Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Dieses Protokoll bietet experimentelle Einstellungen zur Durchführung kontrollierbarer 2D- und 3D-Co-Kulturen in Mikrogeräten, um Tumor-Immun-Zell-Crosstalks zu visualisieren und zu überwachen und die Auswirkungen von Krebsbehandlungen zu analysieren. Diese Technologie bietet eine einfache Visualisierung der Rekrutierung und Interaktion von Immunzellen in Echtzeit und kann für Proben von Menschen und Patienten eingesetzt werden. Es ist mit den meisten modernen Mikroskopien kompatibel.

Francesco Noto, Doktorand an der Abteilung für Onkologie und Molekulare Medizin des Istituto Superiore di Sanita, sowie Nicoleta Manduca und Esther Maccafeo, Doktorandinnen an der Università Cattolica del Sacro Cuore, Abteilung für Translationale Medizin und Chirurgie, demonstrieren das Verfahren. Die Späne werden zuvor in einem Plasmareiniger oder einer reaktiven Eisenätzmaschine im Reinraum plasmaaktiviert. Maus-Milz-Zellen und eine Tumorzelllinie werden hier verwendet, um die im Text beschriebenen Protokolle nachzuahmen.

Ziehen Sie vor dem Laden der Zellenaufhängungen Medien aus allen sechs Behältern ab. Anschließend langsam 1 x 10 bis 5. Tumorzellen resuspendiert in 10 bis 50 Mikroliter Nährmedium in das obere linke Reservoir und die untere Vertiefung laden. Auf der rechten Seite 1 x 10 bis 6. schwimmende Immunzellen, die in 50 Mikrolitern Wachstumsmedium resuspendiert sind, vorsichtig in zwei Vertiefungen pipettieren.

Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, füllen Sie alle sechs Reservoirs jedes Chips mit bis zu 100 bis 150 Mikrolitern Wachstumsmedium und überprüfen Sie, ob die Zellen in jedem Kulturkompartiment korrekt verteilt wurden. Inkubieren Sie den Chip eine Stunde lang, damit sich das System vor der Zeitrafferaufnahme stabilisieren kann. Für die Bildgebung lebender Zellen montieren Sie das Tumorimmun auf der Chipplatte auf dem Mikroskoptisch.

Passen Sie die Einstellung des Erfassungs-Workflows in der Benutzeroberfläche der Mikroskop-Software an, z. B. in der Incucyte-Software für die Analyse lebender Zellen. Wählen Sie die Beobachtungsfenster, die optimale Bildrate und die Zeitdauer aus, abhängig von den geeigneten Parametern für das Experiment und die untersuchten Zelltypen. Stellen Sie die Zellen für den entsprechenden Versuchszeitraum dar.

Bereiten Sie zwei Aliquote von Matrigel, verdünnt mit einem Medium, das ein Arzneimittel oder eine Kombination von Arzneimitteln enthält, für die beiden Versuchsbedingungen unter Verwendung von kalten Spitzen vor. Lebendkompatible, mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbte Tumorzellen, die in Matrixlösung auf Eis suspendiert sind, werden sanft pipettiert, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erhalten. Mit der Chipplatte auf einem Kühlblock oder auf einem Korb mit Eis wird die medikamentös behandelte Tumorzellmatrixlösung langsam mit kalten 10-Mikroliter-Mikropipettenspitzen in die linken und rechten Gelanschlüsse injiziert.

Üben Sie leichten Druck aus, um die Matrixlösung von einer Seite des Kanals zur anderen zu schieben. Wenn alle Tumorzellen geladen sind, stellen Sie das Gerät für 30 Minuten in aufrechter Position in den Inkubator. Am Ende der Inkubation, sobald die Matrixgelierung abgeschlossen ist, füllen Sie die Medienkanäle aller sechs Reservoirs mit 50 Mikrolitern Nährmedium.

Überprüfen Sie die Integrität des polymerisierten Gels und die Verteilung der Tumorzellen unter dem Mikroskop. Legen Sie dann die Chips in einen Inkubator, bis die Vorbereitung der Immunzellen abgeschlossen ist. Saugen Sie nach der Inkubation das Medium aus jeder Vertiefung ab.

Platzieren Sie die Spitze in der Nähe des Einlasses des mittleren Mediumkanals und injizieren Sie mit mäßigem Druck vorsichtig 10 Mikroliter 10 in die 6. Immunzellen, die mit einem kontrastierenden Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Injizieren Sie 50 bis 100 Mikroliter des Mediums in jede der vier Vertiefungen der seitlichen Kanäle, 40 bis 90 Mikroliter des Mediums in die obere zentrale Vertiefung und 50 bis 100 Mikroliter des Mediums in die untere zentrale Vertiefung. Wenn alle Vertiefungen beladen sind, verwenden Sie ein Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Verteilung der Immunzellen auf die zentrale Kammer beschränkt geblieben ist.

Platzieren Sie das Gerät dann vorsichtig auf einer ebenen Fläche im Zellkultur-Inkubator, bis die Bildgebung erfolgt. Um das Ausmaß der fluoreszenzgefärbten lebenden Immunzellen zu berechnen, die die Tumorkompartimente infiltrieren, bilden Sie das Gerät zu bestimmten Zeitpunkten von Interesse durch Fluoreszenzmikroskopie ab und stellen Sie die entsprechenden Kameraparameter in der Mikroskop-Bildgebungssoftware ein, z. B. Nikon NIS-Elements. Stellen Sie auch die Parameter für markierte Immunzellen ein.

Die Bewegung von Leukozyten durch entsprechend gebaute Mikrokanalbrücken in der mikrofluidischen Plattform zu ihren Zielzellen kann durch Videomikroskopie verfolgt werden. In dieser Tracking-Analyse wurden einzelne PBMCs mit sterbenden Doxorubicin-behandelten oder lebenden PBS-behandelten Krebszellen konfrontiert. Relevante Chemotaxis-Werte und Migrationsdiagramme wurden automatisch generiert, und es wurde ein anderes Migrationsprofil für die Immunzellen beobachtet, wenn sie zusammen mit Brustkrebszellen beladen wurden, die Doxorubicin oder PBS ausgesetzt waren.

Wenn die PBMCs mit apoptotischen Krebszellen konfrontiert wurden, überquerten sie Mikrokanäle in Richtung der sterbenden und toten Zellen, aber nicht zu lebenden, unbehandelten Zellen. Ein Teil der Leukozyten mit zunehmender Dichte über 24 bis 48 Stunden zeigte Langzeitkontakte mit Doxo-behandelten Krebszellen. In dieser Analyse wurde ein neuartiges immunkompetentes 3D-Tumormodell verwendet, um die Rekrutierung von Immunzellen als Reaktion auf Krebskombinationen epigenetischer Medikamente zu quantifizieren.

Rotfarbstoffmarkierte PBMCs wurden dann homogen in der zentralen Fluidkammer verteilt. Die Fähigkeit der beiden Tumormassen, die PBMCs anzuziehen, wurde dann verglichen, wobei die PBMCs in diesem Experiment robust in den rechten Mikrokanal rekrutiert wurden. Mischen Sie für das 3D-Modell die Lösung mit Hydrogel und Zellen auf Eis, um Blasen und Vorpolymerisation zu vermeiden.

Injizieren Sie es langsam ohne übermäßigen Druck. Passen Sie die Polymerisationsschritte an die verwendete Matrix an. Lebend-/Totzell-Assays und Zytokin-Sekretionsprofilierung aus Überständen können implementiert werden.

Immunfluoreszenz für die konfokale Bildgebung kann zur Klassifizierung von Immunsubtypen und zur Expression von Markern für Aktivierung und Erschöpfungsreifung durchgeführt werden.