Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Da es sich bei Thermobia domestica um ein basales Insekt handelt, werden genetische Studien an dieser Art die Mechanismen beleuchten, die der Evolution wichtiger Innovationen bei Insekten zugrunde liegen, wie z. B. Motorflug und Metamorphosen. Dieses Protokoll deckt grundlegende Techniken ab, von der Kulturerhaltung über die Mikroinjektion von Eizellen bis hin zur Implementierung von Thermobia als Labormodellspezies. Diese Methode kann auch für die Anwendung anderer genetischer Werkzeuge wie RNI-vermittelter Gen-Knockdown und Transgenese bei Thermobie verwendet werden.

Halten Sie Wildtyp- und Mutantenpopulationen in einem großen Plastikbehälter mit normalem künstlichem Fischfutter, Wasser in Plastikbechern mit einem Belüftungsloch an der Oberseite, einem gefalteten Papier zum Verstecken der Insekten und geschichteter Baumwolle zum Legen von Eiern. Bewahren Sie alle T.domestica-Kulturen in 37 Grad Celsius heißen Inkubatoren auf und stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in jedem Behälter auf 60 bis 80 % ein. Zur Vorbereitung der Eizellentnahme setzen Sie etwa 20 männliche und 20 weibliche Erwachsene in einen mittelgroßen Behälter mit Futter, einem Wasservorrat, einem gefalteten Papier und einem kleinen Stück geschichteter Baumwolle für die Eiablage um. Richten Sie mehrere Kolonien ein, um innerhalb kurzer Zeit eine große Anzahl von Embryonen zu erhalten.

Ersetzen Sie am Tag der Injektion die Baumwolle in den Behältern durch neue Baumwolle. Acht Stunden später sammeln Sie die Eier aus der geschichteten Baumwolle, indem Sie die Schichten mit einer Pinzette trennen. Richten Sie die Eier mit einem feuchten Pinsel auf dem doppelseitigen Klebeband aus und halten Sie dabei einen Abstand von zwei Millimetern zwischen den Eiern ein.

Alle Eizellen sollten so ausgerichtet sein, dass die Längsachse einer Eizelle zur Injektionsseite zeigt. Drücken Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel nach unten, damit sie während der Injektion fest halten. Laden Sie zwei Mikroliter der gRNA-CAS9-Lösung mit einem Mikrolader in eine Glasinjektionskapillare.

Stellen Sie sicher, dass sich vor der Injektion keine Luftblasen in der Lösung befinden. Bei Bedarf auf die Nadel klopfen, um die Blasen zu entfernen. Optimieren Sie die Form der Nadelspitze, indem Sie sie mit einer Pinzette leicht brechen, um ein Verstopfen zu verhindern und eine bessere Haltbarkeit bei einer Reihe von Injektionen zu erzielen.

Führen Sie die Nadel in der Mitte der Längsachse eines Eies ein und injizieren Sie eine kleine Menge der Lösung. Passen Sie die Konfiguration des elektronischen Mikroinjektors während der Injektion je nach Form der Nadelspitze an. Bewahren Sie die injizierten Eier in einem Behälter mit 60 bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit bei 37 Grad Celsius auf.

Überprüfen Sie die injizierten Eizellen regelmäßig und entsorgen Sie beschädigte Eizellen, um Pilzwachstum zu vermeiden. Wenn zu viel Pilz auf einem Ei wächst, reinigen Sie die Oberfläche des Eies mit 70% Ethanol. Tauchen Sie vor dem Schlüpfen den Objektträger mit den injizierten Eiern in Talkumpuder, um die Oberfläche des doppelseitigen Klebebandes zu beschichten.

Dadurch wird das Stapeln von geschlüpften Nymphen verhindert. Übertragen Sie die pulverbeschichteten Objektträger in einen mittelgroßen Behälter mit Lebensmitteln, Wasser und gefaltetem Papier. Isolieren Sie G1-Nymphen mit einem Aspirator oder einem Pinsel in 24-Well-Platten.

Halten Sie den Vorrat an künstlichem, regulärem Fischfutter aufrecht. Legen Sie die 24-Well-Platten in einen größeren Behälter mit einem Wasservorrat für eine Luftfeuchtigkeit von 60 bis 80 %. Drücken Sie die Nymphe oder einen Erwachsenen mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer Pinzette einen Cercus aus und sammeln Sie ihn in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen mit 50 Mikrolitern Ethanol. Lagern Sie die gesammelten Proben für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius.

Legen Sie die Probenröhrchen mit geöffneten Deckeln für 15 Minuten bei 70 Grad Celsius auf einen Thermoblock, um das Ethanol zu verdampfen. Die Injektion des gRNA-CAS9-Ribonukleoprotein-Komplexes in Embryonen innerhalb der ersten acht Stunden nach der Eiablage führt zu Indels an der gRNA-Zielstelle. Dies führt in einigen Zellen der injizierten Generation zu biallelischen Mutationen, und es werden in der Regel mutierte Mosaik-Phänotypen erhalten.

Als dieses Protokoll verwendet wurde, um eine gRNA zu injizieren, die auf das weiße Gen abzielte, zeigten 32,6 % der G0-Nymphen einen teilweisen Verlust der Pigmentierung in ihren Facettenaugen und Rückenregionen. Die Beurteilung der Keimbahntransformation von G0-Erwachsenen und mutierten G1-Individuen erfolgte durch genomische PCR, gefolgt von einem Hetero-Duplex-Mobilitätsassay. In G1-Proben sind unterschiedliche Bandenmuster zwischen Wildtyp- und mutierten Proben deutlich unterscheidbar.

Genome Editing in Thermobia bietet einen soliden Ansatz zur Analyse genetischer Mechanismen, die vorzeitigen Merkmalen von Insekten zugrunde liegen. Es hilft, die Geheimnisse hinter ihrem und unserem herausragenden Erfolg zu erforschen.