Name: Metabolisches High-Throughput-Profiling für Modellverfeinerungen von Mikroalgen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Phenotyp-Microarray-Technologie zur Charakterisierung des Metabolismus von Chlamydomonas reinhardtii eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Verfeinerung genomweiter metabolischer Netzwerkmodelle in der Algenforschung.

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Maßgeblich unterstützt wurde diese Arbeit durch das NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), das von Tamkeen im Rahmen des Stipendiums des New York University Abu Dhabi Research Institute (73 71210 CGSB9) und der NYU Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060) finanziert wurde. W.F. wurde zusätzlich durch das Hundred Talents Program der Zhejiang University unterstützt. Wir danken Ashish Jaiswal für die Hilfe bei der Aufnahme des Videos. Wir danken Hong Cai für die Generierung der metabolischen Phänotypdaten.

1. Phänotyp-Microarray-Experimente
<ol><li>Erhalten Sie C. reinhardtii Stamm CC-503 aus dem Chlamydomonas Resource Center an der University of Minnesota, USA (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Die Zellen werden in frischen Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medien19 mit Endkonzentrationen von 400 μg/ml Timentin, 50 μg/ml Ampicillin und 100 μg/ml Kanamycin (zur Hemmung des Bakterienwachstums) unter 400 Mikromol Photonen/m2 s bei 25 °C für zwei Tage bis zur mittleren Log-Phase gezüchtet.</li>
	<li>Die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei 22 °C herunterdrehen und den Überstand verwerfen, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Bereiten Sie frische TAP-Medien mit 0,1% Tetrazoliumviolettfarbstoff "D" vor. HINWEIS: Modifizieren Sie die TAP-Medien in diesem Schritt, um einige Nährstoffe in Abhängigkeit von der in jeder Platte getesteten Metabolitenkategorie auszuschließen (z. B. Ausschluss von Ammoniumchlorid für Stickstoffquellenplatten).</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in frisch hergestellten TAP-Medien (aus Schritt 1.2) auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml.</li>
	<li>Verwenden Sie chemische Verbindungsarray-Assay-Platten (Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Phosphor- und Schwefelquellenplatten und die Peptidstickstoffquellen).</li>
	<li>Impfen Sie ein 100 μL Aliquot zellhaltiger Medien in jede Vertiefung der Testplatten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Assays duplizieren.</li>
	<li>Streifen Sie Zellen auf Hefeextrakt / Peptonplatten und führen Sie eine Grammfärbung durch, wie in Smith et al. 20 vor und nach dem Test zur Überwachung der bakteriellen Kontamination.</li>
	<li>Setzen Sie die Assay-Platten für chemische Verbindungen in das Mikroplattenlesesystem ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie alle Platten bei 30 °C für bis zu 7 Tage und programmieren Sie das Mikroplattenlesesystem so, dass es den Farbstofffarbwechsel alle 15 Minuten ableset. HINWEIS: Da die meisten Mikroplattenleser während der Inkubation keine kontinuierliche Lichtquelle liefern, sollten die Algen in der Lage sein, heterotrophe Atmung durchzuführen.</li>
</ol>2. Datenanalyse
<ol><li>Exportieren Sie die kinetischen Rohdaten aus dem Mikroplattenleser als CSV-Dateien, die anschließend als Eingabe für das Omnilog Phenotype Microarray (OPM) -Paket in R verwendet werden. Fügen Sie die biologischen Informationen als Metadaten hinzu (z. B. Stammbezeichnung, Wachstumsmedien, Temperatur usw.).<ol>
<li>Verwendung der PM Kinetic Datenkonverter-Software; Laden Sie die D5E-Datendateien und konvertieren Sie sie mithilfe der folgenden Befehlszeilen in der kinetischen Analysesoftware PM in OKA-Dateien: | Importieren (suchen Sie den Ordner der OKA-Dateien) | Auffüllen von Filtern | | importieren Alle Platten hinzufügen | Schließen. | exportieren Wählen Sie gelesene Daten (Kinetic), wählen Sie Format (CSV) (Tabellarische Kopfzeile)und wählen Sie Platten (jede Platte (einzelne Dateien)) | | exportieren Retten.
</li>
		<li>Um die Phenotype Microarray (PM) Datenanalyse durchzuführen, verwenden Sie das OPM-Softwarepaket21,22, das innerhalb der R-Softwareumgebung ausgeführt wird. Das Paket, das Tutorial und die Referenzdokumentation finden Sie unter: http://www.goeker.org/opm/. Installieren Sie in RStudio, einer grafischen Benutzeroberfläche für R, das opm-Paket und seine Abhängigkeiten mithilfe der folgenden Befehle: Quelle (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) Bibliothek (opm)
</li>
		<li>Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das die CSV-Dateien der kinetischen Daten enthält, und importieren Sie die Daten mit der Funktion read_opm: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Aggregieren und diskretisieren Sie die kinetischen Daten mithilfe der Kurvenparameterschätzung. Für (i in 1 :length(x)) { x[[i]] <Ich mache _aggre(x[[i]], boot = 0 L, cores = 1 L, method ="splines", options = set_spline_options("smooth.spline")) x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSE) } #Collection der Metadaten Metadaten <- collect_template(".") metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503") for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadaten, replace = TRUE)}
</li>
		<li>Verwenden Sie die Funktion xy_plot, um die Atmungs- (oder Wachstums-) Messungen (y-Achse) als Funktion der Zeit (x-Achse) für die untersuchten 96-Well-Platten abzubilden. print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
</li>
		<li>Visualisieren Sie die Daten als Heatmap mit der Funktion level_plot, um einen schnellen vergleichenden Überblick über die kinetischen Daten zu ermöglichen. level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Extrahieren Sie wichtige biologische Informationen, die Kurvenparameter, aus den rohen kinetischen Kurven und schließen Sie die Lag-Phase (λ), die Wachstumsrate (μ), die maximale Zellatmung (A) und die Fläche unter der Kurve (AUC)21ein. Um positive Metaboliten zu identifizieren, verwenden Sie die A-Werte der Negativkontrolle, die die abiotische Reaktivität des Farbstoffs mit dem Medium darstellt, zusätzlich zum Rohling jeder Mikrotiterplatten als Hintergrundsubtraktionswerte. Die Extract-Funktion wird verwendet, um den A-Parameter abzurufen. opm_opt("curve.param") param <- Extrakt (x, as.labels = list("Strain")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifizierung von Reaktionen und Genen, die mit neuen Metaboliten assoziiert sind
<ol><li>Durchsuchen Sie KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) und MetaCyc (http://metacyc.org/), um Enzyme Commission Numbers (ECs) für Reaktionen mit Metaboliten aus chemischen Verbindungsarrays zu identifizieren23,2423,24.</li>
	<li>Verwenden Sie die identifizierten EC-Nummern als Suchbasis in mehreren verfügbaren Algenannotationsressourcen wie dem Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) und Peer-Review-Publikationen23,25,26,27.</li>
	<li>Wenn eine Abfrage keinen genetischen Nachweis für eine bestimmte EC-Nummer liefert, identifizieren Sie die relevanten assoziierten Proteine in anderen Organismen, beginnend mit Spezies, die dem C. reinhardtiiam nächsten sind , führen Sie dann eine profilbasierte Suche mit dem NCBI PSI-BLAST-Server mit Standardeinstellungen durch und verwenden Sie nicht redundante Proteine (nr) in C. reinhardtii (taxid:3055), um Kandidatengene zu identifizieren, die mit der Reaktion assoziiert sind12.</li>
	<li>Manuelles Kuratieren von PSI-BLAST-Treffern mit E-Werten von < 0,05 auf Relevanz für die gesuchte EC-Nummer, indem Sie diese BLAST-Treffer über EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) oder InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) Proteindomänenvorhersageserver abfragen. Beachten Sie, dass die letzten beiden Scans kritische Schritte sind, um die Identifizierung der korrekten enzymatischen Aktivität für das Protein sicherzustellen.</li>
</ol>4. Modellverfeinerung und -bewertung
<ol><li>Verwenden Sie die neueste COBRA Toolbox v.3.028in MATLAB29,30-Plattform, um die folgenden Schritte zur Modellverfeinerung durchzuführen. Die COBRA Toolbox kann installiert werden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Alternativ beachten Sie, dass die COBRA Toolbox auch in anderen Open-Source-Programmiersprachen wie Python (COBRApy) implementiert ist.31) und ist erhältlich unter: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>Öffnen Sie nach der Installation der COBRA Toolbox v.3.0 MATLAB und führen Sie den folgenden Befehl aus, um die Toolbox zu initialisieren: initCobraToolbox;</li>
		<li>Fügen Sie die identifizierten Reaktionen mit ihren zugehörigen Genen zum Stoffwechselmodell hinzu, z. B. iRC1080, indem Sie die COBRA Toolbox-Funktionen addReaction und changeGeneAssociationverwenden. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das das von http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 heruntergeladene iRC1080-Modell enthält, und führen Sie die folgenden Befehle aus, um das Modell zu laden, umzubenennen und eine neue Reaktion und das zugehörige Gen hinzuzufügen. Load('iRC 1080 .mat') modelNeu = iRC 1080; modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNEW = changeGeneAssociation(modelNeu, ... 'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1');</li>
		<li>In einigen Fällen, in denen der Metabolit nicht intrazellulär produziert, sondern aus dem Medium aufgenommen wird, fügen Sie dem Modell Transportreaktionen für die neuen Metaboliten hinzu. Diese Transportreaktionen stellen die passive Diffusion eines Metaboliten aus dem extrazellulären Medium zum Zytosol dar. Fügen Sie außerdem eine entsprechende künstliche Austauschreaktion mit der addExchangeRxn-Funktion hinzu, um den Metaboliten in das extrazelluläre Medium ein- oder auszugeben. modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Testen Sie das Verhalten des neuen resultierenden Modells, z. B. iBD1106, indem Sie eine Flussbilanzanalyse (FBA) mit der Funktion optimizeCbModel unter hellen und dunklen Bedingungen zur Maximierung der Biomasse als Zielfunktion durchführen. Für das Lichtwachstum stellen Sie die untere und obere Grenze der PRISM Solar-Litho'-Lichtreaktionen auf 646,07 (maximale Rate) ein. Setzen Sie für dunkles Wachstum die Grenzen aller PRISM-Lichtreaktionen auf Null. Verwenden Sie die zuvor definierte Funktion Biomasse10 für das Wachstum unter dunklen und hellen Bedingungen. Die FBA-Lösung gibt zwei Vektoren aus, die den Reaktionsflüssen (solution.v) und den reduzierten Kosten (solution.w) entsprechen, sowie einen Vektor, der den Schattenpreisen der Metaboliten entspricht (solution.y). %Wachstum unter Lichtverhältnissen simulieren: modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % "PRISM_solar_litho " , ... "PRISM_solar_exo " , ... "PRISM_incandescent_ 60 W" , ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ... "PRISM_metal_halide " , ... "PRISM_high_pressure_sodium " , ... "PRISM_growth_room " , ... "PRISM_white_LED " , ... "PRISM_red_LED_array_ 653 nm" , ... "PRISM_red_LED_ 674 nm" , ... "PRISM_fluorescent_warm_ 18 W" , ... "PRISM_design_growth " , ... }, 0, 'b' ); modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 für iRC1080, um die für iBD1106 erhaltenen FBA-Lösungen mit denen für iRC1080 zu vergleichen.</li>
		<li>Es gibt eine Reihe von COBRA-Methoden, die zum Vergleich von Modellen verwendet werden können (z. B. Flussvariabilitätsanalyse, Gendeletionsstudien, Robustheitsanalysen, Flux-Split-Vorhersagen, FBA, Sampling usw.). Ausführliche Tutorials finden Sie unter https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Hier wird ein Beispiel gegeben, bei dem das iRC1080-Modell mit seiner verfeinerten Version, iBD1106, verglichen wird, indem die Schattenpreise (Sensitivität der Biomasse-Zielfunktion gegenüber Änderungen der Systemvariablen) der in jedem Modell berücksichtigten Metaboliten ermittelt werden. Erhalten Sie die Schattenpreise für die Metaboliten: shadowPrices = table(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die metabolische Phänotypisierung der grünen Mikroalge, C. reinhardtii,wurde hier unter Verwendung von Hochdurchsatz-PM-Assay-Platten und einem unveränderten PMI beschrieben. Die Assays wurden für insgesamt 190 Kohlenstoffquellen (PM01 und PM02), 95 Stickstoffquellen (PM03), 59 Phosphorquellen und 35 Schwefelquellen (PM04) sowie Peptidstickstoffquellen (PM06-08) verwendet. Eine positive Atmung wurde für 148 Nährstoffe beobachtet (ein positiver Assay für die C-Source-Nutzung, vier positive Assays für jede S-Source- und P-Source-Nutzung und 139 positive Assays für die N-Source-Nutzung). Die Substrate oder Nährstoffe (Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor oder Schwefel) des Mediums sollten dem definierten Medium nicht zugesetzt werden, wenn sie auf die relevanten PM-Mikroplatten aufgetragen werden, die für jede dieser Quellen getestet werden.
Die hier gezeigte Methode ist wirksam für die Charakterisierung von metabolischen Mikroalgen-Phänotypen, die verwendet werden können, um bestehende metabolische Netzwerkmodelle zu erweitern oder die Rekonstruktion neuer Modelle zu steuern. Da die Ernährungsbedürfnisse der meisten Mikroalgen nicht bekannt sind, kann diese Plattform verwendet werden, um diese schnell zu definieren. Nelson et al. 43 hatte diese Methoden erfolgreich angewendet, um neue Verbindungen zu identifizieren, die das Wachstum der Mikroalge Chloroidium sp. UTEX 3007 unterstützen, und die erhaltenen Informationen verwendet, um die Spezieseintrittsmetaboliten zu definieren, die im Gegensatz zu Chlamydomonas 40 verschiedene Kohlenstoffquellen umfassen.
Eine wesentliche Einschränkung des PM für die Profilierung von Mikroalgen besteht darin, dass das PMI in der Inkubationskammer keine Beleuchtung hat und die Mikroalgen in der Lage sein müssen, einen heterotrophen Stoffwechsel durchzuführen. Die Abwesenheit von Licht könnte die Interpretation von Modellen beeinflussen, die Licht zur Berechnung von Stoffwechselflüssen einbeziehen. Genpaare mit koordinierenden Funktionen haben sich zu metabolischen Netzwerkknotenpunkten entwickelt, und die Unterscheidung zwischen photosynthetischen und nicht-photosynthetischen Netzwerkknotenpunkten kann vorgenommen werden44. Im Allgemeinen würden photosynthetische Netzwerk-Hubs (d. H. Stark verbundene Knoten im Modell) aus heterotrophen Modellen ausgeschlossen. Aus praktischen Gründen sollte die Modellierung des Heterotrophismus in mixotrophen Spezies Reaktionen auslassen, von denen bekannt ist, dass sie durch Licht angetrieben werden, und die Energiebilanzunterschiede zwischen den Bedingungen berücksichtigen. Somit ist die Modellierung des lichtabhängigen und lichtunabhängigen Stoffwechsels Standardpraxis in der Chlamydomonas Stoffwechselmodellierung6,45.
Einige grüne Mikroalgen, wie Trebouxiophyten, sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Kohlenstoffmolekülen für das Wachstum zu assimilieren, und es wird angenommen, dass dies aus ihrer langen Evolutionsgeschichte als Mitglieder von Flechten46entstanden ist. Während Chlorophyten wie Chlamydomonas Acetat für das Wachstum verwenden können, kann die braune marine Mikroalge Tisochrysis lutea, die für ihr Potenzial bekannt ist, sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren (VLC-PUFAs) kommerziell zu produzieren, kein Acetat verwenden, kann aber Glycerin für das Wachstum verwenden47. Die Biomassekonzentration von mehr als 100 g l−1 Trockenzellgewicht wurde mit Chlorella unter optimierter Zugabe organischer Kohlenstoffquellen in einem Fed-Batch-Modus48erreicht. Darüber hinaus kann die Zugabe von Zucker zu Chlorellavulgaris seine Bindung von CO2erhöhenund so einen additiven Nutzen während des photosynthetischen Wachstumsbieten 49. Die meisten heterotrophen Mikroalgen können auch mixotroph wachsen, aber es wurde gezeigt, dass der Chlorophyt Chromochloris zofingiensis die Photosynthese bei Zugabe von Zuckerabschaltet 50.
Kieselalgen, die zur Abteilung Bacillariophyta gehören, sind eine Hauptgruppe des Phytoplanktons. Obwohl die meisten Kieselalgen nur photoautotroph wachsen können, können einige von ihnen mixotroph oder heterotroph kultiviert werden51. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Glycerin das Wachstum im Licht in Abwesenheit von CO2 in einigen Kieselalgen unterstützt, einschließlich der Modellspezies Phaeodactylum tricornutum52. Auch einige benthische Kieselalgen wie Nitzschia linearis können auf Kohlenhydraten im Dunkeln wachsen53. Es ist wahrscheinlich, dass die PM-Assays auf Kieselalgen und andere Algengruppen ausgedehnt werden, indem geeignete organische Kohlenstoffquellen ergänzt werden, damit die Zellen heterotroph wachsen können, und eine Mixotrophiestrategie kann möglicherweise auch für die obligat autotrophen Mikroalgen verwendet werden, die eine minimal erforderliche Lichtversorgung bereitstellen.
Um die Reproduzierbarkeit der Daten zu beurteilen, wird dringend empfohlen, für alle Platten Doppelteinassays durchzuführen. Ein Assay kann nur dann als positiv angesehen werden, wenn nach Subtraktion von der Negativkontrolle und den jeweiligen Blindbohrungen die Absorption (PMI-Wert) positiv ist. Diese Beschreibung ist in Gegenwart der getesteten Verbindung ein Spiegelbild der abiotischen Reaktion des Farbstoffs mit dem Medium.

Die Optimierung des Algenstoffwechsels für eine verbesserte und stabile Produktion gezielter Metaboliten erfordert die Entwicklung komplexer Metabolic-Engineering-Strategien durch Analysen von Stoffwechselnetzwerken auf Systemebene. Metabolische Netzwerkmodelle können die rationalen Entwürfe für die schnelle Entwicklung von Optimierungsstrategienleiten 1,2,3,4. Obwohl etwa 160 Mikroalgenarten sequenziert wurden5,gibt es nach unserem Wissen nur 44 Algenstoffwechselmodelle4,6,7. Aufgrund der Schwierigkeit, metabolische phänotypische Daten mit hohem Durchsatz für die experimentelle Validierung genomischer Informationen zu erhalten, hinkt die Rekonstruktion hochwertiger Netzwerkmodelle der rasanten Entwicklung der Algengenomsequenzierung hinterher.
C. reinhardtii ist ein attraktives Modellsystem für Algenuntersuchungen. Diese Art kann photoautotroph oder heterotroph wachsen und wurde in der Grundlagen- und angewandten Forschung häufig als Modellorganismus verwendet. Seine Genomsequenz wurde 2007 veröffentlicht8, wobei metabolische Genommodelle anschließend für die Spezies9, 10,11rekonstruiertwurden. Das Genom-Scale-Modell für C. reinhardtii (iRC1080) wurde von Chang et al. rekonstruiert. 10 basierend auf genomischen und literarischen Beweisen (mit ~ 250 Quellen). Es hat 1.706 Metaboliten mit 2.190 Reaktionen10; Die Vollständigkeit des Modells konnte jedoch nicht über die damals verfügbaren veröffentlichten experimentellen Beweise hinaus verifiziert werden.
Die Phänotyp-Microarrays-Technologie (PMs) ist eine Hochdurchsatzplattform, die metabolische Profiling-Informationen für heterotrophe Mikroorganismen sowie Gewebekulturzellen bereitstellen kann. Insbesondere kann es verwendet werden, um die Phänotyp-zu-Genotyp-Wissenslücke bei Mikroalgen zu schließen, wie sie zuerst für Chlamydomonas reinhardtii12 und anschließend für eine Art von Chloroidium13 und Chlorella14berichtet wurde. Durch die Untersuchung von Zellantworten auf Tausende von Metaboliten, Signalmolekülen, Osmolyten und Effektormolekülen können die PM-Assays ein funktionelles metabolisches Profiling liefern und Einblicke in die Funktion, den Stoffwechsel und die Umweltempfindlichkeit geben15,16,17. Insbesondere erkennen PM-Assays die Verwendung von Zellmetaboliten in 96-Well-Mikroplatten mit verschiedenen Nährstoffen, Metaboliten oder Osmolyten, die in jedem Bohrloch enthalten sind. Darüber hinaus ist es auch möglich, bioaktive Moleküle wie Antibiotika und Hormone zu testen. Bestimmt durch die Intensität der Farbproduktion durch die NADH-Reduktion eines Tetrazolium-basierten Redoxfarbstoffs wird die metabolische Verwertung von Substraten in Bezug auf die Zellatmung15,16,17bewertet. Die Experimente in 96-Well-Mikrotiterplatten können im Laufe der Zeit mit der Phänotyp-Microarray-Instrument-Plattform (PMI) überwacht und automatisch bestimmt werden. Zwanzig 96-Well-Mikroplatten sind so konzipiert, dass sie die üblichen Metaboliten darstellen, um zelluläre Phänotypen zu untersuchen, um Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphorquellen sowie verschiedene osmotische / Ionen- und pH-Effekte zu nutzen. Die PM-Technologie wurde erfolgreich zur Aktualisierung und Aktualisierung einer Reihe bestehender Genom-metabolischer Modelle für Mikroorganismeneingesetzt 15,16,17,18.
Das hier gezeigte Protokoll und die Daten basieren auf zuvor veröffentlichten Arbeiten von Chaiboonchoe et al. 12 Die vorgestellte Arbeit beschreibt die Verwendung der PM-Assay-Methode zur Charakterisierung der metabolischen Phänotypen von Mikroalgen und zur Erweiterung eines bestehenden Algen-Stoffwechselmodells von C. reinhardtii sowie zur Anleitung der Rekonstruktion neuer Stoffwechselmodelle.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Biolog Assay-Platten [ PM01-08]</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog Instrument</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii Stamm CC-503</td><td>Chlamydomonas Resource Center an der University of Minnesota, USA.</td><td></td><td>Regenten der Universität von Minnesota</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazolium Violet Farbstoff " D"</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolisches high-throughput-profiling für modellverfeinerungen von mikroalgen

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Stoffwechselmodelle werden auf der Grundlage der verfügbaren Genomannotation eines Organismus rekonstruiert und bieten prädiktive Werkzeuge, um Stoffwechselprozesse auf Systemebene zu untersuchen. Stoffwechselmodelle im Genommaßstab können sowohl Lücken als auch Reaktionen enthalten, die experimentell nicht verifiziert sind. Rekonstruierte Modelle von neu isolierten Mikroalgenarten werden aufgrund dieser Lücken zu Schwächen führen, da für den Metabolismus solcher Isolate in der Regel spärliche biochemische Beweise vorliegen. Die Phänotyp-Microarray-Technologie (PM) ist eine effektive Hochdurchsatzmethode, die funktionelle Bestimmung der zellulären Stoffwechselaktivitäten als Reaktion auf eine Vielzahl von Eintrittsmetaboliten ermöglicht. Die Kombination der phänotypischen Hochdurchsatz-Assays mit der metabolischen Modellierung kann es ermöglichen, bestehende metabolische Netzwerkmodelle schnell zu rekonstruieren oder zu optimieren, indem biochemische Beweise zur Unterstützung und Erweiterung der genomischen Evidenz bereitgestellt werden. Diese Arbeit wird die Verwendung von PM-Assays für die Untersuchung von Mikroalgen am Beispiel der grünen Mikroalgenmodellspezies Chlamydomonas reinhardtii zeigen. Experimentelle Beweise für über 254 Reaktionen, die durch PM erhalten wurden, wurden in dieser Studie verwendet, um ein genomweites C. reinhardtii-Stoffwechselnetzwerkmodell, iRC1080, um etwa 25 Prozent zu erweitern und zu verfeinern. Das hier erstellte Protokoll kann als Grundlage für die funktionelle Profilierung des Metabolismus anderer Mikroalgen, einschließlich bekannter Mikroalgenmutanten und neuer Isolate, verwendet werden.

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer Phänotyp-Microarray-Technologieplattform (PM), um die metabolischen Anforderungen von Chlamydomonas reinhardtii, einer grünen Mikroalge, zu definieren und ein bestehendes metabolisches Netzwerkmodell zu verfeinern.

Metabolisches High-Throughput-Profiling für Modellverfeinerungen von Mikroalgen

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

Die Phänotyp-Mikroarray-Technologie ist eine effektive Hochdurchsatzmethode, die die zellulären Stoffwechselaktivitäten als Reaktion auf eine Vielzahl von Eintrittsmetaboliten funktionell bestimmt. Die Verwendung in dieser Technologie wird in Form der Zellatmung gemessen, die durch die Menge an Farbentwicklung bestimmt wird, die durch die NADH-Reduktion eines Tetrazolium-basierten Redoxfarbstoffs erzeugt wird. In dieser Arbeit werden wir den Einsatz von Phänotyp-Mikroarray-Assays im Kontext von Mikroalgen unter Verwendung der Modellspezies Chlamydomonas reinhardtii vorstellen.Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Charakterisierung der metabolischen Phänotypisierung von Mikroalgen zu etablieren, mit der bestehende metabolische Algennetzwerkmodelle erweitert oder die Rekonstruktion neuer Modelle geleitet werden kann. Chlamydomonas reinhardtii Stamm CC-503 kann aus dem Chlamydomonas Resource Center an der University of Minnesota USA bezogen werden. Züchten Sie die Zellen in frischen Tris-Acetatphosphat-Fettmedien bis zur mittleren Log-Phase.Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie in gutem Zustand und ohne Kontamination sind. Drehen Sie die Kultur bei 2000 G-Kraft für 10 Minuten herunter. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.Bereiten Sie frische Klopfmedien mit 0,1% Tetrazoliumviolettfarbstoff D vor"Fügen Sie den Medien verschiedene Antibiotika wie Timentin, Ampicillin und Kanamycin hinzu, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Fettmedien und dieser Schritt sollten je nach Tellertyp von Nährstoffen weggelassen werden. Suspendieren Sie das Pellet und die frischen Klopfmedien auf eine Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter.Verwenden Sie chemische Verbindungsarray-Assay-Platten, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Phosphor- und Schwefelquellenplatten und die Peptidstickstoffquellen. Impfen Sie 100 Mikroliter ausreichend an selbsttragenden Medien in jede Vertiefung der Aufsatzplatten. Stellen Sie sicher, dass Sie die Assays duplizieren.Es sollte beachtet werden, dass in diesem Stadium zellen vor und nach dem Assay mit gramnegativer Färbung getestet werden sollten, um die bakterielle Kontamination zu überwachen. Setzen Sie die Assay-Platten für den Bereich der chemischen Verbindung in das Mikrotiterplatten-Lesesystem ein. Inkubieren Sie alle Platten bei 30 Grad für bis zu sieben Tage und programmieren Sie das Mikroplattenlesesystem so, dass es den Farbstofffarbwechsel alle 15 Minuten ableset.Da die meisten Mikroplattenleser während der Inkubation keine kontinuierliche Lichtquelle liefern, sollten die Algen in der Lage sein, heterotrophe Atmung durchzuführen. Exportieren Sie die kinetischen Rohdaten aus dem Mikrotiterplattenleser als CSV-Dateien, die anschließend als Eingabe für das Phänotyp-Microarray-Softwarepaket und unsere Software verwendet werden. Um die Phänotyp-Microarray-Datenanalyse durchzuführen, verwenden Sie das OmniLog phenotype micro Erik OPM-Softwarepaket, das in der R-Softwareumgebung ausgeführt wird.Installieren Sie in R Studio, der grafischen Benutzeroberfläche für R, das OPM-Paket und seine Abhängigkeiten mit den im Manuskript beschriebenen Befehlen. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das die CSV-Dateien der kinetischen Daten enthält, und importieren Sie die Daten mit der Funktion OPM lesen. Die kinetischen Daten können mithilfe der Pref-Parameterschätzung aggregiert und diskretisiert werden.Mit dem Funktions-XY-Diagramm können die Atmungs- oder Wachstumsmessungen als Funktion der Zeit für die Assay-96-Well-Platten abgebildet werden. Die Daten können mit Hilfe des Funktionsebenendiagramms als Heatmap visualisiert werden, um einen schnellen vergleichenden Überblick über die kinetischen Daten zu ermöglichen. Der nächste Schritt besteht darin, die Reaktionen und Gene zu identifizieren, die mit den neuen Metaboliten assoziiert sind.Im Falle des Vorhandenseins eines vorhandenen Modells für die Algen kann die Datenanalyse aus dem Phänotyp-Microarray-System verwendet werden, um dieses Modell zu verfeinern. Hier stellen wir die Pipeline vor, die wir für die Verfeinerung des metabolischen Netzwerks im Genommaßstab für das Chlamydomonas-Modell unter Verwendung von Phänotyp-Microarray-Daten verwendet haben. Wenn eine neue Verbindung positiv auf die Verwendung getestet wird, werden die relevanten Reaktionsprofile der Verbindung anhand der metabolischen Wissensbasis definiert, wobei die zugehörigen Enzymkommissionsnummern angegeben werden.Der erste Schritt besteht darin, Kegg und MetaCyc zu durchsuchen, um Enzymkommissionsnummern(ECs) nach Reaktionen zu identifizieren, die metabolisierte Wirkstoffe aus den chemischen Verbindungsarrays verwenden. Als nächstes verwenden wir die identifizierten EC-Nummern als Suchbasis in mehreren verfügbaren Algenannotationsressourcen, wie z. B. dem Joint Genome Institute, JGI, Phytozome und Peer-Review-Publikationen. Die Reaktionen und Metaboliten werden dem COBRA-basierten Chlamydomonas reinhardtii-metabolischen Netzwerkmodell iRC1080 hinzugefügt, um das Modell zu erweitern und zu verfeinern.Wenn keine genetischen Beweise zur Unterstützung der EC-Nummer gefunden werden, kann eine profilbasierte Suche wie NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, durchgeführt werden, um Kandidatengene zu identifizieren, die mit der Reaktion assoziiert sind. Die Ergebnisse werden dann manuell ausgewertet. Diejenigen, die diesen QC-Schritt mit E-Werten kleiner als 0,05 für die Relevanz für die Such-EC-Nummern bestehen, werden dann dem Metrikmodell hinzugefügt.Der letzte Schritt dieses Protokolls besteht darin, das Modell zu verfeinern, die Modelle zu bewerten und zu vergleichen. Verwenden Sie die neueste COBRA Toolbox Version 3.0 und die MATLAB-Plattform, um die Schritte zur Modellverfeinerung auszuführen. Nach der Installation der Cobra-Toolbox können Sie das iRC1080-Modell herunterladen.In MATLAB müssen Sie als Erstes zu dem Ordner navigieren, der das Referenzmodell iRC1080 enthält. Fügen Sie die identifizierten Reaktionen mit ihren zugehörigen Genen mithilfe der Funktionen der Cobra-Toolbox zum Stoffwechselmodell hinzu, z. B. iRC1080. Fügen Sie reaktionen hinzu und ändern Sie die Genassoziation.Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das das iRC1080-Modell enthält, und führen Sie die Befehle zum Laden des Modells aus. Benennen Sie es um und fügen Sie eine neue Reaktion und das zugehörige Gen hinzu. In einigen Fällen, in denen der Metabolit nicht intrazellulär produziert wird, sondern aus dem Medium entnommen wird, müssen Transportreaktionen für die neuen Metaboliten dem Modell unter Verwendung der Add-/Exchange-Reaktionsfunktion hinzugefügt werden, um den Metaboliten in das extrazelluläre Medium ein- oder auszugeben.Testen Sie das Verhalten des neuen Ergebnisses und Modells, z. B. iBD1106, indem Sie eine Flussbilanzanalyse, FBA, mit der Funktion CB-Modell unter hell-dunklen Bedingungen optimieren zur Maximierung der Biomasse als Objektfunktion durchführen. Unter anderem gibt die FBA-Lösung drei Vektoren aus, die Reaktionsflüsse, die Metabolitenschattenpreise und die reaktionsreduzierten Kosten. Hier wird ein Beispiel gegeben, bei dem das iRC1080-Modell mit seiner verfeinerten Version, iBD1106, verglichen wird, indem die Schattenpreise ermittelt werden, die die Sensitivität der Biomasse-Zielfunktion gegenüber Veränderungen und Metaboliten darstellen, die in jedem Modell berücksichtigt werden.Hier zeigen wir Aspirations-XY-Plots und Level-Plots der Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen-Assay-Platten für Blank- und CC-503 in blaugrüner Farbe bzw. violett. Innerhalb jeder Vertiefung stellen Atmungskurven die Farbstoffumwandlung durch Reduktion als Funktion der Zeit dar. Der hervorgehobene Peak in Panel A stellt den Nachweis von Acetat als einzige Kohlenstoffquelle aus dieser Platte dar, was mit der Chlamydomonas-Literatur übereinstimmt.Der Vergleich der Anzahl der Metaboliten, die mit drei verschiedenen Methoden identifiziert wurden, iRC1080, dem gut kuratierten Chlamydomonas-Stoffwechselmodell, der Gaschromatographie-Flugzeit GC-TOF und dem Phänotyp-Microarray-Essay, zeigt, dass sich nur sechs Metaboliten zwischen den drei Sätzen überschneiden, während 149 zwischen iRC1080 und dem Phänotyp-Microarray-Assay-Set üblich waren. Dies zeigt, dass, während jede Technologie eine Stärke gegenüber der metabolischen Profiling-Forschung hat, das Phänotyp-Microarray-Assay-Set eine bedeutende Quelle für neue metabolische Informationen sein kann. Die gewonnenen Informationen wurden verwendet, um das metabolische Netzwerkmodell iRC1080 zu erweitern und zu verfeinern.Hier vergleichen wir den Inhalt des iRC1080-Modells und des erweiterten Modells iBD1106, einschließlich der Anzahl der Reaktionen, der Anzahl der Metaboliten und der Anzahl der Gene. Wir zeigen, dass unsere Modellverfeinerung über 254 Reaktionen zum neuen resultierenden Netzwerk hinzugefügt hat. Diese Reaktionen werden in Aminosäuren, Dipeptide, Tripeptide und Transportreaktionen eingeteilt.Die neu identifizierten Metaboliten wurden für die metabolische Netzwerkerweiterung und Verfeinerung des bestehenden Chlamydomonas reinhardtii-Stoffwechselmodells verwendet. Die Phänotyp-Microarray-Assays können verwendet werden, um metabolische Phänotypen bestehender und neu isolierter Stämme zu charakterisieren. Darüber hinaus kann das Protokoll, das wir im Zusammenhang mit Mikroalgen verwendet haben, die Verfeinerung von Stoffwechselmodellen anderer Spezies leiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Die Integration der Mikroalgenkultivierung mit industriellem Rauchgas wird letztendlich Schwermetalle und andere anorganische Verbindungen in das Wachstumsmedium einbringen. In dieser Studie wird ein Verfahren vorgestellt, mit dem das Endschicksal und die Auswirkungen von Schwermetallen und anorganischen Kontaminanten auf das Wachstum von Nannochloropsis salina bestimmt werden können, die in Photobioreaktoren gezüchtet werden.

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Die Zellwandstruktur und die chemischen Eigenschaften von Pflanzen werden bewertet, um ideale Rohstoffe für Biokraftstoffe und Biomaterialien zu identifizieren. Standardmethoden haben Einschränkungen, wenn sie auf große Datensätze angewendet werden. Diese Methoden der Hochdurchsatz-Vorbehandlung, der Enzymverzuckerung und der Pyrolyse-Molekularstrahl-Massenspektrometrie vergleichen eine große Anzahl von Biomasseproben mit geringerem Zeit- und Kostenaufwand.

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