Name: Früherkennung von Cyanobakterienblüten und assoziierten Cyanotoxinen mit Fast Detection Strategy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Strategie zur Früherkennung von Cyanobakterienblüten und Cyanotoxinen in Wasserproben. Diese Methode kombiniert Fernerkundung, Drohnen und LCMS-Analyse für effektives Umweltmonitoring.

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Diese Forschung wurde vom "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" im Rahmen des Projekts "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania" finanziert und in Zusammenarbeit mit der Umweltschutzbehörde der Region Kampanien, Italien (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), Universität Neapel "Federico II" - Abteilung für Veterinärmedizin und Tierproduktion, Ref. Prof. A. Anastasio) durchgeführt.

1. Fernerkundung und proximale Sensorik: Datenerfassung und -analyse
HINWEIS: In diesem Fall werden Fernerkundungsdaten für eine erste Makrogebietsuntersuchung und zur Auswahl bestimmter Stellen von Küstengebieten verwendet, die beprobt werden sollen. Im MuM3 Framework17-Schema basiert der Logikfluss auf einem hierarchischen Überwachungsmodell, das mehrere Ebenen mit den Namen Information Layer umfasst. Die Informationen jeder Ebene basieren auf Daten, die mit einem oder mehreren Sensoren erfasst wurden, die an Bord von Plattformen in verschiedenen Höhen transportiert werden. Jede Ebene definiert eine räumliche Skala in Abhängigkeit von der Höhe der Messung19. Es besteht das Potenzial für mehrere Sensoren auf jeder Ebene. Einige Beispiele sind: sichtbares Nahinfrarot (VNIR) und thermisches Infrarot (TIR) Bildgebung20 auf Satelliten, Flugzeugen, Hubschraubern, UAV21 und an der Oberfläche; physikalische, chemische und biologische Analysen usw.22 an der Oberfläche und in schneller Reaktion mit dem mobilen Labor. Die von jedem Sensor erfassten Daten werden verarbeitet und kombiniert, um multispektrale Indizes zu berechnen (z. B. Normalized Difference Vegetation Index (NDVI), Normalized Difference Water Index (NDWI), Chlorophyll Index usw.), so dass die Rohdaten in nützlichere Parameter und Formate (z. B. thematische Karte) konvertiert werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3.jpg"> Abbildung 2: Fern-/proximale Sensoranalysen für die Probenahme (Schritte 1-2). Mehrstufiger und multisensorischer Ansatz zum Nachweis von Cyanobakterienblüten. Die Datenerfassung erfolgt durch Satellit (A), Flugzeug (B) und / oder Drohne (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol><li>Datenabruf mit Fernerkundung und proximaler Erfassung
	<ol>
<li>Abrufen von Daten aus den verschiedenen öffentlichen und privaten Fernerkundungsdatensätzen, die speziell für den inhaltsbasierten Abruf und die Szenenklassifizierung erstellt wurden. Typische Datensatzquellen, die in diesem Schritt verwendet werden, sind: Landsat-Produkte des U.S. Geological Survey23, Sentinel-2,3-Produkte der NASA24und Copernicus Open Access Hub25, MODIS-Aqua26.</li>
		<li>Identifizieren Sie die Produkte, die für das spezifische Gebiet und den Datumsbereich verfügbar sind, und berücksichtigen Sie die grenze, die sich aus der Wolkendecke ergibt. Definieren: A) der Interessenbereich mithilfe der grafischen Benutzeroberfläche und der Polygonauswahl; B) den Datumsbereich und die Wolkenabdeckung unter Verwendung der Textabfragefilterfelder. HINWEIS: Auch wenn viele wissenschaftliche Berichte zitieren, dass ein akzeptabler Wolkenbedeckungswert &lt;20% beträgt, ist es bei dieser Art von Forschung wichtig, nur auf die tatsächliche Wolkenbedeckung auf der Wasseroberfläche zu achten, so dass ein Wirksamkeitswert für diese Region &lt;5% beträgt.</li>
		<li>Wählen Sie Produkte aus, die von den Plattformen abgeleitet sind, die den spezifischen Anforderungen der Mission am besten entsprechen. Aus jeder Kombination von technischen Spezifikationen für Satellit und Nutzlast ist es möglich, mehrere Produktsammlungen zu erhalten. Zum Beispiel werden die NASA EOSDIS24 Datenprodukte auf verschiedenen Ebenen von Level 0 bis Level 4 verarbeitet: Die Level 0 Produkte sind Rohdaten mit voller Instrumentenauflösung, während auf höheren Ebenen die Daten in nützlichere Parameter und Formate umgewandelt werden. Normalerweise sind die Stufen 0-1 verfügbar, während die Produkte in den Stufen 2-4 eine spezifische Verarbeitung in Bezug auf bestimmte Forschungsziele benötigen, so dass ihre Verfügbarkeit zeitlich begrenzt ist und die Region abgedeckt ist.</li>
		<li>Laden Sie den ausgewählten Datensatz der Satellitenbeobachtungen herunter. Im Detail, indem Sie aus der Liste der Ergebnisse der vorherigen Aktion auswählen, laden Sie ein vollständiges Datensatzprodukt (z. B. eine Gruppe von Geo-Tiff-Dateien, eine für jedes Band sowie Infos und andere Metadaten) oder nur ein bestimmtes einzelnes Band herunter. HINWEIS: Für die spezifische Beschreibung jeder grundlegenden Aktion, die im Verfahren von Schritt 1 enthalten ist, lesen Sie bitte auch Huan-Huan Chen et al. 202027.</li>
	</ol></li>
	<li>Datenvorverarbeitung und -verarbeitung für die Analyse und Umwandlung in nützlichere Parameter und Formate, um ein erstes Screening des Makrobereichs zu ermöglichen. HINWEIS: Die folgenden Aktionen (Schritt 1.2) sind der Datenverarbeitung gewidmet, um Rohdaten aus niedrigeren Ebenen in Informationen und dann in nützliche Informationen (höhere Ebenen) umzuwandeln. Dieser Schritt besteht aus der Verarbeitung der Rohdaten jedes Sensors (z. B. Produktebenen 0-1) und der Umwandlung in übergeordnete Produkte (z. B. Ebenen 2-4) und anschließend in Informationsebenen, um nützlichere Parameter und Formate (z. B. thematische Karte) zu generieren.<ol>
<li>Vorverarbeitung von Rohdaten mit geometrischer und radiometrischer Kalibrierung. Diese Aktion könnte mit einer speziellen Software durchgeführt werden, die automatisch oder halbautomatisch (unbeaufsichtigt oder überwacht) eine Reihe verbundener Werkzeuge für die Rasterverarbeitung bereitstellt, um eine einfache Klassifizierung unter Berücksichtigung eines korrekten Workflows durchzuführen. HINWEIS: In dieser Studie werden zwei kostenlose Open-Source-Tools verwendet: Q-GIS 3.1428 kombiniert mit Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). Das SCP-Plugin29 ermöglicht die halbautomatische Klassifizierung von Fernerkundungsbildern und bietet ein komplettes Toolset für den Download von kostenlosen Bildern, die Vorverarbeitung, die Nachbearbeitung und die Rasterberechnung.</li>
		<li>Verarbeiten Sie kalibrierte Daten zur Berechnung multispektraler Indizes. In der Regel wird diese Aktion mit einem Raster-Rechnerwerkzeug ausgeführt. Die Berechnung eines multispektralen Index definiert eine Korrelation zwischen verschiedenen Bändern/Layern, die dadurch einen neuen Layer generiert, der auf einer GIS-Plattform verwaltet werden könnte. Ausgehend von Sentinel und Landsat Operational Land Imager Sensor (OLI) ist es beispielsweise möglich, multispektrale Indizes wie den Normalized Difference Vegetation Index (NDVI) zu berechnen. Der Vegetationsindex wird dann verwendet, um den Chlorophyllgehalt30,31zu schätzen.</li>
		<li>Analysieren Sie die Ergebnisse der Schätzung des Chlorophyllgehaltsindex, der wie in falschen thematischen Karten dargestellt wird, und definieren Sie kritische Gebiete mit hoher Chlorophyllkonzentration. In dieser Studie wird eine Chlorophyll-a-Karte unter Verwendung des Datensatzes des MODIS-Sensors32erstellt, der auf Terra- und Aqua-Satellitenplattformen montiert ist. Die Probenahmestellen werden lokalisiert, wo abnormale Werte registriert werden. HINWEIS: Die Algenblütenflagge (die jeden spezifischen Punkt definiert) wird im Fernerkundungsbereich angehoben, wenn die Chl-a-Konzentration 20 mg/L33überschreitet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Geführte Probenahmen
HINWEIS: Die Auswahl der Probenahmestellen wird durch die Analyse von Fern- / proximalen Erfassungsschichten bestimmt, die es ermöglicht, Flecken in großen Küstengebieten auszuwählen. Da die Probenahme aufgrund der Toxizität von Microcystinen für die Anwender gefährlich sein könnte, sind Sicherheitsprobenahmeverfahren erforderlich. Insbesondere wird es benötigt, um die Bediener vor Aerosolinhalation und Hautkontakt zu schützen. Führen Sie dann eine Probenahme nach dem unten beschriebenen Verfahren durch.
<ol><li>Tragen Sie eine Schutzbrille, eine FFP2-Maske, um das Einatmen von Aerosolen zu verhindern, und Schutzhandschuhe, um Hautkontakt zu verhindern.</li>
	<li>Sammeln Sie 0,5 L Wasser in dreifacher Ausfertigung an jedem Standort.</li>
	<li>Messen Sie den Salzgehalt für jede Probe mit einem Refraktometer. Legen Sie einen Tropfen der Probe auf das Refraktometer und lesen Sie den Salzgehaltswert in Teilen pro Tausend (ppt - ‰).</li>
	<li>Am Ende der Probenahme zuerst die Hände waschen; Entfernen Sie dann wiederum die Handschuhe, die Maske und die Brille und achten Sie darauf, die Außenfläche der persönlichen Schutzausrüstung nicht zu berühren.</li>
	<li>Tragen Sie die Probe bei Raumtemperatur ins Labor.</li>
</ol>3. Identifizierung von Cyanobakterienarten durch mikroskopische Beobachtungen und taxonomische Identifizierung
<ol><li>Zentrifugieren Sie jede Probe (≈0,5 L) bei 11.200 x g für 5 min.</li>
	<li>Extrahieren Sie Überstände wie folgt: Gießen Sie 500 ml Butanol in jede Probe und übertragen Sie die zu extrahierende Mischung mit einem Trichter in den Trenntrichter. Legen Sie den Trenntrichter aufrecht in die Ringklemme, damit sich beide Schichten trennen können. Die wässrige Phase in einem Erlenmeyerkolben abtropfen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Anschließend die organischen Phasen unter Vakuum konzentrieren und wiegen.</li>
	<li>Sammeln Sie Pellets aus Schritt 3.1 und analysieren Sie sie bei 400- und 1.000-facher Vergrößerung mit einem optischen Mikroskop, das mit einer 18-MP-Digitalkamera für das Mikroskop ausgestattet ist. Suchen Sie nach dem Vorhandensein von Cyanobakterien auf der Grundlage ihrer morphologischen Merkmale: Blaugrüne Farbe, Zellform und Größe ermöglichen es, Cyanobakterien unter anderen Mikroorganismen zu erkennen.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Art durch taxonomische Analyse durch mikroskopische Beobachtung nach dem in Komarék et al. 201434beschriebenen Verfahren. HINWEIS: Ergänzende 16S metagenomische Analysen können durchgeführt werden, um Cyanobakterientaxa3zu identifizieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie ein Aliquot der Pellets mit 10 mL Meerwasser/ Süßwasser BG11 Medium, entsprechend seinem Salzgehalt, für den Anbau.</li>
</ol>4. Identifizierung von Cyanotoxinen
<ol><li>Extraktion von Proben mit organischen Lösungsmitteln<ol>
<li>Jede Pelletprobe in einen Kolben geben und 5 Min mit einem Eisbad beschallen. Dann 50 ml frisches MeOH hinzufügen und vorsichtig schütteln. Filtern Sie die Lösung mit einem Papierfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem runden Bodenkolben. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dann extrahieren Sie die Pellets mit einer Mischung aus MeOH / DCM zweimal (1: 1, 50 ml) und zweimal mit 100% DCM (x2, 50 ml)35. Beschriften Sie jeden Rundkolben als "MeOH-Extrakt", "MeOH/DCM-Extrakt" und "DCM-Extrakt" und konzentrieren Sie ihn unter Vakuum.</li>
		<li>Analysieren Sie jeden organischen Extrakt (MeOH, MeOH/DCM, DCM) mit LC-HRMS/MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LC-HRMS/MS-Analyse<ol>
<li>LC-HRMS und LC-HRMS/MS Probenvorbereitung: Lösen Sie jede Probe mit MeOH ≥ 99,9% auf, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten.</li>
		<li>Analysieren Sie jede Probe mit einem hochauflösenden ESI-Massenspektrometer in Verbindung mit einem HPLC-System (LC-HRMS/MS-System). Arbeiten Sie an der HPLC mit einer 5-μm C18-Säule (100 x 2,10 mm) bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine Gradientenelution mit H2O (ergänzt mit 0,1% HCOOH) und MeOHat 200 μL min-1. Das Gradientenprogramm ist: 10% MeOH für 3 min, 10% bis 100% MeOH für 30 min, 100% MeOH für 7 min. Verwenden Sie MeOH als Steuerung.</li>
		<li>Datenerfassung. Datenerfassung im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA): Die 10 intensivsten Ionen eines Full-Scan-Massenspektrums müssen einer hochauflösenden Tandem-Massenspektrometrie (HRMS/MS) unterzogen werden. Erfassen Sie HRMS/MS-Scans für ausgewählte Ionen mit CID-Fragmentierung, einer Isolationsbreite von 2,0, einer normalisierten Kollisionsenergie von 35, Aktivierung Q von 0,250 und einer Aktivierungszeit von 30 ms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioinformatische Analysen und molekulare Vernetzung<ol>
<li>Analysieren Sie Fragmentierungsmuster für jedes intensive Ion mit MS-spezifischer Software.</li>
		<li>Verwenden Sie MS-Cluster, um die Daten zu clustern (übergeordnete Massentoleranz von 1,0 Da und MS/MS-Fragmentionentoleranz von 0,5 Da). Konsensspektren, die weniger als 2 Spektren enthalten, werden eliminiert.</li>
		<li>Analysieren Sie MS/MS-Daten nach GNPS (Global Natural Products Social36)für molekulare Vernetzung.</li>
		<li>Paarweise vergleichen Konsensspektren und auch mit denen, die in den GNPS-Mass-Ive-Bibliotheken berichtet werden.</li>
		<li>Visualisieren Sie das erhaltene Netzwerk37. HINWEIS: Zur molekularen Vernetzung siehe Sigrist et al. 202038.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3.jpg"> Abbildung 3:FDS-Laborschritte (3-4). Visuelle Darstellung der wichtigsten Tätigkeiten im Labor nach der Probenahme (Schritte 3 und 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

In den letzten Jahren hat unser Team verschiedene Ansätze getestet und validiert, die es ermöglichten, das Vorhandensein von Cyanobakterien und Cyanotoxinen in Gewässern und Muscheln zu entschlüsseln. Die neu entwickelte Strategie stellt das Ergebnis dieser Studien dar. Die optimalen Techniken und Technologien, die zum Umfang der schnellen Erkennung passen, werden unter dem Hut eines einzigartigen Verfahrens gesammelt, das die Wirksamkeit jedes einzelnen Schritts maximiert. Das Zielgebiet, die Bloom-Erweiterung und die Wachstumsphase sind die treibende Kraft bei der Auswahl geeigneter Methoden und Technologien.
Wenn der schnelle Nachweis von Cyanobakterien und Cyanotoxinen im Vordergrund steht, wird die Strategie gestrafft, um die Gesamtzahl auf vier Hauptschritte zu reduzieren: (1) Fernerkundung und proximale Erfassung und Datenanalyse für eine erste Untersuchung, Lokalisierung von Standorten und Definition von Blütenmuster und -erweiterung; (2) Geführte Probenahme; (3) Mikroskopische Beobachtung und taxonomische Analyse; (4) Chemische Analyse und molekulare Vernetzung von LC-MS-Daten zur Entfälschung der Wasserproben und zum schnellen Nachweis von Cyanotoxinen.
In Bezug auf den ersten Schritt: Selbst wenn die Verfügbarkeit von Daten, die von einer vollständigen Kette von Plattformen erfasst werden, die alle Schichten des hierarchischen Überwachungsansatzes abdecken, die beste Lösung wäre, um eine vollständige Vision des analysierten Szenarios wiederhergestellt zu werden, kann oft nur eine Informationsschicht die Gebietserhebungsaktion vorantreiben und sich effektiv auf die Hot Spots konzentrieren, um In-situ-Stichprobenaktionen durchzuführen. Nach den berichteten Erfahrungen, bei denen Daten mit Satelliten, Flugzeugen, Hubschraubern und UAVs erfasst wurden, ist die Lösung, die den Anforderungen der schnellen Erkennungsstrategie vollständig entspricht, die Verwendung der einzigen Satellitenprodukte.
Darüber hinaus restituieren die Informationsschichten, die von Missionen abgeleitet werden, die von Plattformen durchgeführt werden, die in niedrigeren Höhen als Satelliten fliegen (z. B. Flugzeuge, Hubschrauber, UAVs), Informationen mit großer Auflösung, aber diese sind sehr teuer und benötigen auch mehr Zeit, um den vollständigen Erfassungsprozess abzuschließen, der auch die Definition und Genehmigung des Flugplans umfasst.
Nach Auswahl der zu untersuchenden Stellen (Schritt 2) sind analytische/bioinformatische Analysen (Molekulare Vernetzung von LC-MS-Daten) das Werkzeug zur schnellen Enteplikation der Wasserproben und zum schnellen Nachweis von Cyanotoxinen (Schritte 3 und 4). 16S metagenomische Analyse dauert mindestens 2 Wochen Arbeit. Selbst wenn Cyanobakterienarten identifiziert werden, die generisch toxisch sind, wird ihre Toxinproduktion nicht nachgewiesen. Aus dem gleichen Grund reicht die mikroskopische Beobachtung selbst nicht aus, um das Vorhandensein toxischer Cyanobakterien aufzudecken. Natürlich haben MS-Analyse und molekulare Vernetzung einige Einschränkungen; sie sind sehr effektiv, wenn interessante Verbindungen (z. B. Toxine) unter den angewandten Bedingungen gut ionisiert sind, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, um nachgewiesen zu werden. Für den bekannten Cyanobakterientoxinnachweis und die Überwachung stellt die MS-basierte molekulare Vernetzung tatsächlich eine der robusteren und zuverlässigeren Technologien dar.
Daher erweist sich dieser Ansatz als sehr nützlich, wenn ein schneller Nachweis von Cyanobakterien und verwandten Cyanotoxinen erforderlich ist; Darüber hinaus ist die Quantifizierung sowohl der Cyanobakterienblüte als auch des Toxins über Raum und Zeit durch diese Strategie möglich, um die Probleme von Gesundheitsgemeinschaften zu verhindern, die durch große toxische Cyanobakterienblüten entstehen könnten.

Cyanobakterienblüten haben sich in den letzten 15 Jahren weltweit zu einem Umweltproblem entwickelt1,2. Cyanobakterienblüten sind auf das Überwachsen von Mikroorganismen zurückzuführen, die Cyanobakterien genannt werden. Sie sind eine auffällige Gruppe von photosynthetischen Mikroorganismen, die sich angepasst haben, um in einer Vielzahl von Umgebungen zu leben, einschließlich tropischer Gebiete und extrem kalter Gewässer. Sie sind dafür bekannt, große Blüten zu produzieren, die Wasseroberflächen bedecken, insbesondere als Reaktion auf eine massive Anreicherung von Nährstoffen, den sogenannten Eutrophierungsprozess3.
Daher sind Cyanobakterien ausgezeichnete Bioindikatoren für Wasserverschmutzung4,5,6. Sie können auch eine breite Palette von natürlichen Verbindungen mit interessanten pharmakologischen Eigenschaftenherstellen 7,8. Das Umweltproblem im Zusammenhang mit Cyanobakterien sind die Blüten selbst. Blüten können das Sonnenlicht von Unterwassergräsern blockieren, Sauerstoff im Wasser verbrauchen, was zu Fischtötungen führt, Oberflächenabschaum und Gerüche erzeugen und die Filterfütterung von Organismen stören9.
Darüber hinaus und noch schwerwiegender, in einer bestimmten Kombination von Faktoren wie Temperatur, Nährstoffen (Phosphor und Stickstoff), Sonnenlicht (für die Photosynthese) und pH-Wert des Wassers, lösen Cyanobakterienblüten die Toxinproduktion aus; daher werden sie schädlich für Mensch und Tier. Die am besten untersuchte Klasse von Cyanotoxinen wird von den Gattungen Microcystis produziert. Dies sind zyklische Peptide, die unter dem allgemeinen Namen Microcystine (MCs) bekannt sind: Microcystin-LR ist das am meisten untersuchte, um schwere Hepatoxizität zu erzeugen10. Tiere und Menschen können durch die Aufnahme von kontaminiertem Trinkwasser oder Lebensmitteln MCs ausgesetzt sein. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schlug als Leitlinie11einen Mikrocystin-LR-Gesamtwert von 0,001 mg/L vor. Dies hängt jedoch nur mit einer Variante (d.h. MC-LR) von mehr als 100 Mikrocystinen zusammen, die bisher isoliert wurden.
Kombinierte Methoden, über die zuvor berichtet wurde, wie die Fernerkundung mit MALDI-TOF MS-Analyse12,13,14,15, haben sich auf die Konzentrationsdetektion von MCs konzentriert. Die neuesten Methoden verwenden Sensoren mit niedriger Auflösung, die nur große Blütenflächen effektiv erkennen; sie sind auch in der Lage, nur Toxine aufzudecken, für die Standards verfügbar sind. Darüber hinaus sind die meisten dieser Verfahren zeitaufwendig, und Zeit ist ein dramatischer Faktor für die Früherkennung der Blüte, um Sicherheitsprobleme zu vermeiden oder zu minimieren. Die hier vorgeschlagene multidisziplinäre Strategie sieht einen schnellen Nachweis von Cyanobakterienblüte und Cyanotoxinen nach nur 24 h16 vor.
Im Rahmen des Programms muM3 , "Multi-disciplinary, Multi-scale and Multi-parametric Monitoring in the three-dimensional (3D) physical space"17,18, kombiniert eine Fast Detection Strategy (FDS) die Vorteile mehrerer Techniken: 1) Fernerkundung zur Erkennung der Blüte; 2) mikroskopische Beobachtung zum Nachweis von Cyanobakterienarten; und 3) analytische/bioinformatische Analysen, nämlich LC-HRMS-basierte molekulare Vernetzung, um Cyanotoxine nachzuweisen. Die Ergebnisse werden innerhalb von 24 h erzielt.
Der neue Ansatz ist nützlich, um weite Küstengebiete in kurzer Zeit zu überwachen, zahlreiche Probenahmen und Analysen zu vermeiden und die Nachweiszeit und -kosten zu reduzieren. Diese Strategie ist das Ergebnis der Untersuchung und Anwendung verschiedener Ansätze zur Überwachung von Cyanobakterien und ihren Toxinen und kombiniert die Vorteile jedes von ihnen. Insbesondere die Analyse der Ergebnisse, die aus der Verwendung verschiedener Plattformen (Satellit, Flugzeuge, Drohnen) und Sensoren (MODIS, thermisches Infrarot) für die Fernerkundungsanalyse stammen, wie z.B. verschiedener methodischer Ansätze zur Identifizierung von Cyanobakterienspezies (Mikroskop, UV-Vis-Spektroskopie, 16S-Analyse) und Toxinen (LC-MS-Analyse, molekulare Vernetzung), ermöglichte die Auswahl der am besten geeigneten Methode sowohl für die spezifischen als auch für die allgemeinen Zwecke. Die neue Methodik wurde in nachfolgenden Überwachungskampagnen an den Küsten Kampaniens (Italien) im Rahmen des Überwachungsprogramms der Umweltschutzbehörde Kampaniens erexperimentiert und validiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3.jpg"> Abbildung 1: FDS-Strategie. Eine Übersicht über die Schnellnachweisstrategie für Cyanobakterien und Cyanotoxine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>10X Vitaminmischung</td><td></td><td></td><td>Nikotinsäure 100 mg/100 ml; PABA 10 mg/100 ml; Biotin 1 mg/100 ml; Thiamin 200 mg/100 ml; B12 1 mg/100 ml; Folsäure 1 mg/100 ml; i-Inositol 1 mg/100 ml; Ca-Pantothenat 100 mg/100 mL</td></tr><tr><td>1-BuOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33065.2.5L-R</td><td></td></tr><tr><td>BG11 Stammlösung</td><td></td><td></td><td>Na2EDTA 20 mg/L; Eisenammoniumcitrat 120 mg/L; Zitronensäure & Middot; 1H2O 120 mg/L; CaCl2&middot; 2H2O 700 mg/L, MgSO4&middot; 7H2O 1,5 g/L, K2HPO4&middot; 3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4&middot; 6H2O (0,1 mM Lagerbestand) 5 mL; Na2SeO4 (0,1 mM Lagerbestand) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hermle</td><td>Z36HK</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Honeywell</td><td>32211.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>34877.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kinetex C18 cloumn</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap XL hochauflösendes ESI-Massenspektrometer, gekoppelt mit einem U3000 HPLC-System</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Honeywell</td><td>32213.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, ausgestattet mit einer OMAX 18 MP CMOS-Kamera&nbsp;</td><td>Optech</td><td>Biostar B3</td><td></td></tr><tr><td>Multiband-Kamera</td><td>Intergraph DMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitschs Lösung</td><td></td><td></td><td>H3BO3 0,5 g/L MnSO4&middot; H2O 2,28 g/L ZnSO4&middot; 7H2O 0,5 g/L CuSO4&middot; 5H2O 0,025 g/L COCl2&middot; 6H2O 0,135 g/L Na2MoO4&middot; 2H2O 0,025 g/L</td></tr><tr><td>Refraktomer mr 100 ATC</td><td>AQL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWBG11 Medium</td><td></td><td></td><td>BG11 Stammlösung 50 mL/L; Sofortiger Ozean 33 g/L; Wasser 950 mL/L 10X; Vitaminmischung 100 & Mikro; L/L</td></tr></tbody></table>

früherkennung von cyanobakterienblüten und assoziierten cyanotoxinen mit fast detection strategy

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Der schnelle Nachweis von Cyanobakterien und Cyanotoxinen wird mit einer Fast Detection Strategy (FDS) erreicht. Nur 24 Stunden sind erforderlich, um das Vorhandensein von Cyanobakterien und verwandten Cyanotoxinen in Wasserproben und in einer organischen Matrix wie Muschelextrakten zu entschlüsseln. FDS kombiniert Fern-/Proximalsensortechniken mit analytischen/bioinformatischen Analysen. Die Auswahl der Probenahmestellen wird durch multidisziplinäre, multiskalige und multiparametrische Überwachung in einem dreidimensionalen physischen Raum, einschließlich Fernerkundung, ausgewählt. Die mikroskopische Beobachtung und taxonomische Analyse der Proben wird im Labor durchgeführt, was die Identifizierung von Cyanobakterienarten ermöglicht. Die Proben werden dann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert und mit LC-MS/MS verarbeitet. Die von MS/MS erhaltenen Daten werden mit einem bioinformatischen Ansatz unter Verwendung der Online-Plattform Global Natural Products Social (GNPS) analysiert, um ein Netzwerk von Molekülen zu schaffen. Diese Netzwerke werden analysiert, um Toxine zu erkennen und zu identifizieren, wobei Daten der fragmentierten Spektren, die durch Massenspektrometrie erhalten wurden, mit der GNPS-Bibliothek verglichen werden. Dies ermöglicht den Nachweis bekannter Toxine und unbekannter Analoga, die im selben molekularen Netzwerk verwandt erscheinen.

In einer ersten Studie3wurden im Sommer 2015 vier anthropogen beeinflusste Standorte entlang der Küste Kampaniens in SW Italien mit satellitengestütztem Landsat 8 und Flugzeugen beobachtet. Der Operation Landsat 8 Land Imager Sensor (OLI) und die Multispektralkamera des Flugzeugs ermöglichten es, NDWI-Bilder (Normalized Difference Water Index) für die Gebiete zu erstellen, um das Vorhandensein von Cyanobakteriengemeinschaften aufzudecken. Die Zusammensetzung der Cyanobakteriengemeinschaft wurde durch spektralphotometrische Analysen zum Nachweis des Cyanobakterienpigments Phycocyanin (PC) bestimmt. Dann erlaubte die ergänzende 16S-Metagenomanalyse, Cyanobakterientaxa zu identifizieren. Die vereinfachte multispektrale Bildindizierung und -klassifizierung durch Satelliten-/Hubarbeitsbühnen in Kombination mit metagenomischen Analysen war wirksam, um das Vorhandensein von Cyanobakterien aus Gattungen mit starken eutrophen Erkrankungen (wie Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.) in einem frühen Stadium der Blüte nachzuweisen.
In einer zweiten Studie14wurde der FDS-Ansatz im Frühjahr/Sommer 2017 getestet. Satellitendaten wurden als einzige Fernerkundungsebene verwendet. Im Detail ermöglichten die daten des MODerate Image Spectroradiometer (MODIS)-Sensors, der auf den Satellitenplattformen Terra und Aqua montiert war, die Quantifizierung von Chlorophyll-a (Chl-a) in den Gewässern entlang der Küste Kampaniens und trieben die Wahl von zehn Probenahmestellen voran. Die Proben wurden im Labor durch mikroskopische Beobachtung und taxonomische Identifizierung verarbeitet und dann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert. Organische Extrakte wurden durch LC-MS-MS-Analyse verarbeitet. Die von MS-MS erhaltenen Daten wurden mit einem bioinformatischen Ansatz analysiert, wobei die GNPS-Plattform verwendet wurde, um ein Netzwerk von Molekülen zu erstellen. Das Netzwerk wurde analysiert, um Toxine zu erkennen und zu identifizieren, wobei Daten der fragmentierten Spektren, die durch Massenspektrometrie erhalten wurden, mit der GNPS-Bibliothek verglichen wurden. Dies ermöglichte den Nachweis bekannter Toxine und unbekannter Analoga, die im selben molekularen Netzwerk verwandt erscheinen. Insbesondere wurde Lyngbyatoxin A, ein lipophiles Dermatotoxin, in allen Wasserproben und Muschelproben nachgewiesen; Im Lyngbyatoxin-A-Molekülcluster waren auch Knoten vorhanden, die mit keiner bekannten Verbindung der Lyngbyatoxin-Familie verwandt waren, was auf das Vorhandensein unbekannter Lyngbyatoxin-Analoga hindeutet. In den Proben wurden keine Mikrocystine und andere Toxine nachgewiesen. Alle Ergebnisse wurden innerhalb von 24 Arbeitsstunden erzielt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3.jpg"> Abbildung 4: FDS-repräsentative Ergebnisse. Ein Beispiel für die Anwendung der FDS-Strategie an der Küste Kampaniens (Italien). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Eine schnell-multidisziplinäre Strategie zur Früherkennung von Cyanobakterienblüten und assoziierten Cyanotoxinen wird hier beschrieben. Es ermöglicht den Nachweis von Cyanobakterien und verwandten Cyanotoxinen in Wasserproben und in organischen Matrizen, wie z.B. Muschelproben, in 24 h.

Früherkennung von Cyanobakterienblüten und assoziierten Cyanotoxinen mit Fast Detection Strategy

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

Die schnelle Nachweisstrategie ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Cyanobakterienblüten und verwandten Cyanotoxinen in den Wasserproben, entweder in dieser organischen Matrix, wie Muscheln und anderen Fischprodukten. Cyanobakterienblüten sind auf das Überwachsen von Cyanobakterien zurückzuführen, die in jeder Art von Umgebung leben können. Und sie haben sich in den letzten 15 Jahren weltweit zu einem Umweltproblem entwickelt.Da die Anzahl der schädlichen Cyanobakterienblüten in den letzten Jahren zugenommen hat, ist die Notwendigkeit der Früherkennung, die für die Bekämpfung von Blüte und toxischer Ausbreitung von entscheidender Bedeutung ist, dringender geworden. Unsere First-Direction-Strategie kombiniert technische Fern- und Proximalsensorik mit der laborchemischen und bioinformatischen Analyse in einem einzigartigen integrierten Workflow. Der gesamte Prozess ist sicher.Es werden geeignete Sicherheitsmaßnahmen getroffen, um aerosolinhalieren und Hautkontakt während der Probenahme und Laboranalyse zu verhindern. Für den Datenabruf lokalisieren Sie zunächst das Zielgebiet auf einer globalen Weltkarte und rufen die Daten aus verschiedenen öffentlichen und privaten Fernerkundungsdatensätzen für das Erfassungsdatum ab. Verarbeiten Sie nach dem Abruf die Rohdaten, berechnen Sie die multispektralen Indizes und klassifizieren Sie die resultierenden Informationen.Definieren Sie dann die Probenahmestellen auf der generierten thematischen Karte. Für die Probenentnahme transportieren Sie die Ausrüstung zur ausgewählten Probenahmestelle im mobilen Labor und planen die Drohnenflugroute für die Durchführung einer Makroflächenuntersuchung. Verwenden Sie vor Ort mehrere Drohnen, die mit verschiedenen Nutzlasten ausgestattet sind, um Flugmissionen durchzuführen.Und verwenden Sie das von der Drohne aufgenommene Filmmaterial, um die Anwesenheit und Ausdehnung der Blüte zu validieren und präzise Probenahmestellen zu identifizieren. Legen Sie an der identifizierten Probenahmestelle die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an und entnehmen Sie drei 500-Milliliter-Wasserproben von jedem Standort. Messen Sie mehrere Umweltparameter wie die Luft- und Wassertemperatur sowie den pH-Wert und den Salzgehalt des Standorts.Anschließend lagern Sie die gesammelten Proben im mobilen Labor für den Transport zum Universitätslabor. Bereiten Sie Objektträger vor und screenen Sie die Proben mit dem mobilen Labormikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, um eine mikroskopische taxonomische Analyse und Identifizierung der in den Proben vorhandenen Arten auf der Grundlage ihrer blaugrünen Farbe, Zellform und Größe der Pellets zu ermöglichen. Sobald die in den Proben gesammelten Cyanobakterienarten identifiziert wurden, zentrifugieren Sie im Universitätslabor die Proben und übertragen Sie jeden Überstand in einen neuen Behälter, ohne die Probenpellets zu stören.Fügen Sie 500 Milliliter Butanol zu jedem Probenüberstand hinzu und übertragen Sie jede zu extrahierende Lösung in einen Trenntrichter. Nach dem Schütteln und Aufrechtstellen der Trichter in einzelne Ringklemmen lassen Sie die wässrigen Phasen in einzelne Erlenmeyerkolben abfließen. Nachdem Sie die Schichttrennung dreimal wiederholt haben, konzentrieren Sie die organischen Phasen unter Vakuum und wiegen Sie sie.Für die Probenextraktion mit organischen Lösungsmitteln fügen Sie jedem Probenpellet 50 Milliliter frisches Methanol hinzu und beschallen die Proben in einem Eisbad. Nach fünf Minuten 50 Milliliter frisches Methanol zu jeder Probe geben und den Kolben vorsichtig schütteln, bevor die Lösungen durch einzelne Filterpapierstücke filtriert und die Filtrate in Rundkolben gesammelt werden. Nachdem Sie jede Probe zwei weitere Male gefiltert haben, wie gerade gezeigt, analysieren Sie die Probenextrakte mittels Flüssigkeitschromatographie und hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie nach Standardprotokollen.Generieren Sie dann ein molekulares Netzwerk mit der globalen sozialen Plattform für Naturprodukte und verwenden Sie die geeigneten Werkzeuge, um die resultierenden Netzwerk- und Tandem-Massenspektrometriedaten zu analysieren, um alle Toxine zu identifizieren, die in den gesammelten Proben vorhanden sind. Die vorgeschlagene Strategie wurde durch die Ergebnisse des Küstenüberwachungsprogramms bestätigt, das von 2015 bis 2021 in der Region Kampanien in Süditalien aktiv war. Es wurde ein visueller Workflow generiert, der die Techniken mit den produzierten Ergebnissen verknüpft.Bei den anschließenden Monitoring-Kampagnen wurde jeder Schritt mit dem Ziel einer schnellen Erkennung optimiert. Die Optimierung des Fernerkundungs-Workflows ermöglichte eine Reduzierung der Anzahl der Plattformen und Missionen bei gleichzeitiger Verbesserung des generierten Produktniveaus. Zum Beispiel erleichtert diese schnelle Erkennungsstrategie den Übergang von der Verwendung mehrerer verschiedener Flugplattformen zu satelliten- und drohnengestützten Plattformen.Und von der Verwendung mehrerer verschiedener multispektraler spezialisierter Indizes bis hin zu den informativeren Chlorophyll- und normalisierten Differenzvegetationsindex-themenkarten. Parallel dazu wurde der Workflow von einer 16-S-Metogenomanalyse auf die mikroskopische Beobachtung nur zur Bestimmung der Cyanobakteriengemeinschaft reduziert. Und der neue chemische Workflow nutzt LCMS-basierte molekulare Vernetzung für einen schnellen und genauen Cyanotoxin-Nachweis.Diese Strategie ermöglicht die Untersuchung von Cyanobakterien als Bioindikator für die Verschmutzung, insbesondere in Gebieten, in denen das Vorhandensein der Blüte mit Eutrophierungsprozessen zusammenhängt und durch anthropogenen Druck genutzt wird. Diese multidisziplinäre Strategie erfordert die Kombination verschiedener Techniken, Technologien und Fachkenntnisse in einem einzigartigen Workflow für ihre erfolgreiche Umsetzung. Die schnelle Erkennungsstrategie ist nützlich, um gesundheitlichen Problemen aufgrund schädlicher Cyanobakterienblüten vorzubeugen und große Flächen in kurzer Zeit zu überwachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Quelle: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Methode zur Unterscheidung von lebenden und toten Microcystis aeruginosa-Zellen durch die Kombination der Fluoreszenzsondenmarkierung mit der durchflusszytometrischen Analyse der Phycocyanin-Autofluoreszenz und des Sondensignals.

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