Charakterisierung und funktionelle Vorhersage von Bakterien im Eierstockgewebe
23. Oktober 2021
Immunhistochemische Färbung und 16S ribosomale RNA-Gensequenzierung (16S rRNA-Gen) wurden durchgeführt, um Bakterien in krebsartigen und nicht krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die kompositorischen und funktionellen Unterschiede der Bakterien wurden mit Hilfe von BugBase und Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) vorhergesagt.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Bakterien im Eierstockgewebe zu entdecken und ihre Funktionen vorherzusagen. Immunhistochemische Färbung und 16S rRNA-Sequenzierung wurden verwendet, um Bakterien in krebsartigen und nicht-krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die Kompensations- und Funktionsunterschiede der Bakterien werden durch BoPs und zellgenetische Untersuchung von Gemeinschaften durch Rekonstruktion unbeobachteter Tage vorhergesagt.
Unser Protokoll zielt darauf ab, Bakterien aus Eierstockgewebe in situ zu extrahieren. Es kann auch verwendet werden, um Bakterien in Tumoren jeglicher Art zu entdecken. Die Hauptvorteile unseres Protokolls sind, dass es einfach und bequem ist, dass es in fast jedem Labor realisiert werden kann.
Es ist auch schnell, die Ergebnisse zu erhalten. Während der Praxis im Protokoll ist es wichtig, Bakterien außerhalb des Tumorgewebes auszuschließen. Daher müssen alle Verfahren in diesem Protokoll steril sein.
Trennen Sie während der Operation die resezierten Eierstöcke mit einer neuen sterilen Pinzette in etwa einen Zentimeter dicke Gewebeproben. Vermeiden Sie es, während des gesamten Verfahrens etwas anderes zu berühren. Nach der Trennung die Probe in ein steriles Röhrchen geben und zur Übertragung in flüssigen Stickstoff geben.
Proben bei minus 80 Grad Celsius konservieren. Fixieren Sie Gewebe durch Formalin und betten Sie sie dann durch Paraffin ein. Dieses Protokoll kann hier pausiert werden.
Die Gewebe können für eine längere Konservierung bei Raumtemperatur gehalten werden. Um weitere Schritte zu bedienen, schneiden Sie die Proben in fünf Mikrometer serielle Abschnitte. Dann trocknen Sie die Proben.
Machen Sie Deparaffin und Rehydratation zu den Proben. Um Antigene abzurufen, ist eine 10-minütige Mikrowellenbehandlung im EDTA-Puffer erforderlich. Tauchen Sie die Proben in PBS, das 0,3% Wasserstoff enthält.
Peroxidieren Sie für 20 Minuten, um die endogene Peroxidaseaktivität zu stoppen. Führen Sie die Antikörper-EMA am LPS-Kern in einer Konzentration von 1 über 300 durch. Und halten Sie es für eine Nacht bei vier Grad Celsius.
Um die Bakterien zu entdecken, verwenden Sie ein DAP-Substrat-Kit, um die Existenz von HRP nachzuweisen. Verwenden Sie auf der Grundlage der Anweisungen eines Herstellers HRP-Polymer, Anti-Kaninchen-Antikörper. Verwenden Sie einen Tischkonzentrator, um Antikörper vollständig kombinieren zu lassen.
Verwenden Sie PBS, um unkombinierte Antikörper zu eliminieren. Führen Sie Ihre chemische Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und spülen Sie die Proben dann unter Wasser. Dehydrieren Sie die Proben.
Anzugproben durch Unterschrift. Und geben Sie als Beispiel mit der Imaging Pro Plus Prepare-Bibliothek basierend auf dem Protokoll des Herstellers ein. Üben Sie das Primermuster, das aus den genspezifischen Sequenzen und den Illumina-Adapter-Überhang-Nukleotidsequenzen besteht.
Um die Geburtenraten für die V4-Region bakterieller 16s auf rRNA-Gensequenzen zu amplifizieren, amplifizieren Sie die Vorlage aus der DNA-Probeneingabe mithilfe von Amplicon PCR. Verwenden Sie Magnetperlen Mag-Bind RxNPure Plus, um die Reaktionsmischung aus dem PCR-Produkt zu entfernen. Führen Sie eine indizierte PCR-Amplifikation zum zweiten Mal durch.
Verwenden Sie Agilent 2200 TapeStation, um die Bibliothek zu überprüfen. Verwenden Sie das QuantiFluor dsDNA System, um die Bibliothek zu quantifizieren. Mit einem 600-Zyklus produzieren v3-Standard-Durchflusszellen etwa 100.000 gepaarte Enden.
2 mal 300 Basis 3. Bibliotheken werden denormalisiert, gepoolt und sequenziert. Die Rohraten jeder Probe werden auf Basis der Sequenzierungsqualität von Trimmomatic filtriert.
Die Primer- und Adaptersequenzen sollten beide entfernt werden. Sequenzlesevorgänge mit beiden Paaren und Qualitäten unter 25 sollten verkürzt werden. Analysieren Sie die 16s rRNA mit dem Softwarepaket QIIME.
Sammeln Sie Sequenzen, um OTUs mit einem Ähnlichkeits-Cutoff bei 97% zu bilden Bei OTUs sollte die relative Häufigkeit in jeder Stichprobe berechnet werden. Verwenden Sie einen Bayes'schen Klassifikator, der sich im RDP-Trainingssatz befindet, um alle Sequenzen zu sortieren. Mit gegebener OTU wird OTUs eine Klassifikation zugeordnet, die die Hauptkohärenz der Sequenzen aufweist.
Die OTUs werden auf der Grundlage einer Beispielgruppeninformation an der Silva-Datenbank ausgerichtet. Führen Sie alphadiversität und die UniFrac-basierte Hauptkoordinatenanalyse durch. Um die beziehungsbezogene Darstellung der Eigenschaften der Bakterien vorherzusagen, verwenden Sie BugBase.
Vorhersage der funktionellen Zusammensetzung eines Metagenoms am PICRUSt. Mit der Verwendung von Überwachungsdaten und einer Datenbank mit Referenzgenomen können Sie die verschiedenen Funktionen zwischen jeder Gruppe mit Hilfe der STAMP-Software analysieren. Verwenden Sie eine Statistiksoftware, um das Ergebnis zu berechnen.
Die Angabe der statistischen Signifikanz sollte auf p kleiner als 0,05 gesetzt werden. Berechnen Sie Störfaktoren, zu denen Alter und Parität gehören, anhand des t-Tests des Schülers. Berechnen Sie den Wechseljahrsstatus, die Geschichte von Bluthochdruck und Diabetes durch den Chi-Quadrat-Test.
Berechnen Sie die Anzahl der Eierstockbakterientaxa durch den Mann-Whitney U-Test. 16 Patienten wurden in diese Studie aufgenommen. BugBase wurde verwendet, um die Analyse vorhergesagter Metagenome zu üben.
Die potentiell pathogenetische und immunhistochemische Ovariale unter Verwendung antibakterieller LPS-Antikörper. Diese Abbildung zeigt den bakteriellen Reichtum und die Vielfalt in den Krebs- und Kontrollgruppen. Aufgedeckt durch 16S rRNA-Sequenzierung.
Die Zahlen sind beobachteter Artenindex. Chao1 Index, ACE Index, Shannon Index, Evenness Index, Simpson Index, jeweils. Die relative Häufigkeit von Phyla und den 12 häufigsten Bakterienarten in den Eierstockproben ist in dieser Abbildung dargestellt.
Abbildung A, B, C und D.Bezeichnet die relative Häufigkeit des Panels in den Eierstöcken der Patientinnen der Kontrollgruppe und der Eierstockkrebsgruppe. Die relativen Häufigkeiten der zwölf häufigsten Bakterienarten in den Eierstöcken der Kontrollpatientinnen und der Eierstockkrebsgruppe. Dies ist commonests, geclustert mit PCoA und der relativen Häufigkeit von Anoxynatronum sibiricum und Methanosarcina vacuolata.
Abbildung A zeigt die Commonests, die mit PCoA gruppiert wurden. PC1 und PC2 werden auf x und der y-Achse gezeichnet. Der rote Block ist gleich der Probe in der Eierstockkrebsgruppe.
Der blaue Kreis entspricht einer Stichprobe in der Kontrollgruppe. Die Proben aus der Eierstockkrebsgruppe können von anderen Proben in der Kontrollgruppe getrennt werden. Abbildung B zeigt Commonests, die mit PCoA geclustert wurden.
PC1 und PC2 werden auf der x- und y-Achse dargestellt. Der rote Block entspricht einer Probe in der Gruppe der Eierstockkrebsgruppen. Der blaue feste Kreis entspricht einer Probe der Patientin mit Uterusmyom.
Und der blaue Hohlkreis entspricht einer Probe einer Patientin mit Uterusadenomyose. Abbildung C zeigt die relative Häufigkeit von Anoxynatronum sibiricum. Abbildung D ist Methanosarcina vacuolata.
Diese Zahl ist die BugBase-Analyse der vorhergesagten Metagenomik. Der potenziell pathogenetische und oxidative Stresstoleranz-Phänotyp der Eierstöcke in der Krebsgruppe war stärker als der der Kontrollgruppe. Diese Zahl ist signifikant unterschiedlicher KEGG-Pfadraum zwischen der Krebs- und Kontrollgruppe durch PICRUSt-Analyse.
Wenn wir unsere Proben erhalten, wird eine neue sterile Pinzette benötigt. Achten Sie auf eine mögliche Kontamination der Proben. Dass Bakterien außerhalb des Tumorgewebes außerhalb des Standorts die Auflösung stark beeinflussen können.
Das Festlegen der Kontrollgruppe für jeden Schritt wird bevorzugt. Um die Wirkung einer möglichen Kontamination zu reduzieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll dient dazu, Bakterien in bösartigen und nicht bösartigen Eierstockgeweben direkt vor Ort zu identifizieren und zu unterscheiden. Mithilfe von immunhistochemischer Färbung und 16S-rRNA-Sequenzierung werden die zusammensetzungsmäßigen und funktionellen Unterschiede der Bakterien vorhergesagt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Onkologie
- Immunologie
Hintergrund
- Das Verständnis der bakteriellen Zusammensetzung in Eierstockgeweben kann Einblicke in die Krebsbiologie liefern.
- Mittels Immunhistochemie-Färbung lässt sich die Visualisierung von Bakterien in Gewebeproben ermöglichen.
- Die 16S-rRNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung bakterieller Arten.
- Vorhersagewerkzeuge wie BugBase und PICRUSt können bakterielle Funktionen anhand ihrer genetischen Information erschließen.
Zweck der Studie
- Extraktion und Identifizierung von Bakterien aus Eierstockgeweben.
- Vergleich der bakteriellen Populationen in bösartigem versus nicht bösartigem Gewebe.
- Vorhersage der funktionellen Rollen der identifizierten Bakterien.
Verwendete Methoden
- Immunhistochemische Färbung zur Gewebevisualisierung.
- 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung zur bakteriellen Identifizierung.
- BugBase zur Vorhersage der bakteriellen Zusammensetzung.
- PICRUSt zur Vorhersage funktioneller Unterschiede zwischen Bakterien.
Hauptergebnisse
- Identifizierung unterschiedlicher bakterieller Populationen in bösartigen und nicht bösartigen Eierstockgeweben.
- Funktionelle Vorhersagen weisen auf Unterschiede in den Stoffwechselkapazitäten zwischen den beiden Gewebetypen hin.
- Das Protokoll ist an verschiedene Tumortypen anpassbar.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet einen Rahmen, um die Rolle von Bakterien beim Eierstockkrebs zu verstehen.
- Die Methoden sind zugänglich und können in den meisten Laboren umgesetzt werden.
- Weitere Untersuchungen könnten die Bedeutung dieser bakteriellen Gemeinschaften für den Krebsverlauf erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der mikrobiellen Präsenz in Eierstockgeweben trägt einem wachsenden Bedürfnis Rechnung, Krebszielhypothesen zu entlasten, indem mikroumgebungsbedingte Faktoren aufgedeckt werden, die die Tumorbiologie beeinflussen können. Dieses Protokoll ermöglicht der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung, den Beitrag von Bakterien zu onkogenen Signalwegen zu bewerten und liefert so mechanistische Erkenntnisse in der frühen Entdeckungsphase. Durch die Bereitstellung einer standardisierten Methode zum Nachweis und funktionellen Vorhersagen gewebeassoziiierter Mikroben unterstützt es die Priorisierung von Zielstrukturen mit höherer Übertragbarkeit.
Strategische Anwendungen in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft Hypothesen zum Tumormikromilieu, indem Bakterien identifiziert werden, die in ovarialen Tumorgeweben anders häufig vertreten sind als in nicht krebsartigem Gewebe.
- Operationaler Wert: Nutzt Immunhistochemie und 16S-rRNA-Sequenzierung, um das Vorkommen von Bakterien räumlich aufzulösen und vor Ort zu quantifizieren.
- Prädiktiver Wert: Wendet BugBase und PICRUSt an, um funktionelle Phänotypen wie Pathogenität und Toleranz gegenüber oxidativem Stress abzuleiten, die mit Krebsphänotypen assoziiert sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantifizierbare 16S-rRNA-Sequenzierungsdaten, die für den vergleichenden mikrobiellen Profiling über verschiedene Proben-Gruppen hinweg geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Beinhaltet Kontaminationskontrollen und sterile Gewebehandlung, um eine zuverlässige Detektion echter gewebeassoziiierter Signale sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Hochdurchsatz-Sequenzierung und Bioinformatik-Pipelines für eine breitere Anwendung über verschiedene Tumortypen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Erkennung mikrobieller Signaturen in menschlichen Eierstockkrebsgeweben, was die Relevanz für die menschliche Pathophysiologie untermauert.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die longitudinale Verfolgung mikrobieller Veränderungen vom normalen zum malignen Zustand und unterstützt die Identifizierung von Biomarkern.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Vorhersage funktioneller mikrobieller Beiträge (z. B. Stoffwechselwege), die das Tumorwachstum oder die Therapieantwort beeinflussen könnten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Zielhypothesengenerierung bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere in Programmen zur Immunonkologie und zum Mikroumfeld.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem aufgezeigt wird, ob bestimmte Bakterien in Tumorgeweben angereichert sind und mit Krebsphänotypen assoziiert sind.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative mikrobielle Profildaten, die mit Multi-Omics-Datensätzen zur Priorisierung von Zielstrukturen kombiniert werden können.
- Analytik: Ermöglicht funktionelle Vorhersagen mithilfe von BugBase und PICRUSt und damit den Vergleich metabolischer und phänotypischer Potenziale zwischen Gruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet den Nachweis von Mikroben mit der Krebsbiologie durch Analyse differenzieller Häufigkeiten und funktionelle Schlussfolgerungen in patientenstämmigen Geweben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an andere solide Tumore, wodurch krebsübergreifende Mikrobiomstudien mit einem standardisierten Workflow möglich sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Anwesenheit von Mikroben mit funktionellen Phänotypen in krebsrelevanten Signalwegen verknüpft wird.
- Operativer Wert: Verwendet zugängliche Techniken (IHC, 16S-Sequenzierung, Bioinformatik), die in den meisten Forschungslabors durchführbar sind.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem mikrobielle Störgrößen oder Modulatoren der Tumorbiologie früh im Entdeckungsprozess identifiziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Zielstruktur-Auswahl, indem mikroumgebungsbedingte Variablen berücksichtigt werden, die die Wirksamkeit von Arzneimitteln beeinflussen können.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie, Molekularbiologie und Bioinformatik für Sequenzierung und funktionelle Vorhersage.
- Benötigt sterile Gewebehandhabung, PCR-Ausrüstung, Sequenzierplattformen und Werkzeuge wie QIIME, Trimmomatic und STAMP.
- Setzt standardisierte Protokolle an verschiedenen Standorten voraus, um Kontaminationen zu minimieren und die Vergleichbarkeit mikrobieller Daten sicherzustellen.
- Muss bei der Anwendung auf andere Organsysteme die Variabilität des Wirtsgewebes und die Herausforderungen durch geringe Biomasse berücksichtigen.
- Ist durch die Nachweisempfindlichkeit bei Gemeinschaften mit geringer Häufigkeit sowie durch die Abhängigkeit von Referenzdatenbanken für die funktionelle Interpretation begrenzt.
