Name: Geç Embriyonik Drosophila Gonadın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Öğrenin geç embriyonik Drosophila erkek gonadının canlı görüntülenmesi için diseksiyon protokolünü. Bu yöntem, gonadogenesis sırasında dinamik hücre süreçlerini gözlemlemeyi ve gelişimsel biyoloji araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Lindsey W. Plasschaert ve Justin Sui'ye bu protokolün erken gelişimine yaptıkları önemli katkılar için teşekkür ederiz. Yazarlar, sinek topluluğuna reaktiflerle cömertlikleri için ve özellikle Ruth Lehmann ve Benjamin Lin'e, yayınlanmadan önce no.5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' hattını hediye ettikleri için minnettardır. Bu çalışmada Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden (NIH P40OD018537) elde edilen stoklar kullanılmıştır. Bu çalışma NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 ve R35GM136270 (S.D) ve eğitim hibeleri T32GM007229 (B.W.) ve F32GM125123 (L.A.) tarafından desteklenmiştir.

1. Diseksiyondan bir gün önce hazırlık
<ol><li>Elektrolitik olarak bir tungsten iğnesini24 keskinleştirin, böylece elde edilen çap yaklaşık 0.03 mm olur. Verilen voltajı yaklaşık 14 V'a ayarlayın ve 3,3 M NaOH kullanın. Keskinleştirme 1 veya 2 dakikadan fazla sürmemelidir. DİKKAT: NaOH oldukça aşındırıcıdır ve ciltle temas ettiğinde yanıklara neden olur. Kullanırken eldiven ve gözlük takın ve bir duman başlığının içinde çalışın. NOT: Kullandıktan sonra, NaOH'yi bir polipropilen Falcon tüpünde saklayın.</li>
	<li>Hazırlanan görüntüleme ortamını yapın. 15 mL'lik bir konik tüpte, 4.25 mL Schneider ortamını 750 μL Fetal Sığır Serumu (FBS,% 15 nihai konsantrasyon) ve 27.5 μL Penisilin-Streptomisin (0.05 U / μL Penisilin, 0.05 μg / μL nihai konsantrasyon) ile birleştirin. Hazırlanan bu görüntüleme ortamını 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Heptan-tutkal çözeltisi yapın. Yaklaşık 20 cm çift taraflı bantla doldurulmuş 20 mL sızdırmaz şişeye yaklaşık 0,5 mL heptan ekleyin. Bir nutatörde yaklaşık bir saat boyunca sallayın veya su ve gliserol arasında bir tutarlılık elde edilene kadar bir pipet ucuyla karıştırın. Bu çözünmüş tutkal çözeltisi, heptan buharlaşmadan önce birkaç gün sürecektir. Çözeltiyi tazelemek için, ilave bir 0,5 mL heptan ve kaya ekleyin. NOT: Etkili bir heptan-yapıştırıcı çözeltisi, çeşitli heptan-bant oranları ve ayrıca değişen sallanma / karıştırma süreleri kullanılarak hazırlanabilir. Yukarıdaki spesifikasyonlar sadece böyle bir yeterli çözeltinin hazırlanması veya tazelenmesi için önerilerdir.</li>
</ol>2. Embriyo toplama – diseksiyondan 15-17 saat önce
<ol><li>Bir elma suyu agar tabağı25'e taze maya ezmesi ekleyin. Küçük deliklerle delikli boş bir gıda şişesine yetişkin sinekler (10 günden az) ekleyerek bir embriyo toplama kafesi kurun26. Mayalı agar plakasını kullanarak toplama kafesini kapatın, şişeye bantlayın ve kafesi plaka tarafı aşağı olacak şekilde 25 ° C'lik karanlık bir inkübatöre 1 saat boyunca yerleştirin. NOT: Sinekler, gonadı floresan olarak işaretleyecek bir transgeni ifade etmelidir, örneğin, six4-eGFP::Moesin20, çünkü embriyoların diseksiyonu stereo-floresan mikroskop altında gerçekleşecektir. Gonadı işaretlemek için kullanılan genotiplerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakınız.</li>
	<li>Kafesi inkübatörden çıkarın ve bu ilk koleksiyonu atın. Taze mayalanmış bir agar plakası ile değiştirin ve kafesi 2 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. NOT: İlk embriyo koleksiyonu, döllenmiş, gelişmekte olan embriyoların dişilerini temizlemek, sıkı bir şekilde zamanlanmış ikinci bir embriyo koleksiyonu elde etmek için kullanılır.</li>
	<li>Agar plakasını kafesten çıkarın ve (mayalı tarafı yukarı bakacak şekilde) kapatılabilir plastik bir kabın içindeki nemli bir kağıt havluya yerleştirin. Embriyoları 14.5 saat yaşlandırmak için bu nemli odayı 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin (son yaşlar, yumurtlamadan sonra 14.5-16.5 saat). NOT: Adım 2.4'e başlamadan hemen önce, adım 3.1 ve 3.2'yi tamamlayın.</li>
	<li>Agar plakasını inkübatörden çıkarın ve bir fışkırtma şişesi kullanarak, bir boya fırçasıyla hafifçe fırçalayarak maya macununu çözmek için agar plakasına yeterli su ekleyin. Embriyoları ve çözünmüş mayayı bir tartım teknesinin içinde oturan küçük bir ağ elek sepetinde durulayın. Sepette, çoğu maya macunu ağdan süzülene kadar su fışkırtma şişesiyle durulayın.</li>
	<li>Tartım teknesindeki suyu çıkarın ve sepeti tekrar içine yerleştirin. Embriyoları, bir fışkırtma şişesi kullanarak% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine batırarak dekoryonlayın. Ağartıcı çözeltisi 3-5 mm derinliğe sahip olmalıdır. Embriyoları ara sıra dönerek ~ 2 dakika boyunca çamaşır suyuna batırılmış halde tutun. DİKKAT: Çamaşır suyu aşındırıcıdır ve gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir veya zarar verebilir. Çamaşır suyunu kullanırken eldiven ve gözlük takın. NOT: Bu süre zarfında, adım 3.3'ü mümkün olduğunca tamamlayın. Dekoryonasyon ilerlemesi, sepeti stereo mikroskop altına yerleştirerek ve dorsal uzantıların yokluğunu kontrol ederek kontrol edilebilir. Gerekirse embriyoları ek süre için ağartıcı çözeltisine batırın.</li>
	<li>Ağartıcıyı atın ve sepetin içindeki embriyoları bir fışkırtma şişesinden suyla iyice durulayın (~ 3 s için, ağ sepetini kağıt havlularla lekeleyin; 2-3 kez tekrarlayın).</li>
</ol>3. Diseksiyon hazırlık günü
<ol><li>1.5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne (0.2 mg/mL nihai konsantrasyon) 1.500 μL hazırlanmış görüntüleme ortamına (bkz. adım 1.2) 30 μL insülin (10 mg/mL) ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığına dengelemek için tüpü tezgahın üzerinde bırakın.</li>
	<li>Tutkalla kaplanmış kapak kayma şeritleri hazırlayın.<ol>
<li>22 mm x 22 mm'lik bir kapak kaymasını eşit büyüklükte dört şerit halinde kesmek için elmas uçlu bir bıçak kullanın (Şekil 1A).</li>
		<li>Bir şeridi almak için forseps kullanın ve şeridin her iki tarafına toplam yaklaşık 30 μL heptan-yapıştırıcı çözeltisi yayın (Şekil 1B). Eşit bir tutkal kalıntısı tabakası elde etmek için, heptan buharlaşırken şeridi çeşitli açılarda eğin.</li>
		<li>Tutkal kaplı şeridi bir kapaklı kutunun boş bir yuvasında saklayın; yapışkanlığını korumak için, şeridi eğimli, ancak dik bir konumda, kutu yüzeyleriyle teması en aza indirmek için kutunun kenarlarına yaslanmış olarak yerleştirin (Şekil 1C). Kutuyu kapatın, böylece havadaki partiküller yapıştırıcıyı kaplamaz ve yapışkanlığını azaltır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tezgahın üstüne şu öğeleri yerleştirin: 6 inç cam Pasteur pipet, mikroskop slaytı, uygun pipet uçlarına sahip bir P200 ve bir P1000 pipetçi, Ringer çözeltisi27 (NaOH ile pH 7,3'e ayarlanır) ve açık, Poli-D-Lizin kaplı 35 mm görüntüleme kabı.</li>
	<li>Embriyoları ağ elek sepetinden 500-750 μL heptan ile doldurulmuş küçük bir saat camına aktarın.<ol>
<li>Sepetin kenarlarını ve altını bir mendil mendiliyle kurulayın. Hepattaki bir boya fırçasını nemlendirin, boya fırçasını embriyolara dokunun (hidrofobik vitelin zar kıllara yapışmalıdır) ve boya fırçasını saat camındaki heptana geri daldırın (embriyolar dibe batmalıdır). NOT: Embriyoların kurumasını önlemek için sonraki adımlar mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir. Embriyolar 20 saniyeden fazla havaya maruz bırakılmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoları bir Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytına aktarın (Şekil 1D). Embriyoları yavaşça pipete çekin ve pipetin dar kısmıyla sınırlayın. Pipet embriyoları yavaşça slaytın üzerine dökülür, böylece kızağa akmadan önce pipetin ucunun hemen içinde toplanırlar. Bir mendil mendilinin köşesini ince bir uca çevirin ve heptanı slayttaki embriyolardan uzaklaştırın. Daha küçük bir alanı toplayacak ve kaplayacaklar, böylece bir sonraki adımda tutkal kaplı bir şeritte yakalanmalarını kolaylaştıracaklar.</li>
	<li>Forsepsle, tutkal kaplı bir şerit alın ve embriyolara hafifçe dokunun (Şekil 1E). Şeridi görüntüleme kabına, embriyoyu yana doğru ve Poli-D-Lizin kaplı merkezin hemen dışına yerleştirin. Yerine sabitlendiğinden emin olmak için forseps kullanarak şeridi tabağa bastırın. Çanağı hemen 2–3,5 mL Ringer çözeltisi ile doldurun; kurumasını önlemek için embriyoları önce suya batırın (Şekil 1F).</li>
</ol>4. Diseksiyon
NOT: Bu adımlar stereo-floresan mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>10-15 embriyoyu devitellinize edin. NOT: Bu, yeni başlayanlar için iki embriyodan, uzmanlar için on beş embriyoya kadar değişebilir.<ol>
<li>Bağırsak morfolojisine göre Evre 16 embriyolarını seçin (Şekil 2). Bu aşamada, embriyolar dört yığılmış bağırsak segmenti oluşturan üç bağırsak daralmasına sahiptir (Şekil 2 B, B'). Devitelinizasyona başlamak için, seçilen embriyoyu bir uçta, tercihen ön tarafta, tungsten iğnesi ile delin. Embriyo vitelin zarından dışarı çıkabilir, ancak değilse, zarı embriyodan soyun. NOT: Diseksiyon için çok genç olan embriyolar bölgeselleşmemiş bağırsaklara sahiptir (Şekil 2C). Evre 17 embriyolarının diseksiyonu mümkündür, ancak Aşama 16 embriyolarının diseksiyonundan daha zordur, çünkü kütikül bu aşamada gelişmeye başlamaktadır. Erken Evre 17 embriyoları, birbirlerine göre kaydırılmış dört bağırsak segmenti ile birlikte bulunur (Şekil 2 D, D').</li>
		<li>İğneyi embriyo boyunca gonadlardan uzak bir bölgeye bağlayın. Kancalı embriyoyu çanağın Polilizin kaplı bölgesine aktarın (buradan itibaren basitçe "kapak kayması" olarak adlandırılır) ve yapışana kadar tabana doğru sürükleyin. Bu adımları tekrarlayın ve devitelinize embriyoları Polilizin kaplı kapak kaymasının üst kısmı boyunca üst üste yerleştirin (Şekil 3A), daha fazla diseksiyon için aşağıda bol miktarda alan bırakın. NOT: Gonadlar, kullanılan spesifik işaretleyiciye ve transgen kopya numarasına bağlı olarak parlak bir şekilde flüoresan olması gereken küçük küresel hücre agregaları olarak görünür. Bu aşamada, gonadlar lateral olarak A5 segmentinde, anteriordan embriyo uzunluğunun yaklaşık% 70-80'inde bulunur. Diseksiyon protokolü boyunca, doku iğneye yapışabilir. Enkazın iğnesinden kurtulmak için, Ringer çözeltisinin yüzeyinin hemen üzerine kaldırın. Devitellinizasyon, gonad uygun mümkün olduğunca az bozulduğu sürece düzensiz olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Gonadları embriyodan çıkarıp kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3C,D).<ol>
<li>İlk olarak, embriyoyu içini açığa çıkarmak için törpülayın (Şekil 3C). Embriyoyu merkezinden dilimleyin, iğneyi arkadan, gonadlar arasında hareket ettirin. Bazı iç dokuları kızdırın, çünkü bu yemeğe dış kütikülden çok daha iyi yapışacaktır. Dokunun yapışkanlığı, bir sonraki manipülasyonların gonadı ortaya çıkarmasını ve kapak kaymasına yapışmasını sağlayacaktır. NOT: Doku çanağa yapışmıyorsa, kaplanmış kapak kaymasının kirlenmemiş bir bölgesine koaksiyel hale getirmeyi deneyin; kapak kaymasının dış bölgeleri özellikle yapışkan olacaktır. Adım 4.1.2'de belirtildiği gibi, diseksiyon manipülasyonlarının, gonadlar zarar görmediği sürece, parçalanmış bir embriyo karkası ile sonuçlanması önemli değildir.</li>
		<li>İğneyi, gonad da dahil olmak üzere bir doku parçası kalan karkastan ayrılana kadar bir gonadın etrafında dilimlemek için kullanın. İğne ile, bu dokuyu taze bir kaplanmış örtü kayması bölgesine çekin ve tabağa yapışana kadar tabana doğru koaksiyel hale getirin. NOT: En iyi görüntüleme, gonadın kendisinin üstteki doku yoluyla dolaylı olarak bağlanması yerine, doğrudan kapak kaymasına bağlandığı durumlarda elde edilecektir. Bu nedenle, doku karkastan uzağa yönlendirildikçe, gonadın yabancı doku yerine önce kapak kaymasına dokunmasını sağlayın.</li>
		<li>Yapışkan dokuyu iğne ile gonaddan nazikçe sürükleyerek gonaddan mümkün olduğunca fazla çevre dokusunu çıkarın (Şekil 3D). Gonada doğrudan dokunmaktan kaçının, bu da ona zarar verir (Şekil 4E). Gondanın çanağa yeterince yapışmasını sağlamak için, iğneyi gonadın etrafında yumuşak bir dairesel hareketle hareket ettirin - eğer hareket ederse, iğneyi kalan yapışkan dokuya dokunun ve gonadı taze bir yapışkan örtü kayması bölgesine yönlendirin. Gonadın tespit edilebilir bir hareketi kalmayana kadar bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Embriyo karkasına geri dönün ve ikinci gonadı diseke edin. Bu işlemi mümkün olduğunca çok sayıda embriyo üzerinde tekrarlayın, ancak 25 dakikayı geçmeyin. Doku canlılığı, ~ 40-45 dakikadan fazla bir süre sonra Ringer'ın çözeltisinde tehlikeye girecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yönünü kaydetmek üzere görüntüleme kabının dış kenarına kayıt işaretleri eklemek için silinmez bir işaretleyici kullanın.</li>
	<li>Tutkal kaplı şeridi tabaktan çıkarın.<ol>
<li>Bir çift forsederin alt çatalını şeridin altına yavaşça yerleştirin, yapışmış gonadların bozulmasını en aza indirmek için Zil çözeltisinin mümkün olduğunca az dökülmesiyle çanaktan kurtarmak için şeridi yavaşça yukarı doğru eğin ve yavaşça yukarı doğru eğin. NOT: Şerit, disseke edilmiş gonadlardan uzağa eğilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Çanağı, Ringer çözeltisinin dökülmesini önleyecek şekilde yavaşça görüntüleme mikroskobuna taşıyın.</li>
</ol>5. Görüntüleme
<ol><li>Görüntüleme kabını, tabağı diseksiyon sırasında olduğu gibi yaklaşık yönde yerleştirmek için işaret işaretlerini kullanarak sahne tutucusuna yerleştirin. Parlak alan mikroskobu ve düşük güçlü (~ 10x) bir hedef kullanarak, kapak kaymasına yapışmış herhangi bir doku parçasını tanımlayın ve odaklayın. Floresanı ortaya çıkarmak için göz merceği ayarlarını değiştirin ve dürbün göz merceklerini kullanarak, görüntüleme yazılımı içindeki her bir gonadın konumunu işaretleyerek çanağı sistematik olarak tarayın (bkz. NOT: Konumları işaretlemeden önce gonadların görüş alanında ortalandığından emin olun.</li>
	<li>Tüm sahne tutucu tertibatını, görüntüleme kabı tutucusunda olacak şekilde yavaşça çıkarın ve tertibatı çalışma tezgahına yerleştirin.</li>
	<li>Ringer çözeltisini insülin içeren hazırlanmış görüntüleme ortamıyla değiştirin (bkz. adım 1.2 ve 3.1).<ol>
<li>Tüm Ringer solüsyonunu görüntüleme kabının iç üst çıkıntısından çıkarmak için bir P1000 kullanın (Ringer'ları merkezi kapak kayma bölgesinden pipet yapmayın). Ardından, bir P200'e geçin ve ucunu merkezi bölgede kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirin. 50-100 μL Ringer'ı dikkatlice çıkarın; çözümün tamamını ÇIKARMAYIN.</li>
		<li>~200 μL görüntüleme ortamı hazırlayın ve P200 ucunu kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirerek yavaşça bu görüntüleme ortamını ekleyin. Ardından, kalan görüntüleme ortamını (~ 1.300 μL) üst çıkıntının en dış kenarından başlayarak çanağa ekleyin. Pipetleme sırasında, sıvının orta kubbesine doğru ilerleyin ve sonunda pipet ucunu her ikisinin de üzerinden fırçalayarak ikisini birleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin. NOT: Görüntüleme ortamı, buharlaşmayı önlemek için çanağın tüm iç çapını yaklaşık 2 mm derinlikte kapsamalıdır (Şekil 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskobu daha yüksek bir güç hedefine (63x, 1.2 NA) geçirin, kullanılan hedefe göre uygun daldırma sıvısını uygulayın (hedefin gerektirdiği daldırma sıvısı tipi ve kırılma indisi) ve ardından sahne tutucu tertibatını değiştirin. Görüntüleme kabının dibine yapıştırılmış dokuya odaklanmak için parlak alan mikroskobu kullanın. NOT: Aşama hareket ettirilmemişse, hedef odaklandıktan sonra son gonad görünmelidir.</li>
	<li>İşaretli her gonad pozisyonunda adım adım ilerleyin ve bu pozisyonu gerektiği gibi ayarlayın. Görüntü netliğine, gonad cinsiyetine vb. bağlı olarak hangi gonadların görüntüleneceğini seçin. Görüntüleme ayarlarını özelleştirin (çok kanallı, pozlama süreleri, lazer yoğunlukları, Z serisi artışlar, uygun aralıklarla hızlandırılmış çekim vb.). Görüntülemeye başlayın. NOT: Erkek gonadlar, hem bir nişin hem de gonadın karşı ucunda, erkeğe özgü somatik gonadal öncüller (msSGP'ler) adı verilen küçük, oldukça dairesel somatik hücrelerden oluşan bir kümenin varlığı ile tanımlanabilir. Six4-eGFP::moesin floresan işaretleyici kullanılırsa, niş hücreler gonaddaki en parlak ikinci hücrelerdir, en parlak olanı msSGP'lerdir. Bu aşamada, dişi gonadların ne bir nişi ne de msSGP'leri vardır.</li>
</ol>

<ol><li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li>
<li>Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Cadherin+is+required+for+centrosome+and+spindle+orientation+in+Drosophila+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells.</a> PLoS One. 5, 1-7 (2010).</li>
<li>Lenhart, K. F., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cell+encystment+promotes+abscission+in+germline+stem+cells+following+a+regulated+block+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis.</a> Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).</li>
<li>Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Germinal+Proliferation+Center+in+the+Testis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).</li>
<li>Fuller, M. T. Spermatogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Development of Drosophila Melanogaster</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+group+of+pumilio+mutations+affects+the+asymmetric+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 124, 2463-2476 (1997).</li>
<li>Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piRNA+pathway+is+developmentally+regulated+during+spermatogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila.</a> RNA. 22, 1044-1054 (2016).</li>
<li>Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+to+adult%3A+PiRNA-mediated+silencing+throughout+germline+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).</li>
<li>Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+BMP+receptor+activation+at+adherens+junctions+in+the+Drosophila+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche.</a> Nature Communications. 2, (2011).</li>
<li>Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubes+mediate+niche-stem-cell+signalling+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis.</a> Nature. 523, 329-332 (2015).</li>
<li>Leatherman, J. L., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfh-1+controls+somatic+stem+cell+self-renewal+in+the+Drosophila+testis+and+nonautonomously+influences+germline+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal.</a> Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).</li>
<li>Leatherman, J. L., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+self-renewal+requires+cyst+stem+cells%2C+while+stat+regulates+niche+adhesion+in+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes.</a> Nature Cell Biology. 12, (2010).</li>
<li>Tulina, N., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stem+cell+self-renewal+in+Drosophila+Spermatogenesis+by+JAK-STAT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling.</a> Science. 294, 2546-2549 (2001).</li>
<li>Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spermatogenesis+in+Drosophila+with+P-element+enhancer+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors.</a> Development. 114, 89-98 (1992).</li>
<li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).</li>
<li>Rebecca Sheng, X., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Aboim, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developpement+embryonnaire+et+post-embryonnaire+des+gonades+normales+et+agametiques+de+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Suisse+De+Zoologie%22%5BJournal%5D)">Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster.</a> Revue Suisse De Zoologie. 52, 53(1945).</li>
<li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+actin+regulator+ENABLED+regulates+cell+shape+and+orientation+during+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Devlopmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li>
<li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li>
<li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , (2011).</li>
<li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+Drosophila+CID%2FCENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li>
<li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Gonadogenez sırasında, embriyonik gonad ve özellikle erkek gonad15 içindeki kök hücre nişi hızlı morfolojik değişikliklere uğrar. Bu dinamik değişikliklerin altında yatan gelişimsel mekanizmalar en iyi canlı görüntüleme teknikleriyle anlaşılır. Bununla birlikte, embriyonik Aşama 17'de, gonadın in vivo görüntülenmesi, büyük ölçekli kas kasılmalarının başlamasıyla imkansız hale getirilir17. Bu protokolle başarılı bir alternatif sunuyoruz: ex vivo canlı görün...

Drosophila melanogaster testis, birçok dinamik hücresel süreci anlamamız için bir paradigma olarak hizmet etmiştir. Bu modelin çalışmaları, kök hücre bölünme regülasyonu 1,2,3, germ hücresi gelişimi 4,5, piRNA biyolojisi 6,7,8 ve niş-kök hücre sinyal olayları9,10,11,12,13'e ışık tutmuştur. Bu model avantajlıdır çünkü genetik olarak izlenebilir 14,15'tir ve kök hücreleri doğal ortamlarında yaşayabileceğimiz birkaç yerden biridir 3,16,17,18. Bununla birlikte, bu modelin canlı görüntülemesi yetişkin doku ve erken embriyonik aşamalarla sınırlandırılmıştır, bu da geç embriyodaki gonadal dinamikler hakkındaki bilgimizde bir boşluk bırakarak, nişin ilk oluştuğu ve işlev görmeye başladığı kesin aşamadır.
Geç evre embriyonik gonad, anteriordaki somatik niş hücrelerden ve daha arka bölgeler boyunca somatik gonadal hücreler tarafından ensiklopedik germ hücrelerinden oluşan bir küredir19. Bu organ, erken embriyonik Aşama 17 17,20,21'e kadar in vivo olarak canlı olarak görüntülenebilir. Büyük ölçekli kas kasılmalarının başlaması nedeniyle daha fazla görüntüleme engellenir. Bu kasılmalar o kadar şiddetlidir ki, gonadı görüntüleme çerçevesinin dışına iter ve bu tür hareketler görüntüleme yazılımı ile düzeltilemez. Laboratuvarımız, canlı görüntüleme için bu zor dönemde meydana gelen niş oluşum mekanizmalarını ortaya çıkarmakla ilgilenmektedir. Bu nedenle, embriyonik Aşama 16'dan başlayarak gonadın canlı görüntüsüne ex vivo bir yaklaşım ürettik ve gonad gelişiminin bu önemli döneminde hücre dinamiklerinin incelenmesini kolaylaştırdık. Laboratuvarımızdan önceki çalışmalar, bu ex vivo görüntülemenin in vivo gonad gelişimi17'yi sadık bir şekilde özetlediğini göstermektedir. Bu teknik, Drosophila embriyonik gonadı için türünün ilk ve tek örneğidir.
Burada, geç embriyonik evrelerde gonadın ex vivo canlı görüntülenmesi için gerekli diseksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, farmakolojik tedavilerle veya gonad içindeki spesifik hücre soylarının transgenik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, kök hücre niş oluşumunun adımlarını başarıyla görüntüledik17. Bu görüntüleme yaklaşımı, kök hücre biyolojisi alanı için etkilidir, çünkü niş oluşumunun ilk aşamalarının doğal ortamında gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayacaktır15,17. Bu yöntem kök hücre biyolojisi alanı için faydalı olsa da, hücresel yeniden düzenlemeler 22,hücre yapışması 2,12,23 ve hücre göçü 23 dahil olmak üzere bu gelişimsel zaman noktasında gonadda meydana gelen dinamik süreçleri görselleştirmek için de uygulanabilir. Bu diseksiyon protokolü böylece birçok temel hücre biyolojik süreci hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir.

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar Tungsten tel</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0,25 mm (0,01 inç) çap, %99,95 (metal bazında)</td></tr><tr><td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner, & Heidmann, Güncel Biyoloji, 2007</td></tr><tr><td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td><td>Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'</td></tr><tr><td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano ve diğerleri, PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Elmas uçlu bıçak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme kabı</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı v7.8.4.0</td></tr><tr><td>İnsülin, sığır</td><td>Sigma</td><td>l0516</td><td>Alikotları 4 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>İğne tutucu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex sepet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Ringer çözeltisi</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sükroz, 5mM Hepe ' s Tampon; pH 7.3 elde edilene kadar NaOH ile ayarlanır</td></tr><tr><td>Schneider'in Böcek Ortamı</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

geç embriyonik drosophila gonad'ın diseksiyonu ve canlı görüntülemesi

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Drosophila melanogaster erkek embriyonik gonad, germ hücresi gelişimi, piRNA biyolojisi ve niş oluşumu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere gelişim biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için avantajlı bir modeldir. Burada, in vivo canlı görüntülemenin oldukça etkisiz olduğu bir dönemde gonad ex vivo'yu canlı olarak görüntülemek için bir diseksiyon tekniği sunuyoruz. Bu protokol, embriyoların bir görüntüleme kabına nasıl aktarılacağını, uygun şekilde evrelenmiş erkek embriyoların nasıl seçileceğini ve yapısal bütünlüğünü korurken gonadın çevresindeki dokudan nasıl diseke edileceğini özetlemektedir. Diseksiyonu takiben, gonadlar dinamik hücresel süreçleri görselleştirmek için konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. Diseksiyon prosedürü kesin zamanlama ve el becerisi gerektirir, ancak yaygın hataların nasıl önleneceği ve bu zorlukların nasıl üstesinden gelineceği konusunda fikir veriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla bu, Drosophila embriyonik gonad için ilk diseksiyon protokolüdür ve aksi takdirde erişilemeyen bir zaman penceresinde canlı görüntülemeye izin verecektir. Bu teknik, doğal gonadal ortamlarında hücrelerin içinde veya arasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek için farmakolojik veya hücre tipine özgü transgenik manipülasyonlarla birleştirilebilir.

Görüntüleme kabının hazırlanışını Şekil 1'de, "Diseksiyon günü hazırlığı" nda açıklandığı gibi gösteriyoruz. Bu yöntemler nihayetinde, geçici olarak çanağın dibine sabitlenen ve Ringer'ın çözeltisine batırılmış bir kapak kayma şeridine yapıştırılmış iyi nemlendirilmiş embriyolarla sonuçlanmalıdır (Şekil 1F). Elmas uçlu bir bıçak, 22 x 22 mm'lik bir kapak kaymasını üç ila dört küçük şerit halinde temiz bir şekilde dilimlemeyi sağlar (Şekil 1A...

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Hücre dinamikleri en kolay canlı görüntüleme ile anlaşılır. Bu protokol, daha önce görselleştirme için erişilemeyen gonadogenezin gelişimsel aşamasının canlı olarak görüntülenmesini sağlar. Gonadı izole etmek için gerekli olan ince diseksiyonlar, yüksek büyütme altında hassas ve hassas manipülasyonlar gerektirir.Her adımın nasıl yürütüleceğini yalnızca görsel bir gösteri iletebilir. Bu tekniğe yeni olan biri, belirli adımlarda gerekli olan hızlı zamanlama ve hassas doku manipülasyonları ile mücadele edebilir. Öğrenirken bu protokolün bölümlerini ayrı ayrı uygulamanızı öneririz.Elmas uçlu bir bıçak kullanarak 22'ye 22 milimetrelik bir kapak kızağını eşit boyutta dört şerit halinde keserek başlayın. Forseps kullanarak bir şerit alın ve şeridin her iki tarafına 30 mikrolitre heptan tutkal çözeltisi yayın. Heptan buharlaşırken eşit bir tutkal kalıntısı tabakası elde etmek için şeridi çeşitli açılarda eğin.Şeridi boş bir kapak kayma kutusunda saklayın. Kutuyla teması en aza indirmek ve yapışkanlığını korumak için eğimli ancak dik bir konum ayarlayın. Ardından kutuyu kapatın.Yaşlı dekoryonlu embriyoları 500 ila 750 mikrolitre heptan ile doldurulmuş küçük bir saat camına aktarın. Embriyol

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Biz belirli genotipler Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları üretmek için akıcı bir protokol açıklar. Bu protokol, genetik ekranlardan çeşitli verimli bir şekilde yürütülmesini sağlar. Aynı zamanda geç embriyo yapıları mükemmel görselleştirme sağlar.

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin geç embriyonik Drosophila erkek gonadının canlı görüntülenmesi için diseksiyon protokolünü. Bu yöntem, gonadogenesis sırasında dinamik hücre süreçlerini gözlemlemeyi ve gelişimsel biyoloji araştırmalarını kolaylaştırır.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet