Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Invasion von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix in Echtzeit regeln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein einfaches Sphäroid-Bildgebungsgerät verwendet, das die Einrichtung des Sphäroid-Invasions-Assays erleichtert und seine Effizienz und Kosten verbessert. Während wir die Verwendung des Sphäroid-Invasions-Assays demonstrieren, um das Mammakarzinom zu modellieren, ist dieser Assay ein ausgezeichnetes Modell für die Invasion eines soliden Tumors in das umgebende gesunde Gewebe.

Gewichten Sie nach dem 3D-Druck des Abstandsraums ein Verhältnis von 10:1 von Basispolymer zu Querverlinker in einem Kunststoffbecher und verwenden Sie eine Einwegpipette, um die resultierende PDMS-Lösung im Becher gründlich zu mischen. Legen Sie den Becher in eine Vakuumkammer und lassen Sie schnell den Vakuumdruck los, um die an der Oberfläche des Gemischs eingeschlossene Luft zu entfernen und die verbleibenden Luftblasen abzuleiten. Inkubieren Sie den 3D-gedruckten Abstandsraum bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten, um seine Flexibilität zu erhöhen und zwei Glasplatten mit 100% Isopropanol zu reinigen.

Platzieren Sie den Abstandsraum so, dass er bündig zwischen den beiden gereinigten Platten ist, und legen Sie zwei große Binderclips am unteren Rand und einen auf die obere Ecke, um die Form auf die Außenkanten der Platten zu versiegeln. Prüfen Sie den oberen Teil der Form, um sicherzustellen, dass der Abstandsabstand mit den Glasplatten bündig ist, und verwenden Sie eine Einwegpipette mit etwa zwei Zentimetern, die von der Spitze geschnitten sind, um die PDMS-Mischung langsam, aber kontinuierlich in die obere linke Ecke der Form zu geben. Wenn die gesamte Form gefüllt ist, legen Sie die Form in die Vakuumkammer, um alle entstandenen Luftblasen zu entfernen, bevor Sie das PDMS für eine Stunde bei 100 Grad Celsius aushärten.

Am Ende der Inkubation die Form bei Raumtemperatur platzieren. Wenn es kühl zur Berührung ist, entfernen Sie die Binderclips und Glasplatten aus dem Abstandshalter, der das ausgehärtete PDMS enthält, und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Dichtung zu durchschneiden, die auf allen vier Seiten der Form zwischen Abstandhalter und Glasplatte entstanden ist. Ziehen Sie die Form auseinander, um das PDMS-Blatt im Abstandsraum zu enthüllen, und verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS-Blatt vorsichtig vom Abstandsraum zu schälen.

Legen Sie das Blech auf eine Schneidmatte und stanzen Sie mit einem Biopsies-Punch eine PDMS-Scheibe mit einem Durchmesser von 17,5 Millimetern aus und schlagen Sie dann drei gleichmäßig verteilte 5,5-Millimeter-Löcher in die Scheibe. Verwenden Sie Klebeband, um Staubpartikel von jedem Einsatz zu entfernen und kleben Sie die gereinigten Einsätze auf ein Stück doppelseitiges Band. Wickeln Sie das Klebeband um den Deckel einer 10 Zentimeter petri Schale und legen Sie den Deckel in eine Plasmamaschine zusammen mit offenen 35-Millimeter-Glasbodenschalen.

Aktivieren Sie die Einsätze und das Glas mit einer Minute Plasmabehandlung bei 300 Millitorrn und befestigen Sie die behandelte Seite jedes Einsatzes schnell am Glasteil einer behandelten Glasbodenschale pro Einsatz. Wenn alle Einsätze aufgebracht wurden, verwenden Sie den Zeigefinger und daumen, um gleichmäßigen Druck auf jeden Einsatz auszuüben, während Sie die Schale drehen, um die Einsätze sicher an den Tellern zu befestigen. Wenn alle Einsätze gesichert sind, inkubieren Sie die resultierenden Sphäroid-Bildgebungsgeräte für 20 Minuten bei 60 Grad Celsius, bevor Sie eine zweite Runde der Plasmabehandlung durchführen, wie gezeigt.

Nach der zweiten Behandlung 35 Mikroliter frisch zubereitete Beschichtungslösung zu jedem Insert-Loch hinzufügen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Beschichtungslösung entfernen und das Gerät dreimal mit destilliertem Wasser abspülen. Nach der letzten Wäsche 35 Mikroliter Vernetzungslösung zu jedem Loch für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.

Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gerät dreimal mit destilliertem Wasser, bevor Sie jedes Gerät für eine 30-minütige Inkubation unter UV-Licht mit 70 % Ethanol füllen. Am Ende der Sterilisation spülen Sie die Geräte dreimal mit destilliertem Wasser ab und fügen Sie jedem Gerät 2,5 Milliliter Speicherlösung hinzu. Um die Sphäroide in Kollagen einzubetten, waschen Sie die Geräte dreimal mit drei MilliliterPBS pro Waschgang.

Nach der letzten Wäsche, lassen Sie die Geräte vollständig trocknen, bevor Sie ein Sphäroid in 30 Mikroliter frisch zubereitetcollege eine Lösung in ein Loch des Einsatzes und starten Sie einen Timer. Nachdem Sie das Vorhandensein des Sphäroids in der Bohrung bestätigt haben, fügen Sie sphäroide zu den anderen beiden Löchern hinzu, wie gezeigt. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um alle Sphäroide, die sich in der Nähe des PDMS-Rahmens befinden, zu neueren zu trennen oder die Sphäroide zu trennen, wenn mehrere Sphäroide ausgegeben werden, und stoppen Sie den Timer.

Um das Sphäroid in der Kollagenschicht vertikal zu zentrieren, kippen Sie das Gerät nach dem Aussaat auf den Kopf und inkubieren Sie das Gerät bei 37 Grad, bis das Kollagen polymerisiert, wodurch die Geräteausrichtung alle zwei Minuten für insgesamt 30 Minuten umkehrt wird, fügen Sie dann 2,5 Milliliter Medium pro Gerät hinzu und erfassen Sie ein Bild der Sphäroide zum Nullstundenzeitpunkt. Die Verwendung eines Sphäroid-Bildgeräts erleichtert die effiziente Einbettung und Zeitrafferaufzeichnung der Krebszellinvasion im Kollagen oder über Längsbildgebung. Während dieses Sphäroid im Laufe von sechs Tagen längs abgebildet wurde, was die stabile Expression zytoplasmatischer und/oder nuklearfluoreszierender Proteine erforderte, kann eine ähnliche Längsbildgebung über einen kürzeren Zeitraum mit Farbstoffbeschriftung durchgeführt werden.

Sphäroide können auch fixiert und immunmarkiert werden. Zum Beispiel waren diese Sphäroide immunlabeliert für Epithel-Cadherin, Cortactin und F-Actin. In diesen Bildern kann eine Schritt-für-Schritt-Illustration des Bildverarbeitungsverfahrens mit dem Fidschi-Makro beobachtet werden, um die Fläche des Sphäroids im Laufe der Zeit zu messen.

Achten Sie darauf, ein einzelnes Sphäroid in jedes Loch des Sphäroid-Bildgebungsgeräts zu geben und das Sphäroid in der Mitte des Lochs in XY- und Z-Richtung zu positionieren. Das Gerätedesign kann leicht geändert werden, indem die Größe und Anordnung der Löcher, Einsätze und Glasbodenschalen geändert werden, um einen höheren Sphäroiddurchsatz aufzunehmen.