Name: Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die Optimierung von Mikrokristallisation für serielle Kristallographie mit Endothiapepsin. Dieses Protokoll zeigt die zuverlässige Herstellung mikrokristalliner Proben für strukturbiologische Analysen.

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Dieses Projekt wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 701647 gefördert. Vielen Dank für die Hilfe und Unterstützung der Beamline-Wissenschaftler an der Lichtquelle Schweiz X10SA-PXII.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die vorgestellte Methode zeigt, wie die Kristallisation von Endothiapepsin von großen Kristallen (≥ 100 μm längster Dimension), die in 96-Well-Screens mit dünner Matrix gezüchtet wurden, zu Mikrokristallen, die in Zentrifugenröhrchen (300 μl Volumen) gezüchtet wurden, per Batch optimiert werden kann. Die Idee hinter dem Protokoll ist, dass die Schritte zur Optimierung von Endothiapepsin auch für andere Proteine genutzt werden könnten. Letztendlich wird das Problem der Erzeugung großer Mengen (>100 μL) von Mikrokristallen (10-20 μm) für serielle Kristallographie-Experimente an XFELs und Synchrotrons gelöst.
Das Protokoll unterteilt die Aufgabe der großvolumigen Mikrokristallisation in drei Schritte: (1) Optimierung der Kristallmorphologie, (2) Übergang zum Batch und (3) Skalierung. In Schritt 1 sollte die Bandbreite der Kristallformen, die ein Protein erzeugen kann, in Dampfdiffusionsplatten untersucht werden. Das Ziel sollten Bedingungen sein, die zu einzelnen, kastenförmigen Kristallen führen, die sich bis zur erforderlichen Auflösung beugen. In Schritt 2 können dann ausgewählte Bedingungen von Dampfdiffusion in Charge umgewandelt werden. Hier ist das Optimierungskriterium die Kristallwachstumszeit und das Finden von Bedingungen, die innerhalb von 24 h zu Proteinkristallen führen. Es kann auch ein Morphogramm erstellt werden, das dem Experimentator eine Vorstellung von der Lage der Löslichkeitslinie und der Grenzen der Nukleationszone gibt. Dieses Morphogramm ist in Schritt 3, Skalierung, von großem Nutzen. Das Morphogramm gibt Aufschluss darüber, ob die Nukleation allein Xn erhöhen und Xs senken kann. Mit zunehmendem Volumen des Experiments können Xn und Xs kontinuierlich als Schlüsselkriterien für den Skalierungserfolg bewertet werden.
Im Fall von Endothiapepsin wurde in Schritt 1 eine möglicherweise bisher unbekannte Kristallmorphologie für Endothiapepsin zutage gefördert. Diese Morphologie hatte die gleiche Raumgruppe wie die zuvor beschriebenen, aber, was für die serielle Kristallographie wichtig ist, eine eher kastenartige Form. Einkristalle schienen auch aus einzelnen Nukleationspunkten zu wachsen, im Gegensatz zu den Fächern, die unter anderen Bedingungen entstanden (Abbildung 4). Für die gewählte Bedingung war Schritt 2 bereits teilweise erfüllt, da das Kristallwachstum in < 24 h erfolgte. Das Morphogramm deutete darauf hin, dass sowohl ein Straight- als auch ein Seeded-Batch-Protokoll bei der Skalierung in Schritt 3 erfolgreich sein könnte. Die anfängliche Skalierung in reiner Charge schuf eine Bedingung, die Kristalle mit einemX-n - undX-s-Bereich von 3,6 ± 1,2 x 106 Kristallen ·mL-1 bzw. 42 ± 4,1 μm erzeugte. Diese Kristalle waren zwar für einige serielle Kristallographie-Experimente akzeptabel, wurden aber als zu groß erachtet. Daher wurden zusätzliche Optimierungen vorgenommen. Das endgültige Protokoll erzeugte Kristalle mit einem Konzentrations- und Größenbereich von 3,1 x 10,6 Kristallen·mL-1 bzw. 15 ± 3,9 μm. Das war für die geplanten Experimente mehr als ideal.
Die Methode konzentriert sich auf die Umwandlung von "löslichen" Proteinkristallen, die in Dampfdiffusionsplatten gezüchtet wurden, in Batch. Der Grund für diese Fokussierung ist, dass die überwiegende Mehrheit der löslichen Proteinkristalle durch Dampfdiffusion26 gezüchtet wird. Die vorgestellten Konzepte ließen sich aber auch auf lösliche Proteinkristalle anwenden, die mit anderen Methoden, wie z.B. Micro-Batch, gezüchtet wurden. Die Konzepte können auch auf Membranproteinkristalle anwendbar sein, die in LCP gezüchtet wurden. da es sich auch hier um einen Batch-Kristallisationsprozess handelt.
Ein Schlüsselaspekt des Protokolls ist der Prozess, die Bedingungen von Kristallen, die in Dampfdiffusionsplatten gezüchtet werden, so umzuwandeln, dass sie in Batches gezüchtet werden können. Für diese Transformation verwendet die Methode das von Beale et al. (2019)26 vorgeschlagene Kriterium. Kristalle, die im Batch-Verfahren gezüchtet werden, bilden sich auch in Dampfdiffusionsplatten schnell (< 24 h). Dieses Kriterium ist eine Näherung, die auf der Geschwindigkeit der Dampfdiffusionstropfenäquilibrierung basiert, und gilt am ehesten für PEG-basierte Fällungsmittelbedingungen. Die Kristallisationsbedingungen enthalten jedoch eine Vielzahl von Verbindungen, die die Äquilibrierungszeit beeinflussen. Die Äquilibrierung von salzbasierten Kristallisationsbedingungen, z.B. hochkonzentriertem Ammoniumchlorid, kann in 1-2 Tagen erfolgen. Daher ist das 24-Stunden-Kriterium für salzbasierte Bedingungen möglicherweise nicht zutreffend. Salzbasierte Bedingungen können auch komplexere Phasendiagramme26,30 aufweisen, die möglicherweise nicht dem in diesem Protokoll vorgestellten Archetyp entsprechen. Eine Reduzierung des Zeitkriteriums für salzbasierte Bedingungen auf 12 oder 6 h kann erforderlich sein, wenn sich eine Skalierung auf größere Volumina als unmöglich erweist.
Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist ihre scheinbare Komplexität. Das Protokoll, das befolgt wurde, um die Mikrokristallisation von Endothiapepsin zu optimieren, änderte den ursprünglichen Zustand des dünnen Matrix-Screens relativ wenig. Der erste Treffer, der im PACT-Screening beobachtet wurde, war 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 MMgCl2 und 20 % (w/v) PEG 6.000. Der endgültige skalierte Kristallisationspuffer betrug 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 MMgCl2 und 40 % (w/v) PEG 6.000. Es ist auch sehr gut möglich, dass die Änderung des Puffers von HEPES zu Tris-HCl und dieMgCl2-Konzentration wenig zum Erfolg des Prozesses beigetragen haben. Die Erhöhung der PEG 6.000-Konzentration war die einzige Optimierung, die ganz einfach hätte erreicht werden können.
Diese Einschätzung ist aber auch zu einfach. Es ignoriert nicht nur die Probleme, die bei der Skalierung auftreten (d. h . die Verwendung von Saatgut und das Abschrecken), sondern auch die Tatsache, dass es keine Garantie dafür gibt, dass sich auch das nächste als einfach erweisen wird, nur weil sich dieses Protein als einfach erwiesen hat. Die im Protokoll empfohlenen Schritte wurden entwickelt, weil die Optimierung der Skalierung von Proteinkristallisationsvolumina sehr proteinteuer sein kann. In den sieben gezeigten Studien zur Endothiapepsin-Skalierung wurden 100 mg Protein konsumiert. Zwar wurden einige dieser Schritte durchgeführt, um ihre Konsequenzen im Lichte dieses Protokolls aufzuzeigen. Trotzdem können 100 mg eines Proteins plus möglicherweise weitere 50 mg für Protein, das während eines Experiments verbraucht wird (Tabelle 1), eine erhebliche Investition in Zeit oder Geld sein.
Glücklicherweise ist nicht klar, ob diese Masse an benötigter Probe bei allen Proteinen allgegenwärtig ist. Endothiapepsin war gut löslich und erforderte daher eine hohe Proteinkonzentration, um eine Übersättigung zu erreichen. In anderen (derzeit in der Optimierung) kann eine Übersättigung bei 10 oder sogar 5 mg/ml erreicht werden. Solche Variablen sind proteinspezifisch und müssen berücksichtigt werden, wenn sie auftreten.
Zu den weiteren Einschränkungen der Methode gehört die Abhängigkeit von komplexen Geräten wie Liquid-Handling-Robotern für die Sieb- und Plattenerstellung und Imagern zur automatischen Belichtung von Platten bei Bedarf. Es wurden alternative Routinen angeboten, um den Bedarf an einigen dieser Geräte zu begrenzen, aber das Protokoll wird ohne sie zeitaufwändiger zu befolgen sein. Das Protokoll schlägt auch vor, die Beugung optimierter Kristalle zu testen. Für Kristallographen, die keinen regelmäßigen Zugang zu einem Synchrotron haben, könnten sich diese Tests als Herausforderung erweisen. Kontrollen bei jedem Schritt sind möglicherweise nicht erforderlich, aber diese Tests werden dringend empfohlen, sobald ein Treffer identifiziert wurde, sowie vor und nach der Skalierung. Nicht-beugende Kristalle an einem XFEL sind leider keine Seltenheit. Vor diesem Hintergrund ist es besser, bei Annahmen über die Kristallbeugung auf Nummer sicher zu gehen.
Letztendlich werden dieses Protokoll und die hier vorgestellten Ergebnisse einen Leitfaden, Ideen und ein Beispiel für diejenigen bieten, die Schwierigkeiten haben, Proben für serielle Kristallographie-Experimente herzustellen. Es bleibt zu hoffen, dass mit der Weiterentwicklung der seriellen Kristallographie der Probenbedarf der Technik so reduziert wird, dass der Bedarf an Protokollen wie diesem verringert wird. Aber auch in diesem Fall werden die hier vorgestellten Strategien für diejenigen nützlich sein, die den Kristallisationsraum ihres Proteins erforschen möchten.

Die makromolekulare Kristallographie bei Raumtemperatur (RT) ist in der Strukturbiologie wieder beliebt. Die Entwicklung von Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Lichtquellen (XFEL) hat die Entwicklung von RT-Probentransportansätzen 1,2,3,4 vorangetrieben, und diese Methoden wurden nun auf die Synchrotrons 5,6,7,8 angewendet. RT-Methoden eröffnen nicht nur die Möglichkeit von experimentellen Pump-Probe-Lösungen 9,10,11,12, sondern es gibt auch immer mehr Hinweise darauf, dass sie alternative Konformationszustände innerhalb der Proteine 13,14,15,16,17 fördern.
Der Hauptgrund, warum Kryomethoden in den späten 1990er Jahren gegenüber RT-Ansätzen an Bedeutung gewannen, war jedoch die Verlangsamung der Strahlenschäden durch Kristalltemperaturen unter dem Gefrierpunkt18. Kryo-Methoden19 ermöglichten die Erfassung eines vollständigen Datensatzes aus einem einzelnen Proteinkristall. Moderne RT-Methoden an XFELs und Synchrotrons lösten das Problem der Schädigung durch einkristalline Strahlung durch die Entwicklung schneller (&gt; 100 Hz) Kristalltransportstrategien 1,2,3,4. Diese Methoden ermöglichen die Sammlung eines vollständigen Datensatzes aus Tausenden von einzeln belichteten Kristallen. Diese RT-Verabreichungsansätze erfordern daher die Herstellung großer Mengen von Lösungen, die homogene Mikrokristalle enthalten (&gt; 100 μl &lt; 50 μm Kristalle). Da Kryo-Methoden jedoch in der Regel nur Einkristalle benötigen, sind Methoden zur Herstellung solcher mikrokristallinen Schlämme derzeit in Proteinkristallographie-Labors nicht allgegenwärtig.
In der Literatur gibt es Beispiele, wie Teile des Mikrokristallisationsoptimierungsverfahrens für serielle Kristallographieproben durchgeführt werden können. Hierbei ist zwischen membranartigen und löslichen Proteinen zu unterscheiden. Protokolle zur Optimierung des Wachstums von Mikromembranproteinkristallen, die in Monoolein (oder einem anderen Lipid) gezüchtet wurden, für die lipidkubische Phase (LCP) wurden gut beschrieben 20,21,22. Es fehlen jedoch Methoden zur Mikrokristallisation löslicher Proteine, einschließlich Membranproteinen, die unter Nicht-LCP-Bedingungen gezüchtet wurden. Frühere Studien konzentrierten sich auf bestimmte Teile des Prozesses, wie z. B. das Mikrokristall-Screening 23,24, die Verbesserung der Keimbildung24 und die Skalierung mit freier Grenzflächendiffusion 25, jedoch nicht auf eine vollständige Methode.
Kürzlich wurde jedoch ein Verfahren26 beschrieben, das versucht, ein vollständiges Protokoll anzubieten. Wie viele Aspekte der Proteinkristallographie ist sie nicht neu. Viele der vorgeschlagenen Ideen wurden bereits von Rayment (2002)27 beschrieben. Die Methode soll Kristallographen zeigen, wie sie die Umwandlung von einem einzelnen, durch Dampfdiffusion gezüchteten Kristall in eine Batch-Methode durchführen können, um Tausende von Mikrokristallen zu züchten. Die Methode konzentriert sich auf die Dampfdiffusion als gemeinsamen Ausgangspunkt, da 95 % aller Ablagerungen in der Proteindatenbank (PDB) von Kristallen stammen, die in Dampfdiffusionsplatten gezüchtet wurden26. Die Dampfdiffusion ist jedoch nicht die ideale Methode für die Mikrokristallisation26, daher wird eine Methode beschrieben, um die Dampfdiffusion in die Batch-Kristallisation umzuwandeln. Sobald Kristalle in Batches gezüchtet werden können, wird die Skalierung auf größere Volumina praktikabler. Angesichts der Unwägbarkeiten der Proteinkristallisation betonen die Autoren, dass diese Methode nicht ausfallsicher ist. Das Protokoll soll aber zumindest einen Einblick in den "Kristallisationsraum" eines Proteins geben.
Diese Methode stützt sich auf das Phasendiagramm der Proteinkristallisation und darauf, wie das Verständnis dieses Diagramms als Leitfaden für die Optimierung der Mikrokristallisation dienen kann. Ein Proteinphasendiagramm wird üblicherweise als x/y-Diagramm mit Fällmittel- und Proteinkonzentrationen auf der x- bzw. y-Achse dargestellt (Abbildung 1A). Vom Reinwasserpunkt (untere linke Ecke - Abbildung 1A) steigt die Konzentration von Protein und Fällungsmittel an, bis die Löslichkeitslinie erreicht ist. Die Löslichkeitslinie markiert den Punkt der Übersättigung (violette Linie - Abbildung 1A). Wenn ein Protein übersättigt ist, wird die Lösung thermodynamisch instabil und beginnt sich in zwei Phasen zu trennen: "proteinreich" und eine stabile gesättigte Lösung. Diese Trennung kann überall jenseits der Löslichkeitsgrenze stattfinden und ihre Kinetik hängt von den Eigenschaften des Proteins und den Bestandteilen der Lösung ab.
Wenn die Protein- und Fällmittelkonzentrationen zu hoch sind, zersetzt sich das Protein instabil aus der Lösung und führt zu amorphem Niederschlag (rosa Bereich - Abbildung 1A). Es kann jedoch zu einer geordneten Phasentrennung im Nukleationsbereich kommen [siehe Garcia-Ruiz (2003)28 für eine detaillierte Beschreibung] und Kristallnukleanten neigen zur Bildung (grüner Bereich - Abbildung 1A). Durch Keimbildung und Wachstum wird das Protein aus der Lösung entfernt und der Tropfen in die metastabile Region verschoben, wo das Wachstum fortgesetzt werden kann, bis die Löslichkeitslinie erreicht ist [siehe McPherson und Kuznetsov (2014)29 für eine detaillierte Diskussion]. Das Diagramm ist für die überwiegende Mehrheit der Kristallisationsbedingungen eine grobe Vereinfachung30. Unabhängig davon ist das Diagramm jedoch für Mikrokristallographen von großem Nutzen, da die Abbildung des Diagramms die Bestimmung der Löslichkeitslinie und der Kinetik der Keimbildung ermöglicht.
Bei der Erzeugung von Mikrokristallen sind die beiden Faktoren, die während der Kristallisation optimiert werden müssen, die Anzahl der Kristalle (Xn) und ihre mittlere, längste Abmessung (Xs). X n ist proportional zur Anzahl der Nukleationsereignisse (n ) (Gl. 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61896/61896fig01v2.jpg">     Gl. 1
X s ist proportional zur Konzentration des freien Proteins oberhalb der Löslichkeitslinie (Ps) dividiert durch Xn (Gl. 2).
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61896/61896eq02.jpg">     Gl. 2
In einer perfekten Situation würde jedes Nukleationsereignis einen möglichen Kristall ergeben und jeder dieser Kristalle hätte den gleichen Zugang zu dem verfügbaren Protein in Lösung. Abbildung 2 ist eine grafische Darstellung eines Idealszenarios der Beziehung zwischen Xn und Xs. In der Praxis besteht die Hauptkontrolle, die ein Kristallograph über Xn und Xs hat, in der Beeinflussung des Umfangs der Keimbildung oder in der Zugabe von Impfkristallen. Der Mikrokristallograph muss beurteilen, wie Xn so erhöht werden kann, dass sowohl eine geeignete Kristallkonzentration als auch eine geeignete Kristallgröße erzeugt werden können.
Die meisten Kristallisationstechniken erfordern eine "Übergangszeit" (Abbildung 1B). Zum Beispiel ändern sich in einem Dampfdiffusionsexperiment beim Mischen der Protein- und Fällmittellösungen die Konzentrationen beider, wenn sich der Tropfen mit der Well-Lösung ausgleicht. Es ist zu hoffen, dass diese Veränderungen den Tropfen allmählich in die Nukleationszone überführen, in der die Neigung zur Kristallisation zunimmt. Wenn Kristalle zu keimen und zu wachsen beginnen, beginnt die Menge des Proteins in Lösung zu sinken, was die Wahrscheinlichkeit einer weiteren Keimbildung verringert. Das endgültige Ausmaß der Nukleation ist protein- und bedingungsspezifisch und hängt auch von der Eindringtiefe in die Nukleationszone ab. Angesichts der begrenzten Durchdringung der Nukleationszone von Methoden, die einen Übergangsschritt erfordern, wird der Grad der Keimbildung letztendlich auf die Keimbildungsrate an der Grenze zwischen metastabiler und nukleatorischer Region begrenzt sein.
Da es für einen Mikrokristallographen wichtig ist, das Niveau der Keimbildung zu verbessern, ist es wichtig, zu einer Batch-Kristallisationsmethode überzugehen. Batch kann die gesamte Nukleationsregion besser nutzen (Abbildung 1C). Bei der Batch-Methode geht es darum, Protein und Fällungsmittel so miteinander zu vermischen, dass eine übersättigte Lösung entsteht, ohne dass die Komponentenkonzentrationen geändert werden müssen. Die Keimbildung sollte sofort nach dem Mischen möglich sein. Batch-Methoden ermöglichen es daher, theoretisch die gesamte Nukleationszone zu erreichen. Jede Erhöhung der Nukleationskinetik über die Grenze zwischen Metastabilität und Nukleation hinaus kann dann genutzt werden.
Wenn das Basalniveau der Kristallnukleation nicht ausreicht, um ein großes Xn zu erzeugen, können Microseeding-Methoden verwendet werden. Beim Microseeding werden vorgezüchtete Kristalle aufgebrochen, um eine Aufschlämmung aus kristallinen Fragmenten zu erzeugen, die als Gerüst für frisches Kristallwachstum dienen können31,32. Microseeding wird häufig in der seriellen kristallographischen Probenvorbereitung eingesetzt, um Xn zu erhöhen, ohne dass die Kristallnukleation erhöht werden muss (Abbildung 1C).
Der Übergang von der Dampfdiffusion zum Batch kann in einem Phasendiagramm visualisiert werden, indem der experimentelle Ausgangspunkt entweder von den nicht übersättigten oder metastabilen Regionen in die Nukleationszone verschoben wird. Dies kann erreicht werden, indem die Protein- und/oder Fällmittelkonzentrationen und/oder das Verhältnis der beiden innerhalb des Tropfens erhöht werden (Abbildung 1D) und beobachtet wird, unter welchen Bedingungen Kristalle schnell auftreten (&lt; 24 h)26. Eine vollständige Dampfdiffusionstropfenäquilibrierung kann Tage oder Wochen dauern33. Durch die Suche nach Bedingungen, die schnell auftretende Kristalle zeigen, können daher Chargenbedingungen gefunden werden, ohne auf alternative Kristallisations-Screening-Formate wie Mikrobatch34,35,36,37 umsteigen zu müssen.
Sobald die Nukleationszone gefunden wurde, wurde eine Chargenbedingung gefunden und ein Morphogramm - hier ein grobes Phasendiagramm - kann erstellt werden. Das Morphogramm ist von großem Nutzen, wenn Sie überlegen, ob Sie ein Seeded-Batch- oder Straight-Batch-Protokoll verwenden möchten. Durch die Darstellung desXn in Abhängigkeit von der Protein- und Fällmittelkonzentration kann eine Beurteilung der Nukleationskinetik vorgenommen werden26. Wenn X n in der gesamten Nukleationsregion niedrig bleibt, kann es erforderlich sein, Xn groß genug zu machen, um das Kristallwachstum zu begrenzen. Diese Bewertung ist der erste Schritt im Prozess der Skalierung auf größere Volumina (&gt; 100 μl).
Diese Methode wurde so konzipiert, dass sie in den meisten Kristallisationslaboratorien unter Verwendung von Standard-Dampfdiffusionskristallisationsgeräten durchgeführt werden kann. Es wurden auch viele Studien durchgeführt, die Techniken beschreiben, die viele Teile dieses Prozesses erleichtern, falls die Ausrüstung verfügbar ist. Dazu gehören unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS)25,27, die nichtlineare Bildgebung 20,24,25, die Pulverbeugung 20,24,27 und die Elektronenmikroskopie 26 [siehe Cheng et al. (2020)40 für eine schöne Übersicht].
Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine visuelle Demonstration der Methode zum Übergang von der Dampfdiffusionskristallisation mit kleinem Volumen (&lt; 500 nL) zur großvolumigen (&gt; 100 μL) Batch-Kristallisation zu liefern. Endothiapepsin aus Cryphonectria parasitica wurde als Beispielsystem verwendet, um diese Translation zu demonstrieren. Die Art des Experiments und die Probenabgabemethode, für die die Mikrokristalle benötigt werden, beeinflussen den idealenX-s-Ausgang 26. Für Mischexperimente, die eine Zeitauflösung41 von Millisekunden oder gasdynamische virtuelle Düsen42 erfordern, kann ein abschließendes Xs von &lt; 5 μm wünschenswert sein. In diesem Fall bestand das Ziel darin, Proteinkristalle herzustellen, die sich auf etwa 1,5 Å beugen, für ein photonenaktiviertes Pump-Probe-Experiment und unter Verwendung eines Fixed-Target-Delivery-Ansatzes.
Um die Probenanforderungen eines solchen seriellen Kristallographie-Experiments mit Endothiapepsin zu veranschaulichen, zeigt Tabelle 1 die experimentellen Parameter eines hypothetischen Experiments. Die Probeninformationen basieren auf dem unten beschriebenen Protokoll. Angesichts einiger konservativer Schätzungen der Trefferquoten und der Anforderungen an die Datenerhebung ist 50 mg die geschätzte Gesamtprobe des Probenverbrauchs für das gesamte Experiment.
Abbildung 3 zeigt ein Flussdiagramm des gesamten Optimierungsprozesses von der anfänglichen Dampfdiffusionskristallisation mit kleinem Volumen bis hin zur großen Charge. Bei den meisten seriellen Kristallographieprojekten beginnt dieses Protokoll bei Schritt 2: "Übergang zum Batch", da das Zielprotein bereits kristallisiert ist. Schritt 1 wurde jedoch der Vollständigkeit halber aufgenommen und um die Leser an seine Bedeutung zu erinnern. Einen Zustand zu finden, der zu einem gut beugenden, einen, großen Kristall führt, ist der beste Ausgangspunkt für die Mikrokristalloptimierung. In Schritt 2 kann dieser Zustand dann von der Dampfdiffusion bis zur Charge optimiert und ein Morphogramm der Nukleations- und metastabilen Regionen aufgetragen werden. Sobald dies geschehen ist, kann die Skalierung der Chargenbedingung auf größere Volumina in Schritt 3 durchgeführt werden. Am Ende des Flussdiagramms hat ein Kristallograph ein wiederholbares, großvolumiges (&gt; 100 μl) Mikrokristallisations-Batch-Protokoll für Endothiapepsin erstellt. Diese Methode kann dann auf das jeweilige Protein angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Swissci 96-Well 2-Tropfen-Platten</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD11-002</td><td>96-Well-2-Tropfen-Kristallisationsplatte</td></tr><tr><td>Swissci 96-Well 3-Tropfen-Platten</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD11-003</td><td>96-Well-3-Tropfen-Kristallisationsplatte</td></tr><tr><td>Mosquito LCP Liquid-Handling-Roboter</td><td>sptlabtech</td><td>Mosquito LCP</td><td>Kristallisationsroboter</td></tr><tr><td>ClearVue Sheets</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD6-015</td><td>96-Well-Kristallisationsplattendichtungen</td></tr><tr><td>Safe-Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Scaple</td><td>Swan und Morton</td><td>Nr. 3 Skalp und Nr. 3 Griff</td><td>Skalp zum Schneiden von offenen Plattendichtungen</td></tr><tr><td>MS 3 Vortex</td><td>IKA</td><td>3319000</td><td>Vortex zum Mischen von Lösung und Herstellung von Saatgut</td></tr><tr><td>24-Well-XRL-Platte</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD3-11</td><td>24-Well-Hängeplatten</td></tr><tr><td>Röhrchenrevolver/Rotator</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>88881001</td><td>Röhrchenrevolver zum Mischen der Lösung beim</td></tr><tr><td>Skalieren Eppendorf Research plus Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Sortiment an manuellen Pipetten, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Eppendorf Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Auswahl an Spitzengrößen für manuelle Pipetten</td></tr><tr><td>Suparen 600</td><td>Prochem AG</td><td>Suparen 600</td><td>Endothiapepsin Lösung</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245-1KG</td><td>Natriumacetat</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>8382T014</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1kg</td><td>Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>PEG 6.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255-1kg</td><td>PEG 6.000</td></tr><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558-1L</td><td>Ethylenglykol zum Schutz der Kristalle</td></tr><tr><td>PACT Premier HT Sieb</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-36</td><td>PACT Premier 96-Well-Kristallsieb</td></tr><tr><td>DOW CORNING Hochvakuumfett</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD6-02</td><td>Fett zum Versiegeln von 24-Well-Platten</td></tr><tr><td>Hirschmann 22 x 22 mm Glaser-Abdeckfolien</td><td>Hirschmann</td><td>8000104</td><td>Abdeckfolien zum Versiegeln von 24-Well-Sitzplatten</td></tr><tr><td>Kristallpins</td><td>PSI</td><td>Hergestellt im eigenen Haus</td><td>Dünnschichtträger für Mikrokristalle.</td></tr><tr><td>1-1,3 mm SiLibeads Typ S</td><td>Faust</td><td>6239547</td><td>Glasperlen zur Herstellung von Mikro-Samenstöcken</td></tr><tr><td>Macbook Pro</td><td>Apple</td><td>Macbook Pro</td><td>Computer zur Datenanalyse</td></tr><tr><td>CCP4 Software-Suite</td><td>CCP4</td><td></td><td>Beugungsmuster Datenverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office</td><td>Plotting-Tool für Phasendiagramm</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line-Zählkammer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>02-671-51B</td><td>Werkzeug zur Berechnung der Kristallkonzentration</td></tr><tr><td>PACT Premier</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-29-ECO</td><td>Kristallisationssieb mit dünner Matrix</td></tr><tr>Rock<td>Imager</td><td>Formulatrix</td><td>Rock Imager</td><td>Temperaturgesteuerter Kristallplatten-Speicher und Imager</td></tr><tr><td>Rock MakerWeb</td><td>Formulatrix</td><td>Rock MakerWeb</td><td>Erstellung von Kristallplatten und Bildspeicherung Formulator</td></tr><tr><td>Formulatrix</td><td></td><td>Formulator</td><td>Erstellung von 96-Well-Kristallbildschirmen Liquid-Handling-Roboter</td></tr><tr><td>Leica MZ16 Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16</td><td>Lichtmikroskop</td></tr><tr><td>LAS V4.6</td><td>Leica</td><td>LAS V4.6</td><td>Software für Leica Mikroskope</td></tr><tr><td>Spectra/Por 3,5 kDa Dialyseschläuche</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 Dialysemembran</td><td>3,5 kDa Dialysemembran</td></tr><tr><td>Verschlüsse für Dialyseschläuche</td><td>Spectrumlabs</td><td>Spectra/Por 3 Duniversal Verschlüsse</td><td>Clips zum Abdichten der Dialyseschlauchenden</td></tr><tr><td>Amicon 10 kDa Zentrifugalkonzentrator</td><td>Merck-Millipore</td><td>Amicon Ultra-15 10 kDa Zentrifugalkonzentrator</td><td>10 kDa Zentrifugalfilter</td></tr><tr><td>5810 R Schwenkschaufelzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R Zentrifuge</td><td>Schwenkschaufel-Zentrifuge</td></tr></tbody></table>

optimierung des wachstums von endothiapepsin-kristallen für serielle kristallographie-experimente

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, das die Herstellung großer Volumina (> 100 μl) mikrokristalliner Schlämme erleichtert, die für serielle Kristallographie-Experimente sowohl an Synchrotrons als auch an XFELs geeignet sind. Die Methode basiert auf dem Verständnis des Phasendiagramms von Proteinkristallen und wie dieses Wissen genutzt werden kann. Die Methode gliedert sich in drei Phasen: (1) Optimierung der Kristallmorphologie, (2) Übergang zum Batch und (3) Skalierung. In Stufe 1 geht es darum, gut gebeugte Einkristalle zu finden, die hoffentlich, aber nicht notwendigerweise, in einer würfelartigen Morphologie vorliegen. In Stufe 2 wird die Bedingung der Stufe 1 durch die Kristallwachstumszeit optimiert. Mit dieser Strategie können Kristalle, die durch Dampfdiffusion gezüchtet wurden, in Batch-Kristalle umgewandelt werden. Sobald das Kristallwachstum innerhalb von ca. 24 h erfolgen kann, kann ein Morphogramm des Protein-Fällmittel-Gemisches aufgetragen und als Grundlage für eine Skalierungsstrategie verwendet werden (Stufe 3). Wenn Kristalle in Batches gezüchtet werden können, kann versucht werden, sie zu skalieren, und die Kristallgröße und -konzentration kann optimiert werden, wenn das Volumen erhöht wird. Endothiapepsin wurde als Demonstrationsprotein für dieses Protokoll verwendet. Einige der vorgelegten Entscheidungen sind spezifisch für Endothiapepsin. Es ist jedoch zu hoffen, dass die Art und Weise, wie sie angewendet wurden, zu einer Denkweise über dieses Verfahren anregen wird, die andere an ihre eigenen Projekte anpassen können.

Das Ziel dieses Artikels ist es, dem Betrachter ein solides Verständnis dafür zu vermitteln, wie sein kleinvolumiges Dampfdiffusionsprotokoll für die Züchtung großer, einzelner Proteinkristalle in eine großvolumige Batch-Mikrokristallisationsmethode für die serielle Kristallographie umgewandelt werden kann.

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Serielle Kristallographie-Experimente können eine Herausforderung darstellen. Eine wesentliche Hürde in ihrer Praxis ist die Herstellung mikrokristalliner Proben. Dieses Protokoll zeigt, wie solche Proben zuverlässig erstellt werden können.Diese Methode verwendet Endothiapepsin, um einen Rahmen für die Optimierung großer Kristalle zu schaffen, die in kleinvolumigen Dampfdiffusionsplatten zu großvolumigen mikrokristallinen Schlämmen gezüchtet wurden. Wir können nicht behaupten, dass dieses Protokoll universell erfolgreich sein wird. Wir hoffen jedoch, dass die hier vorgeschlagenen Ideen und Methoden anderen einen experimentellen Rahmen bieten, den sie auf andere Proteine anwenden können.Bereiten Sie zunächst eine 96-Well-Platte mit zwei Tropfen und dem Kristallisationspuffer mit dem Formulatrix-Roboter vor. Mischen Sie mit einem Liquid-Handling-Robotermix 150 Nanoliter frisch aufgetautes Endothiapepsin mit 150 Nanolitern Kristallisationspuffer in jeder Vertiefung. Versiegeln Sie die Platte und lassen Sie die Kristalle 24 Stunden lang im Formulatrix Hotel wachsen.Brechen Sie nach 24 Stunden die Kristalle auf und entfernen Sie sie aus fünf Vertiefungen der 96-Well-Kristallisationsplatte. Geben Sie sie in 250 Mikroliter des Kristallisationspuffers in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in einem Eiskübel. Geben Sie 10 bis 15 Glasperlen von einem Millimeter Größe in das Zentrifugenröhrchen.Wirbeln Sie die Kristalle und Perlen 30 Sekunden lang mit 1000 Umdrehungen pro Minute und legen Sie sie 30 Sekunden lang auf Eis. Die Samen können dann sofort verwendet oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um ein Morphogramm-Experiment durchzuführen, fügen Sie fünf bis 40 %ige Konzentrationen von PEG 6000 mit einem molaren Tris-HCl bei pH sieben und 0,15 molaren Magnesiumchlorid entlang der Plattensäulen eines 96-Well-Gittersiebs mit zwei Tropfen hinzu Reparieren Sie eine sequentielle Verdünnung von Endothiapepsin in 0,1 molaren Natriumacetat von 100 auf 12,5 Milligramm pro Milliliter in acht Schritten.Dann pipettieren Sie acht Mikroliter jeder Verdünnung, gefolgt von zwei Mikrolitern Saatgut, in die Platte des Liquid-Handling-Roboters. Geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter 150 Nanoliter jeder Verdünnung von Endothiapepsin in die Unterwells eins und zwei des Siebs. 50 Nanoliter aufgetautes Saatgut und 100 Nanoliter der Well-Lösung aus Sub-Well zwei mehrfach aspirieren und beides in die Proteinlösung geben.Mischen Sie die Lösungen dreimal unter Zugabe des Kristallisationspuffers oder des Kristallisationspuffers und der Saatgutmischung. Versiegeln Sie nun die Platte und das Bild bei null, drei, sechs, 12, 18 und 24 Stunden des ersten Tages jeden Tag in der ersten Woche und jede Woche für die nächsten vier Wochen bei 20 Grad Celsius. Schauen Sie sich nach 24 Stunden die Platte unter einem Mikroskop an, schätzen Sie die Anzahl der Kristalle in jeder Vertiefung und messen Sie eine Probe der Kristalle.Notieren Sie diese Schätzungen im bereitgestellten Arbeitsblatt für den Morphogrammgenerator. Geben Sie die Ausgangskonzentrationen von Endothiapepsin und PEG 6000 in die entsprechenden Felder ein. Das Arbeitsblatt stellt die Ergebnisse automatisch im traditionellen Phasendiagrammformat mit den Fällmittel- und Proteinkonzentrationen auf der X- bzw. Y-Achse dar.Well-Bedingungen, die nur Kristalle in ihren gesäten Tropfen hervorbringen, deuten auf die MetaStable-Region des Diagramms hin, während Bedingungen mit Kristallen sowohl in den gesäten als auch in den nicht entkernten Tropfen die Nukleationszone anzeigen. Wählen Sie aus der Morphogrammanalyse die vielversprechendste Bedingung für die Skalierung in 24-Well-Platten aus. Beginnen Sie dann mit 100 Milligramm Endothiapepsin pro Milliliter und 35% PEG 6000.Bereiten Sie fünf Milliliter Kristallisationspuffer mit 35 % PEG 6000, 0,1 molaren Tris-HCl mit pH sieben und 0,15 molar Magnesiumchlorid vor. Geben Sie nun 0,5 Milliliter des Kristallisationspuffers in drei Vertiefungen einer gefetteten 24-Well-Hängefallplatte. Mischen Sie 15 Mikroliter Endothiapepsin mit 15 Mikrolitern Kristallisationslösung auf einem Glasdeckglas.Geben Sie die Lösung über die Vertiefungen und lassen Sie die Platte 24 Stunden lang stehen. Schauen Sie sich die Platte nach 24 Stunden unter dem Mikroskop an, schätzen Sie die Anzahl der Kristalle im Tropfen und messen Sie ihre Größe. Wenn die Kristalle falsch sind, wiederholen Sie diesen Schritt, ändern Sie jedoch die Proteinkonzentration oder fügen Sie Samen hinzu, wenn die Kristallkeimbildung nicht hoch genug ist.Wiederholen Sie das 24-Well-Skalierungsexperiment, indem Sie Samen mit einer höheren Konzentration von PEG 6000 hinzufügen. Geben Sie 0,5 Milliliter des neuen Kristallisationspuffers in drei Vertiefungen einer gefetteten 24-Well-Hängetropfplatte. Geben Sie 15 Mikroliter Endothiapepsin auf ein Glasdeckglas und mischen Sie fünf Mikroliter Samenbrühe und 10 Mikroliter Kristallisationslösung mit der Endothiapepsinlösung.Drehen Sie die Deckgläser um, legen Sie sie über die Vertiefungen und lassen Sie sie 24 Stunden einwirken. Überprüfen Sie die Tropfen erneut, um zu sehen, ob die Kristalle kleiner sind und eine höhere Konzentration aufweisen. Schätzen Sie die Anzahl der Kristalle im Tropfen und messen Sie ihre Größe erneut, um zu sehen, ob sie jetzt die richtige Größe haben.Um ein Seeded-Batch-Protokoll durchzuführen, bereiten Sie den Kristallisationspuffer aus 40 % PEG 6000, 0,1 molaren Tris-HCl mit einem pH-Wert von sieben und 0,15 molaren Magnesiumchlorid vor. 50 Mikroliter Saatgut und 100 Mikroliter Kristallisationslösung vormischen und im 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Proteinlösung mischen. Wirbeln Sie das Rohr 10 Sekunden lang und stellen Sie es bei 20 Grad Celsius auf eine Wippe oder einen Shaker.Nehmen Sie alle 20 Minuten 2,5 Mikroliter Aliquot der Batch-Lösung ein. Überwachen Sie die Größe und Anzahl der Kristalle mit einem Hämozytometer. Zählen Sie die Anzahl der Kristalle und messen Sie ihre Größe unter dem Mikroskop.Wenn die Kristalle eine Dimension von etwa 15 μm erreicht haben, wird die Reaktion mit 150 Mikrolitern 0,5 molaren Natriumacetat abgeschreckt, das mit 0,5 molaren Tris-HCl, 0,075 molaren Magnesiumchlorid und 20 % PEG 6000 ergänzt wird. Überprüfen Sie die Kristallgröße und -konzentration erneut mit dem Hämozytometer. Lagern Sie die Kristalle bei 20 Grad Celsius.Die Analyse des Endothiapepsin-Morphogramms deutete darauf hin, dass die Nukleation sowohl von Protein- als auch von Fällmittelkonzentrationen beeinflusst wurde. Die MetaStable-, Nukleations- und Präzipitationsbereiche des Diagramms können gut unterschieden werden. Die Zugabe von Samen erhöhte die Kristallzahl im Vergleich zu Tropfen ohne Samen signifikant.Die Analyse der Endothiapepsin-Mikrokristallisation in 200 bis 300 Mikroliter-Volumina zeigte die Veränderungen in der Kristallkeimbildung und die längste Dimension im Zeitverlauf. Die Erhöhung der PEG-Konzentration auf 35 % verbesserte die Kristallisation deutlich, mit einer Endkristallkonzentration von etwa 3,6 mal 10 bis sechs pro Milliliter und der längsten Kristalldimension von 42 Mikrometern. Um die Größe der endgültigen Kristalle zu reduzieren, wurde ein Ansatz zur Reduzierung der Proteinkonzentration angewendet, der leider die Kristallkonzentration erheblich reduzierte und letztendlich noch größere Kristalle erzeugte.Der Ansatz, die PEG-Konzentration auf 40 % zu erhöhen, ergab jedoch Kristalle etwa 3,1 mal 10 bis sechs pro Milliliter und eine Größe von etwa 39 Mikrometern. Darüber hinaus führte die Zugabe von Samen zu einem signifikanten Anstieg der Kristallkonzentration, etwa 1,1 mal 10 zu acht pro Milliliter und kleineren Abmessungen von etwa 4,2 Mikrometern. Der in der Kristallisationsreaktion versuchte Abschreckeffekt ergab eine endgültige Kristallkonzentration von etwa 2,6 mal 10 zu sechs pro Milliliter und eine Größe von etwa 15 Mikrometern.Die CC-Hälfte, die gegen die Auflösung der Röntgendaten aufgetragen wurde, zeigte eine leichte Abnahme der Kristallauflösung von 10 Mikrolitern auf 200 bis 300 Mikroliter Volumen. Der Kristall beugte sich jedoch immer noch auf 1,5 Angstrum, was als ausreichend erachtet wurde. Endothiapepsin ist ein verzeihendes Protein, mit dem man arbeiten kann.Wir hoffen, dass die Erprobung dieses Protokolls von Endothiapepsin nützliche Ideen und Methoden für andere Proteine hervorbringen wird. Besonders bei der Kristallographie ist es von Vorteil, zu sehen, wie die Dinge aussehen und sich anfühlen, anstatt zu versuchen, nur einem schriftlichen Protokoll zu folgen. Dieses Video wird Ihnen hoffentlich etwas von diesem Gefühl vermitteln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Wir beschreiben Verfahren zur Herstellung und Abgabe von Membranprotein-Mikrokristallen in lipidischer kubischer Phase für die serielle Kristallographie an Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern und Synchrotronquellen. Diese Protokolle können auch für die Einarbeitung und Abgabe von löslichen Proteinmikrokristallen verwendet werden, was zu einem erheblich reduzierten Probenverbrauch im Vergleich zur Flüssiginjektion führt.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 (PPEP-1) ist eine sezernierte Metalloprotease und ein vielversprechendes Wirkstoffziel aus dem humanpathogenen Clostridium difficile. Hier beschreiben wir alle Methoden, die für die Herstellung und Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig sind.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die kontrollierte Produktion von Protein Mikrokristalle. Das Verfahren nutzt ein automatisierte Gerät ermöglicht kontrollierte Manipulation verschiedener Parameter der Kristallisation. Die Protein-Kristallisation ist durch kontrollierte und Automatische Zugabe von Kristallisation Lösungen während der Überwachung und Untersuchung der Radius-Verteilung von Partikeln in der Kristallisation Tropfen durchgeführt.

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

Der Erfolg eines seriellen Femtosekunden zeitaufgelöste Kristallographie Experiments ist effiziente Musterlieferung abhängig. Hier beschreiben wir Protokolle, um die Extrusion von Bakteriorhodopsin Mikrokristalle aus eine hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor zu optimieren. Die Methodik setzt auf Probe Homogenisierung mit einem neuartigen Dreiwege Kupplung und Visualisierung mit einer Highspeed-Kamera.

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um den Dimer-Dodecamer-Übergang von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase, auf struktureller Ebene zu untersuchen. Es ist eine einfache Pipeline, die von der Proteinreinigung bis zur Röntgendatenverarbeitung reicht. Crystallogenese, Datensatzindexierung und molekularer Ersatz wurden durch einen Studienfall, TmPep1050H60A H307A Variante, betont.

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Strukturstudien von Biomakromolekülen durch Kristallographie erfordern hochwertige Kristalle. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys (ein vollautomatisiertes Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde) und/oder Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle verwendet werden kann, basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.

Optimierung des Kristallwachstums für die Neutronenmakromolekulare Kristallographie

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.

ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie

Lernen Sie die Optimierung von Mikrokristallisation für serielle Kristallographie mit Endothiapepsin. Dieses Protokoll zeigt die zuverlässige Herstellung mikrokristalliner Proben für strukturbiologische Analysen.

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

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