Ein verbesserter Assay und Werkzeuge zur Messung der mechanischen Nociception in Drosophila Larven

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es dem Benutzer ermöglicht, ein Werkzeug zu entwickeln, mit dem mechanische Nozizeptionsreaktionen in genetisch manipulierbaren Drosophila-Larven präzise gemessen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfache Materialien verwendet, um benutzerdefinierte Werkzeuge zu bauen, mit denen die mechanische Nozizeption vom unterschwelligen bis zum vollständig ansprechenden Bereich gemessen werden kann. Diese Werkzeuge und Methoden können verwendet werden, um die anfängliche mechanische Nozizeption und die nozizeptive Sensibilisierung nach Verletzungen oder Krankheiten zu messen.

Das Sondieren von Larven mit maßgeschneiderten Filamenten erfordert Übung. Anwender sollten in der Lage sein, Dosis-Wirkungs-Kurven mit Kontrolllarven zu erstellen, bevor sie ein Experiment versuchen. Um eine mechanische Sonde zu konstruieren, verwenden Sie einen kleinen Drahtschneider, um jedes Nitinol-Filament senkrecht zu seiner Längsachse auf die angegebene Länge zu schneiden.

Die Filamente gibt es in drei verschiedenen voreingestellten Durchmessern. Untersuchen Sie die Spitze der Filamente unter einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine scharfen oder unregelmäßigen Kanten zurückbleiben, die die Gewebeschädigung der Larvenhaut verursachen und die Kalibrierung beeinträchtigen könnten. Verwenden Sie dann einen Schleifstein, um die Kanten der Sonde manuell zu glätten, bis keine scharfen Unregelmäßigkeiten mehr vorhanden sind.

Als nächstes stichst du mit einer Injektionsnadel ein Loch in der Nähe des Endes eines hölzernen Eisstiels. Tragen Sie Holzleim auf ein einzelnes Nitinol-Filament auf und führen Sie das leimbeschichtete Filament in den Nadelschlitz ein. Wenn der Kleber getrocknet ist, drücken Sie die Sonde gegen die Skala, bis sich die Sonde biegt, um die maximale Kraft zu bestimmen, die in Gramm aufgezeichnet werden kann.

Verwenden Sie die Formel, um die aufgezeichnete Masse in Kraft in Millinewton umzurechnen. Teilen Sie dann die gemessene Kraft durch die Oberfläche der Filamentspitze, um die berechnete Kraft in Kilopascal Druck umzurechnen. Die Vorbereitung mehrerer Sonden mit Filamenten unterschiedlicher Durchmesser und Länge ergibt einen vollständigen Satz, der den responsiven Bereich für Drosophila-Larven abdeckt.

Um Drosophila-Larven für ein Experiment vorzubereiten, ziehen Sie die Nachkommen der Larven mit Standardfutter in einem 25 Grad Celsius heißen Inkubator für etwa 96 Stunden auf. Wenn die Larven das dritte Stadium erreichen, bereiten Sie einen Pfropfen mit Fliegenfutter in einer kleinen Petrischale für die zu testenden Larven vor und verwenden Sie eine Pinzette, um die mittelgroßen Larven des mittleren Drittels vorsichtig von den kleineren zweiten und frühen dritten Larven und den größeren späten oder wandernden Larven des dritten Stadiums zu trennen. Dann verwenden Sie die Pinzette, um 20 bis 30 Larven des mittleren Drittels in eine kleine Petrischale zu übertragen, in der sich ein kleiner Pfropfen mit Fliegenfutter befindet, das mit Wasser bei Raumtemperatur angefeuchtet ist.

Um einen mechanischen Nozizeptionstest durchzuführen, verwenden Sie eine Pinzette, um eine Larve im mittleren Drittel des Stadiums auf ein dunkles, dünnes Vinylpad unter einem Hellfeld-Stereomikroskop zu platzieren, und ordnen Sie Lichtwellenleiter zwischen den Objektivlinsen des Mikroskops und dem Pad an. Wischen Sie mit einem Papiertuch überschüssiges Wasser um die Larve herum ab und bewegen Sie das Pad so, dass Kopf und Mund der Larve auf die nicht dominante Hand des Forschers ausgerichtet sind. Wählen Sie eine mechanische Sonde aus und legen Sie die Sonde für ein bis zwei Sekunden auf die hintere dorsale Seite der Larve etwa im Abdominalsegment A8, wobei Sie die Larve an der Stelle des Sondenkontakts vorsichtig in das darunter liegende Polster drücken, bis sich die Sonde biegt und den zuvor gemessenen Druck auslöst.

Eine positive nozizeptive Reaktion ist indiziert, wenn die Larve innerhalb von drei Sekunden eine vollständige Korkenzieherrolle um 360 Grad entlang der Körperachse zeigt. Notiere die Verhaltensreaktion für jede Larve. Entsorgen Sie dann die getestete Larve und bereiten Sie die nächste Larve für den Test vor.

Diese kundenspezifischen mechanischen Sonden mit Nitinol-Filamenten können verwendet werden, um mechanisch evozierte Verhaltensweisen hervorzurufen und eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve des Verhaltens zu erzeugen, wobei sowohl harmlose als auch schädliche mechanische Sonden unterschiedlicher Intensität verwendet werden. Wie diese Ergebnisse von Verhaltenstests zeigen, provozieren Sonden, die einen Druck von 200 Kilopascal oder weniger ausüben, bei Drosophila-Larven keine aversive Rollreaktion. Erwartungsgemäß lösen diese unterschwelligen oder nicht schädlichen mechanischen Sonden keine sichtbaren Schäden am neuronalen Gewebe aus.

Umgekehrt lösen Superschwellen- oder schädliche Sonden eine verstärkte Verhaltensreaktion sowie eine Gewebeschädigung der peripheren sensorischen Neuronen selbst in dosisabhängiger Weise aus. Diese Sonden können auch zur Messung der mechanischen Überempfindlichkeit nach Verletzungen verwendet werden. Etwa 20 % der Larven reagierten bereits zwei Stunden nach der UV-Behandlung mit aversivem Rollen, während 50 % vier Stunden im Vergleich zu simulierten UV-bestrahlten Tieren reagierten.

Da die für diese Analyse verwendete Sonde normalerweise unter dem Schwellenwert von 200 Kilopascal lag, wurde diese Reaktion als mechanische Allodynie angesehen. Zu späteren Zeitpunkten ist die Verhaltensreaktion der UV-behandelten Larven leicht erhöht, unterscheidet sich aber statistisch nicht von der der simuliert bestrahlten Kontrollgruppe. Larven, die vier, acht und 16 Stunden nach der UV-Behandlung mit einer 462-Kilopascal-Sonde untersucht wurden, zeigten einen signifikanten Anstieg der aversiven Rollreaktion, wobei vier Stunden der Höhepunkt der Verhaltensüberempfindlichkeit waren, da der Reiz anfänglich schädlich war.

Die Reaktion wurde als mechanische Hyperalgesie angesehen. Die Sondenvorbereitung sowie die Auswahl und Kompression der Larve sind entscheidend für den Erfolg des Prozesses. Mit diesen Sonden können die Ausgangsnozizeption und die mechanische nozizeptive Überempfindlichkeit nach einer Verletzung gemessen werden.

Mit diesen Werkzeugen und Assays können die molekularen und genetischen Grundlagen der mechanischen Nozizeption und der nozizeptiven Überempfindlichkeit im genetisch manipulierbaren Drosophila-Modell gemessen werden.