erfolgt bei 37 Grad Celsius über einen Zeitraum von sechs Stunden.
- Ein Translationspuffer wird durch Verdünnung der Stammlösung mit ultrareinem Wasser hergestellt.
Hauptergebnisse
- Die Methode liefert Proteoliposomen in hoher Qualität.
- Sie weist eine hohe Erfolgsrate bei der Synthese von Membranproteinen auf.
- Die funktionelle Analyse von Membranproteinen wird ermöglicht.
- Sie unterstützt die Wirkstoffzielsuche und die Antikörperentwicklung.
Schlussfolgerungen
- Diese zellfreie Methode ist effizient für die Herstellung von Membranproteinen.
- Sie behebt den Engpass bei der Untersuchung von Membranproteinen.
- Das Protokoll kann für verschiedene Anwendungen mit Membranproteinen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die effiziente Herstellung funktioneller Membranproteine stellt weiterhin eine entscheidende Engstelle in den frühen Phasen der Arzneimittelforschung und der Antikörperentwicklung dar. Das bikompartimentale dialytische zellfreie System ermöglicht eine schnelle, skalierbare Synthese hochwertiger Proteoliposomen und unterstützt damit direkt die Zielvalidierung und Screening-Arbeitsabläufe. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagegenauigkeit und beschleunigt die Fortschritte im Portfolio für Arzneimittelziele auf Basis von Membranproteinen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine robuste funktionelle Untersuchung von membranständigen Proteinen als Arzneimittelziele.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem Proteine mit korrekter Konformation und Aktivität hergestellt werden.
- Stärkt das Vorhersagevertrauen bei der Auswahl und Einstufung von Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Proteoliposomen für funktionelle Nachweismethoden und Screening-Plattformen.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays für membranständige Proteine.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung für Hochdurchsatz-Screenings und die Antikörperproduktion.
Translationale und präklinische Forschung
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Therapeutika gegen Membranproteine.
- Ermöglicht die funktionelle Analyse klinisch relevanter Zielstrukturen und passt sich somit translationalen Biomarker-Strategien an.
- Verringert das Risiko einer Ausscheidung in späteren Entwicklungsstadien aufgrund unzureichender Proteinqualität oder Ausbeute.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode zur Herstellung zellfreier Proteoliposomen integriert die Zielvalidierung, Assay-Entwicklung und Leitstrukturforschung für die Arzneimittelsuche an Membranproteinen.
- Entdeckungsbiochemie: Beschleunigt die Hypothesenprüfung und Klärung von Wirkwegen zur Funktion von Membranproteinen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Proteoliposomen-Ergebnisse für eine zuverlässige Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Ermöglicht quantitative SDS-PAGE und funktionelle Assays zum Vergleich von Proteinmenge und -aktivität.
- Translationale Forschung: Schafft eine Brücke von der Validierung in vitro zur Entwicklung präklinischer Modelle für Membranzielstrukturen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare und anpassbare Plattform für vielfältige Membranproteine über verschiedene Forschungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Untersuchung von Membranproteinen.
- Operationaler Wert: Standardisiert und optimiert die Produktion von Membranproteinen mit hoher Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz in frühen Portfoliophasen.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Membranproteinen als Arzneimittelziele.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der zellfreien Expression und im Umgang mit Membranproteinen.
- Benötigt Zugang zu Weizenkeim-Extrakt-Systemen, Werkzeugen zur Liposomenherstellung und analytischer Infrastruktur.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg, um reproduzierbare Qualität und Ausbeute an Proteoliposomen zu gewährleisten.
- Eignet sich für eine Vielzahl von Membranproteinklassen, einschließlich GPCRs und Ionenkanäle.
- Skalierbarkeit und Durchsatz können durch die Verfügbarkeit von Reagenzien und die Kapazität der Aufreinigung begrenzt sein.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
In Vitro Transcription
1:12
Translation Material Preparation
1:54
Liposome Preparation
3:07
In Vitro Translation
5:14
Proteoliposome Purification
5:56
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie Brilliant Blue (CBB) Staining
6:57
Results: Representative Proteoliposome Production by Bilayer-Dialysis
8:01
Conclusion
