Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese
26. Mai 2021
Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.
Unser Protokoll wird den Forschern helfen, die physiologischen Auswirkungen von drei verschiedenen Knochenmarktransplantationsmethoden zu verstehen und wie sie die experimentellen Ergebnisse bei klonaler Hämatopoese beeinflussen. Die Knochenmarktransplantation mit Gesamtkörperstrahlung kann sich negativ auf herz-kardiovaskuläre Organe auswirken und die Pathogenese der Krankheit verändern. Daher hat unser Labor zwei alternative Methoden entwickelt, um mögliche Nebenwirkungen zu minimieren oder zu vermeiden.
Die Verfahren werden von Eunbee Park, einer Doktorandin, und Megan Evans, einer Postdoktorandin, beide aus meinem Labor, demonstriert Für Thorax- und Bauchabschirmung, platzieren Sie die verstellbare Tablett und den Röntgenstrahler im richtigen Abstand, um eine gleichmäßige Bestrahlung zu erreichen. Und legen Sie die betäubten Mäuse auf eine flache LED-Platte, die in Rückenlage umgekehrt zueinander ist. Befestigen Sie die Pfoten mit Klebeband an der Platte und platzieren Sie die LED-Abschirmung so, dass das untere Ende mit dem Xiphisternumknochen ausgerichtet ist und das obere Ende des Bleischildes in der Nähe des Thymus sitzt.
Setzen Sie die Mäuse nach der Abschirmung in den Bestrahlungskörper und setzen Sie die Tiere zwei 5,5 grauen Bestrahlungsfraktionen aus, die durch ein Intervall von vier bis 24 Stunden getrennt sind. Zur Kopfabschirmung die vier Pfoten der Maus vorsichtig an den Bauch kleben. Legen Sie die Maus in einen konischen Rückhaltearm und schieben Sie den Rückhalteer in den Schlitz innerhalb des Bleischildes, so dass der Kopf und die Ohren der Maus vollständig bedeckt sind, so dass der Rest des Mauskörpers für eine Strahlung freigelegt bleibt.
Nach der Abschirmung legen Sie die Mäuse in den Bestrahlungskörper und setzen die Tiere 5,5 grauen Fraktionen einer Strahlung aus, die durch ein Vier- bis 24-Stunden-Intervall getrennt sind. Nach jeder Strahlenbehandlung legen Sie die betäubten Mäuse in einen Käfig auf einer beheizten Matte mit Überwachung, bis sie vollständig genesen sind. Um die Knochen zu isolieren, desinfizieren Sie die Haut der Spendermaus mit 70% Ethanol und machen Sie einen kleinen quer verlaufenden Hautschnitt unterhalb des Brustkorbs.
Halten Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts fest, reißen Sie in entgegengesetzte Richtungen zu Kopf und Füßen und schälen Sie die Haut von allen Gliedmaßen. Schneiden Sie über die Schultern und Ellbogengelenke und verwenden Sie ein Labortuch, um die angeschlossenen Muskeln und das Bindegewebe aus den Humeri zu entfernen. Verrenken Sie vorsichtig die Gelenke zwischen Femur und Hüftknochen.
Und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um entlang der Oberschenkelköpfe zu schneiden, um die Beine zu lösen. Schneiden Sie über das Kniegelenk, um den Femur und das Schienbein zu trennen. Und verwenden Sie Labortücher, um die angeschlossenen Muskeln und das Bindegewebe vorsichtig aus den Knochen zu entfernen.
Ziehen Sie dann die Knochen von Mäusen des gleichen Genotyps in einzelne 50-Milliliter-Konusenröhrchen, die 20 Milliliter eiskaltes steriles PBS auf Eis enthalten. Um die Knochenmarkzellen in einem Gehäuse der Biosicherheitsklasse zwei zu isolieren, verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um ein kleines Loch in den Boden eines sterilen 500-Mikroliter-Mikroröhrchens zu bohren. Und legen Sie das Röhrchen in ein einzelnes steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern eiskaltem sterilem PBS.
Wenn alle Röhrchen vorbereitet sind, entfernen Sie das PBS aus dem Röhrchen, das die isolierten Knochen enthält, und übertragen Sie die Knochen auf eine sterile 100-Millimeter-Zellkulturschale. Verwenden Sie eine feine Zange und eine kleine Schere, um die Epiphyse vorsichtig von den Enden jedes Knochens zu entfernen, und legen Sie bis zu sechs Knochen in jedes 500-Mikroliter-Röhrchen. Wenn alle Knochen geschnitten wurden, extrahieren Sie die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation.
Wenn der gesamte Markinhalt entfernt wurde, sollten die Knochen weiß und durchscheinend mit einem relativ großen roten Pellet am Boden des 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens erscheinen. Für die Knochenmarkzelltransplantation verdünnen Sie die isolierten Knochenmarkzellen in serumfreien RPMI-Medien und laden 200 Mikroliter der Zellsuspension in eine 0,5 Milliliter Insulinspritze pro Maus, die injiziert werden soll. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt haben, injizieren Sie langsam das gesamte Zellvolumen in die Retroorbitalvene jedes betäubten Empfängertiers.
Dann legen Sie einen Tropfen Proparacain auf das Auge zur Schmerzlinderung. Und erlauben Sie der Maus, das Bewusstsein wiederzuerlangen, während sie überwacht wird. Es sollte die Wirkung von drei BMT-Vorkonditionierungsmethoden auf die Spenderzelltransplantation verglichen werden.
Die Fraktionen der Spenderzellen im peripheren Blut und Herzgewebe wurden einen Monat nach der BMT mittels Durchflusszytometrie analysiert. In dieser repräsentativen Analyse wurden im peripheren Blut von Empfängermäusen, die eine Ganzkörperbestrahlung erhielten, Monozyten, Neutrophile und B-Zellen weitgehend abgetragen und durch die Nachkommen von Spenderknochenmarkzellen ersetzt. Darüber hinaus wurden die ansässigen Empfänger-Herzmonozyten- und Neutrophilenpopulationen fast vollständig durch Spenderzellen ersetzt.
In der teilweise abgeschirmten Bestrahlungsgruppe war der vom Spender abgeleitete kardiale Immunzellersatz bescheiden. Die Knochenmarkzellen der Empfängermaus in den abgeschirmten Regionen trugen wahrscheinlich zu einem niedrigeren Niveau der peripheren Blutrekonstitution bei als Mäuse, die eine Ganzkörperbestrahlung erhielten. In der Gruppe ohne BMT-Vorkonditionierung waren Spenderzellen vier Wochen nach bmT im peripheren Blut und in den Herzen der Empfängermäuse nachweisbar.
Darüber hinaus dehnten sich Tet2-defiziente Spenderzellen im Laufe der Zeit allmählich aus. Im Vergleich dazu zeigten Empfängermäuse, die mit Wildtyp-Spenderzellen transplantiert wurden, eine minimale klonale Ausdehnung der Spenderzellen. Die Optimierung dieser experimentellen Modelle wird strengere Studien der klonalen Hämatopoese-Treibergene ermöglichen, die zu allen Todesursachen wie Kardiometabolischen Erkrankungen und Krebs beitragen.
Wir hoffen, dass unsere Protokolle es den Forschern ermöglichen werden, die klonale Hämatopoese zu untersuchen, um zu untersuchen, wie sie zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen Krankheitszuständen beiträgt.
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Übersicht
In diesem Artikel werden drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT) beschrieben, die zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen verwendet werden. Die Methoden umfassen die BMT mit Ganzkörperbestrahlung, abgeschirmter Bestrahlung und adoptive BMT ohne Vorbehandlung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Knochenmarktransplantation
- Klonale Hämatopoese
- Mausmodelle
Hintergrund
- Die Knochenmarktransplantation ist entscheidend für die Untersuchung der Hämatopoese.
- Die Ganzkörperbestrahlung kann die Herz-Kreislauf-Gesundheit negativ beeinflussen.
- Alternative Methoden zielen darauf ab, Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der herkömmlichen Knochenmarktransplantation zu reduzieren.
- Das Verständnis dieser Methoden ist wesentlich, um die Ergebnisse experimenteller Studien zu verbessern.
Zweck der Studie
- Untersuchung der physiologischen Auswirkungen verschiedener BMT-Methoden.
- Beurteilung, wie diese Methoden die klonale Hämatopoese beeinflussen.
- Vorlage von Protokollen zur Minimierung unerwünschter Effekte während der BMT.
Verwendete Methoden
- BMT mit Ganzkörperbestrahlung
- BMT mit geschirmter Bestrahlung
- Adoptive BMT ohne Vorkonditionierung
- Ausführliche prozedurale Demonstrationen durch Labormitglieder
Hauptergebnisse
- Zeigte die Auswirkungen einer Ganzkörperbestrahlung auf kardiovaskuläre Organe auf.
- Stellte Verfahren für alternative BMT-Methoden dar.
- Lieferte Einblicke in die Auswirkungen auf die Krankheitspathogenese.
- Veranschaulichte die Bedeutung des Abschirmens während der Bestrahlung.
Schlussfolgerungen
- Alternative Methoden der Knochenmarktransplantation können Nebenwirkungen einer Ganzkörperbestrahlung abschwächen.
- Das Verständnis dieser Methoden ist entscheidend für zukünftige Forschung zur klonalen Hämatopoese.
- Die etablierten Protokolle können Forscher bei der Gestaltung experimenteller Versuchsanordnungen leiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die klonale Hämatopoese ist ein altersassoziiertes Risikofaktor, das mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Mortalität verknüpft ist und experimentelle Modelle erfordert, die hämatopoetische Effekte isolieren, ohne störende Organ-Toxizität zu verursachen. Die traditionelle Knochenmarktransplantation mit Ganzkörperbestrahlung schädigt kardiovaskuläre und neuronale Gewebe, was mechanistische Untersuchungen somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen erschwert. Die beschriebenen Abschirmungs- und nicht-konditionierten adoptiven Transfermethoden ermöglichen es Forschern, Treibergene der klonalen Hämatopoese wie Tet2 in kardiovaskulären Kontexten zu untersuchen, während die Organfunktion erhalten bleibt, was die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in Entdeckungspipelines unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen, indem die kardialen und zerebralen Mikroumgebungen während der Bestrahlung erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Verringert die Schädigung von Nebenzielorganen und verbessert somit die Spezifität der Detektion klonaler Expansionen im peripheren Blut und im Herzmuskelgewebe.
- Predictiver Wert: Ermöglicht die Beurteilung von klonalen Fitnessvorteilen, die durch Treibermutationen unter physiologischen Bedingungen, die für kardio-metabolische Erkrankungen relevant sind, vermittelt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare chimäre Mausmodelle mit quantifizierbarem Engraftment von Donorzellen im Blut und in Organen mittels Durchflusszytometrie.
- Operativer Wert: Standardisiert die hämatopoetische Rekonstitution unabhängig von der Vorbehandlungsmethode und ermöglicht so den vergleichenden Screening von mutierten gegenüber wildtypischen hämatopoetischen Stammzellen.
- Eignung für Assays: Stellt validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Testung von Wirkstoffen in Signalwegen zur Modulation der klonalen Hämatopoese bereit.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält das hämatopoetische Nischen- und Organintegrität aufrecht und ermöglicht die langzeitliche Verfolgung der klonalen Expansion sowie deren Beitrag zur kardiovaskulären Pathogenese.
- Operativer Wert: Ermöglicht den direkten Vergleich von Präkonditionierungsstrategien, um die Zielwahl basierend auf der Einheilungsrate und den klonalen Dynamiken risikomindernd zu bewerten.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbasierte Modellierung hämatopoetischer Prozesse mit der präklinischen Evaluierung der klonalen Hämatopoese in krankheitsrelevanten Systemen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, indem sie die Hypothesenprüfung von Mechanismen der klonalen Hämatopoese vor der Identifizierung von Leitstrukturen in Programmen zu kardiovaskulären und entzündlichen Erkrankungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die funktionelle Validierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen durch kontrollierte Rekonstitution und organspezifische Verfolgung von Immunzellen.
- Screening: Liefert standardisierte, quantifizierbare Engraftment-Metriken, die zum Vergleich der klonalen Fitness über verschiedene genetische Hintergründe hinweg unerlässlich sind.
- Analytik: Erzeugt durchflusszytometrische Messgrößen zur Spender-Chimärismusbestimmung in Blut und Herzmuskelgewebe und ermöglicht damit statistische Vergleiche der Wirkung unterschiedlicher Präkonditionierungen.
- Translationale Forschung: Erhält die Funktion von Herz- und Nervengewebe aufrecht und erlaubt so die Beurteilung des Einflusses von klonaler Hämatopoese auf kardiovaskuläre Phänotypen, ohne durch Bestrahlung verursachte Störfaktoren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Modellierung der klonalen Hämatopoese über mehrere Treibergene und Krankheitskontexte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem hämatopoetische Effekte von systemischer Toxizität isoliert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Modellen der klonalen Hämatopoese durch definierte Abschirmungs- und Zelltransferprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem biologisches Rauschen in präklinischen Modellen der klonalen Expansion reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf Klon-Fitness-Daten, die in physiologisch relevanten Systemen generiert wurden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Handhabung von Mäusen, der Strahlenschutzsicherheit und Techniken zur Isolierung von Knochenmark.
- Hängt von dem Zugang zu Bestrahlungsanlagen mit Abschirmungsfunktion und steriler Zellkulturausstattung ab.
- Erfordert die Standardisierung von Anästhesie-, Erholungsüberwachungs- und retroorbitalen Injektionsverfahren an verschiedenen Standorten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn abgeschirmte oder nicht konditionierte Knochenmarktransplantationen auf verschiedene Mausstämme oder Genotypen angewendet werden.
- Ist durch die Notwendigkeit einer sorgfältigen Validierung der Abschirmeffizienz begrenzt, um organspezifischen Schutz sicherzustellen, ohne die hämatopoetische Ablation zu beeinträchtigen.
