Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung und Untersuchung lebensfähiger Adipozyten und SVF-Zellen der stromalen Gefäßfraktion aus menschlichem viszeralem Fett. Der enzymatische Verdau mit Kollagenase gewährleistet hohe Ausbeuten an Gesamt-RNA aus reifen Adipozyten, einschließlich microRNAs, die für die Expressionsanalyse geeignet sind. Gleichzeitig wird die Methode für die Identifizierung von Makrophagen mittels Durchflusszytometrie optimiert.

Dieses Protokoll bietet grundlegende Richtlinien zur Fehlerbehebung für die einfache und effiziente Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und SVF-Zellen aus humanen VAT-Biopsien in einem einzigen Prozess. Identifizieren Sie nach dem Uterusverschluss und der Blutstillung das Omentum major und verlängern Sie es auf einer feuchten Kompresse. Identifizieren Sie eine avaskuläre Zone und bohren Sie mit einer Kelly-Pinzette die Außenseite des viszeralen Fettgewebes (VAT).

Mit einer Ochsner-Zange die proximale und distale Seite in der Zone, in der VAT gebohrt wurde, eingespannt und mit einer Metzenbaumschere das Gewebe durchtrennt. Binden Sie das Omentum major mit schwarzer Seide Nummer eins zusammen, entfernen Sie dann die Ochsner-Pinzette und beurteilen Sie die Blutstillung. Um eine enzymatische Verdauung durchzuführen, schneiden Sie vier Gramm VAT ab und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere in einer Sezierschiene in kleine Stücke.

Füllen Sie die Stücke in ein neues steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 25 Milliliter Aufschlusslösung hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten in einem Orbitalschüttler bei 125 U/min. Anschließend filtrieren Sie das verdaute Gewebe durch drei Schichten Gaze in ein neues steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation sollten zwei Phasen sichtbar sein. Die obere Phase entspricht reifen Adipozyten, während SVF-Zellen im Pellet verbleiben.

Übertragen Sie die reifen Adipozyten in ein Röhrchen. Lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1000 Mikrolitern Reagenz auf Säure-Guanidinium-Phenol-Basis und mischen Sie sie gründlich mit einer P1000-Mikropipette, um zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu fördern.

Das Zelllysat wird fünf Minuten lang bei 12.000 G zentrifugiert, um drei Phasen zu erhalten, eine obere gelbe Phase, die den Adipozytenlipiden entspricht, eine mittlere rosa Phase, die den Nukleinsäuren entspricht, und ein Pellet mit Zelltrümmern. Entfernen Sie die Lipidschicht vorsichtig mit einer P200 Mikropipette. Übertragen Sie dann die mittlere Phase in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie darauf achten, die anderen Phasen nicht zu stören.

Verwenden Sie nach der Aufreinigung der RNA und der Messung der Konzentration mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer ein RNA-Integritätskit, um die RNA-Integritätszahl zu bestimmen. Verwenden Sie dann das kleine RNA-Kit, um die Konzentration und den Prozentsatz der microRNAs zu bestimmen. Legen Sie den Clip in einen Bioanalysator.

Verdünnen Sie 10 Mikroliter SVF-Zellsuspension in 90 Mikroliter 0,4%ige Trypanblaulösung und geben Sie 10 Mikroliter auf ein Standard-Hämozytometer. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen sorgfältig, ohne die toten Zellen, in vier Quadraten an der Ecke der Zählkammer. Übertragen Sie insgesamt 1 Million SVF-Zellen pro Milliliter in ein fünf Milliliter fassendes Polypropylen-Reagenzglas mit rundem Boden für die Durchflusszytometrie und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 800 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Vorsichtig vortexen, um das Pellet zu lösen und die Zellen in 100 Mikrolitern PBS wieder zu suspendieren. Fügen Sie die vortitrierte optimale Konzentration jedes Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörpers hinzu, der für ein Zelloberflächenantigen spezifisch ist, mischen Sie es vorsichtig und inkubieren Sie die Zellen dann 15 Minuten lang im Dunkeln. Fügen Sie einen Überschuss an kaltem PBS hinzu.

Und zentrifugieren Sie den SVF bei 400 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Mantelflüssigkeit

Filtern Sie dann die Zellen durch drei Schichten Gaze in ein neues Fünf-Milliliter-Reagenzglas aus Polypropylen mit rundem Boden. Wirbeln Sie jedes Rohr kurz vor der Analyse vor und zählen Sie mindestens 10.000 Ereignisse für die Durchflussanalyse. Dieses RNA-Extraktionsprotokoll wurde verwendet, um RNA und microRNAs mit ausreichender Reinheit und hoher Integrität aus reifen Adipozyten zu erhalten.

Die RNA-Integrität wurde mit einem RNA-Qualitätskontrollanalysator bewertet. Pro Gramm viszeralem Fettgewebe waren etwa 2,8 mal 10 bis sechs kernhaltige Zellen vorhanden. Die stromalen vaskulären Fraktionszellen wurden mit Fluorophor-konjugierten Primärantikörpern markiert, um 18 Makrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse zu identifizieren und zu charakterisieren.

Zellaggregate wurden aus der Analyse eliminiert, indem die Vorwärtsstreufläche im Vergleich zur Vorwärtsstreuhöhe aufgetragen wurde. Dann wurden zelluläre Trümmer ausgeschlossen, indem die Zellen basierend auf der richtigen Größe und Komplexität unter Verwendung des Vorwärtsstreubereichs und des Seitenstreubereichs angegrenzt wurden. Um Makrophagen zu analysieren, wurden die Monozyten- und Makrophagen-Zellen unter Verwendung von CD45- und CD14-Markern ausgewählt.

Anschließend wurden die CD45-CD14 doppeltpositiven Zellen anhand der Makrophagenmarker-HLA-DR-Expression getrennt. Es wurden zwei Untergruppen von Makrophagen identifiziert. Neben der Identifizierung neuer Zellphänotypen ermöglicht dieses Protokoll die Verwendung gereinigter Zellpopulationen für zukünftige Analysen, wie z. B. DNA-Methylierung, posttranslationale Modifikationen und Signalwege.