Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse
5. Dezember 2020
Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.
Traditionelle molekulare Studien des Kleinhirns wurden an ganzen Kleinhirnextrakten durchgeführt, die möglicherweise Unterschiede zwischen bestimmten Kleinhirnregionen verschleiern. Dieses Protokoll ermöglicht es, verschiedene Regionen des Kleinhirns getrennt zu beurteilen und molekulare Mechanismen zu erforschen, die ihren einzigartigen Beiträgen zu einer Vielzahl von Verhaltensweisen und dem Fortschreiten der Krankheit zugrunde liegen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die reproduzierbare und schnelle Dissektion von vier Kleinhirnregionen, den tiefen Kleinhirnkernen, der vorderen und hinteren Kleinhirnrinde der Vermis und der Kleinhirnrinde der Hemisphären ermöglicht.
Nachdem Sie die eingeschläferte Maus enthauptet haben, machen Sie einen Schnitt mit einer Rasierklinge entlang der medialen sagittalen Linie des Kopfes, beginnend an der Nase und weiter nach hinten. Trennen Sie die Haut und schneiden Sie mit der Rasierklinge den Muskel auf jeder Seite ab, wobei Sie über die Gehörgänge hinaus schneiden. Schneiden Sie mit einer Präparierschere viele Regionen des Rückenmarks bis zu dem Punkt ab, an dem der Hirnstamm auf das Kleinhirn trifft, und achten Sie darauf, das Kleinhirn nicht zu beschädigen.
Führen Sie eine der Gefäßscherenklingen in den Raum zwischen Hirnstamm und Wirbelsäule ein und schneiden Sie in Richtung Gehörgang, wobei Sie beim Schneiden nach oben heben, um die Schädigung des Gewebes zu begrenzen. Schneide weiter entlang des Schädelrandes bis zu den Riechkolben. Ziehen Sie mit der stumpfen Pinzette vorsichtig die Rückseite dieses Schädels ab, um die hintere Region des Gehirns und des Kleinhirns freizulegen.
Positionieren Sie die stumpfe Pinzette entlang der Schnittkante des Schädels und schälen Sie den Schädel nach oben und über das Gehirn. Schneiden Sie den Rest des Schädels mit der Gefäßschere und der stumpfen Pinzette ab und entfernen Sie den größten Teil davon von der Oberseite des Gehirns. Heben Sie das Gehirn mit dem Mikrospatel leicht an, um die Riechkolben aus dem verbleibenden Schädel zu entfernen und die Fasern des Sehtrakts zu trennen.
Das Gehirn sollte sich an dieser Stelle leicht befreien. Legen Sie das Gehirn in die Petrischale, setzen Sie es auf Eis und entfernen Sie alle verbleibenden Schädel- oder anderen Trümmer. Platzieren Sie das Gehirn vorsichtig mit der dorsalen Seite nach oben in der Gehirnmatrix.
Stellen Sie sicher, dass sie in der Matrix waagerecht eingestellt ist und dass sich die Mittellinie in der Mitte befindet. Platziere eine Rasierklinge entlang der sagittalen Mittellinie und achte darauf, dass die Klinge ganz bis zum unteren Rand der Matrize schiebt. Platzieren Sie eine weitere Rasierklinge einen Millimeter seitlich von der ersten Klinge.
Platzieren Sie zwei weitere Klingen, so dass drei Klingen auf einer Seite des Gehirns platziert werden, die alle einen Millimeter voneinander entfernt sind. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite. Fassen Sie vorsichtig das vordere und hintere Ende der Rasierklingen und heben Sie sie gerade aus der Matrix heraus.
Entsorge das Taschentuch an der Außenseite der Rasierklingen. Trennen Sie langsam eine Rasierklinge nach der anderen von den anderen und achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht zu beschädigen. Schieben Sie den Gewebeschnitt mit dem Mikrospatel von der Rasierklinge auf den Glasschieber.
Es sollten sechs sagittale Hirnschnitte entnommen werden. In den vordersten Seitenabschnitten ist DCN sichtbar. Um das DCN zu isolieren, halten Sie einen Schnitt an der 200-Mikroliter-Pipettenspitze senkrecht über den DCN und drücken Sie ihn fest in alle Richtungen durch das Gewebe nach unten.
Heben Sie die Pipette an und bestätigen Sie visuell, dass sich das Gewebe in der Spitze befindet. Legen Sie einen Finger auf die Spitze und drücken Sie ihn nach unten, wodurch sich das Gewebe ausbeult. Führen Sie die Spitze in ein korrekt beschriftetes Mikrofiche-Röhrchen ein und stellen Sie sicher, dass die Taschentuchstanze am Boden des Röhrchens platziert ist.
Wiederholen Sie dies für die verbleibenden drei Abschnitte, indem Sie die DCN-Stempel in dasselbe Rohr legen. Frosten Sie das Rohr in flüssigem Stickstoff schockfrosten. Schieben Sie den Rest des Hirngewebes um das Kleinhirn herum in den Abschnitten weg, in denen das DCN extrahiert wurde.
Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um diese Abschnitte der Gehirnrinde der Hemisphäre vorsichtig aufzunehmen und sie in die entsprechenden Mikrofiche-Röhrchen zu legen, dann schockfrosten Sie sie ein. Schieben Sie für die letzten beiden vermissten Abschnitte das umgebende Hirngewebe weg, so dass nur das Kleinhirn übrig bleibt. Machen Sie mit einer Rasierklinge einen Schnitt, der die vorderen Schamlippen von den hinteren Schamlippen trennt.
Stellen Sie sicher, dass der Schnitt direkt nach der Bildung von Labial-Sechs erfolgt und Labial-10 nicht umfasst. Legen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die vorderen Kleinhirnrindenschnitte und die hinteren Kleinhirnrindenschnitte in ihre jeweiligen Mikrofiche-Röhrchen und frieren Sie sie schockein, indem Sie die Röhrchen fünf Minuten lang in flüssigem Stickstoff belassen. Legen Sie die Mikrofiche-Röhrchen auf Eis, um ein zu schnelles Auftauen des Gewebes zu verhindern, und tragen Sie 150 Mikroliter kalte RNA-Isolierlösung in das Mikrofiche-Röhrchen auf und homogenisieren Sie sie dann mit einem sterilisierten Stößel.
Sobald das Gewebe homogenisiert ist, pipettieren Sie die Lösung auf und ab, um sicherzustellen, dass kein intaktes Gewebe mehr vorhanden ist. Brechen Sie außerdem kleine Taschentuchstücke auf, indem Sie sie einige Male in eine Insulinspritze ziehen. Fügen Sie weitere 350 Mikroliter des Reagenzes hinzu, pipettieren Sie es auf und ab, um es gründlich zu mischen, und lassen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen.
Geben Sie 150 Mikroliter Chloroform in das Röhrchen und schütteln Sie es kräftig, dann lassen Sie es zwei bis drei Minuten ruhen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12.000 mal G bei 15 Grad Celsius. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und stellen Sie die Temperatur der Zentrifuge auf vier Grad Celsius ein.
Übertragen Sie nur die klare wässrige Phase in ein neues Röhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass die undurchsichtige Zwischenphase nicht unterbrochen wird. Bewahren Sie die restliche Lösung in den Röhrchen auf oder entsorgen Sie sie. Fügen Sie 100% Isopropylalkohol im Verhältnis eins bis zwei hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren.
Lassen Sie die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, um die RNA aus der Lösung auszufällen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius und platzieren Sie alle Röhrchen in der gleichen Ausrichtung, um die Visualisierung des Pellets zu erleichtern. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die Röhrchen und entfernen Sie den Überstand mit der Pipette, wobei Sie darauf achten müssen, dass das Pellet nicht beschädigt wird.
Das Pellet ist gelartig und schwer zu sehen, also schätzen Sie anhand der Ausrichtung der Röhrchen in der Zentrifuge, wo es sich befindet. Nach Entfernen des Überstands 500 Mikroliter 75%iges Ethanol zugeben, kurz vortexen und fünf Minuten lang bei 7.500 G und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu beschädigen.
Lassen Sie die Kappen offen, um die Probe fünf bis 10 Minuten lang zu trocknen. Nach dem Trocknen resuspendieren Sie das Pellet in freiem Wasser der DNA bei 20 Mikrolitern zu den Proben für DCN und 30 Mikrolitern für alle anderen. Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Analyse bei minus 80 Grad Celsius.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um vier verschiedene Regionen des Kleinhirns der Maus zu sezieren und regionale Unterschiede in der Genexpression zu untersuchen. Die Expressionsniveaus von Aldolase C, Parvalbumin und KCNG4 wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR bestimmt. Aldolase C wird im hinteren Kleinhirnvermis stärker exprimiert.
Aber niedriger in der DCN und im vorderen Bereich des Vermis im Vergleich zur zerebellären Dissektion. Parvalbumin ist im Vergleich zu Kleinhirnextrakten in der DCN-Großhirnrinde in ähnlicher Weise im vorderen Vermis, im hinteren Vermis und in der halbkugelförmigen Kleinhirnrinde vorhanden. KCNG4 ist im Vergleich zur Bulk-Extraktion signifikant im DCN und im inneren Vermis angereichert, jedoch nicht im hinteren Vermis oder in der Hemisphäre
.Um die Expression von Aldolase C in der Kleinhirnrinde direkt vergleichen zu können, wurden die Expressionsniveaus mit denen des vorderen Vermis verglichen. Das Expressionsniveau von Aldolase C war in den hinteren Vermis signifikant höher und tendierte in den Kleinhirnhemisphären nach oben. Die aus diesen Regionen extrahierte RNA kann auch in RNA-Sequenzierungsexperimenten verwendet werden.
Ein RNA-Seq-Vergleich, der diese für Kleinhirnregionen vergleicht, würde detailliertere Informationen über die molekularen Mechanismen und die zugrundeliegenden diskreten Funktionen dieser Regionen liefern. Sowie mögliche Unterschiede in ihrer Anfälligkeit für Krankheiten.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur reproduzierbaren und schnellen Dissektion unterschiedlicher Kleinhirnregionen – insbesondere der Hemisphären, der anterioren und posterioren Regionen des Wurms sowie der tiefen Kleinhirnkerne – vor. Ziel ist es, molekulare Unterschiede in der Genexpression aufzuklären, die möglicherweise einzigartigen Verhaltensausgaben zugrunde liegen, die mit spezifischen Kleinhirnregionen assoziiert sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Molekularbiologie
- Genexpression
Hintergrund
- Es ist bekannt, dass das Kleinhirn verschiedene Verhaltensausgänge beeinflusst.
- Traditionelle Studien analysieren häufig Gesamtextrakte des Kleinhirns, wodurch regionale Unterschiede möglicherweise übersehen werden.
- Ein gezielter Ansatz könnte dazu beitragen, spezifische molekulare Mechanismen in einzelnen Kleinhirnarealen aufzudecken.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Isolierung von RNA aus spezifischen Regionen des Kleinhirns.
- Vergleich der Genexpression zwischen den verschiedenen Regionen des Kleinhirns.
- Erleichterung der Untersuchung der molekularen Grundlagen von Verhalten und Krankheiten.
Verwendete Methoden
- Die Methode beinhaltet die Dissektion zerebellärer Regionen von euthanasierten Mäusen.
- Das zentrale biologische Modell umfasst zerebelläre Gewebe von Mäusen.
- Isolierte RNA wird zur Analyse der Genexpression aufbereitet.
- Zu den kritischen Verfahrensschritten gehören eine sorgfältige Dissektion, Schockgefrierung und Homogenisierung des Gewebes.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht die Identifizierung molekularer Unterschiede zwischen verschiedenen Kleinhirnregionen.
- Zu den Ergebnissen zählen Erkenntnisse darüber, wie spezifische Regionen einzigartig zum Verhalten beitragen können.
- Der Prozess erlaubt die Untersuchung von Genexpressionsänderungen, die für die Funktion des Kleinhirns relevant sind.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine neuartige Methode zur Dissektion und Analyse zerebellärer Regionen für molekularbiologische Untersuchungen.
- Der Ansatz trägt zum Verständnis der Beziehung zwischen regionsspezifischen Mechanismen des Kleinhirns und Verhaltensausgängen bei.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten das Wissen über die molekulare Grundlage der Beteiligung des Kleinhirns an verschiedenen Erkrankungen voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die regionale Dissektion des Kleinhirns ermöglicht eine präzise molekulare Analyse einzelner Hirnareale und adressiert damit eine zentrale Einschränkung in der Neurowissenschaftsforschung, bei der Ganzgewebe-Extrakte die funktionelle Heterogenität verdecken. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er Genexpressionsmuster mit spezifischen Kleinhirn-Subregionen verknüpft, die an Bewegung, Kognition, Affekt und Belohnungswegen beteiligt sind. Durch die reproduzierbare Isolierung von Gewebe aus definierten anatomischen Zonen erhöht die Methode das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen und trägt zur mechanistischen Risikominderung in ZNS-Wirkstoffforschungsprogrammen bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem molekulare Signaturmuster aus zerebellären Regionen isoliert werden, die bei der motorischen Steuerung und bei neuropsychiatrischen Funktionen beteiligt sind.
- Operativer Wert: Bietet einen standardisierten Arbeitsablauf zur Dissektion der tiefen zerebellären Kerne, des vermalen Kortex und des hemisphärischen Kortex und verringert so die Variabilität bei nachgeschalteten Omics-Analysen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt regionspezifische RNA-Präparate, die für qPCR und RNA-seq geeignet sind, und ermöglicht den quantitativen Vergleich der Genexpression zwischen verschiedenen Kleinhirn-Teilbereichen.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch Schockgefrieren und einheitliche Homogenisierungsprotokolle und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung regionaler Anfälligkeit in Krankheitsmodellen durch den Vergleich molekularer Profile über anatomisch definierte zerebellare Zonen hinweg.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Biobanklagerung von präparierten Geweben bei −80 °C und unterstützt damit Längsschnittstudien sowie vergleichende Analysen zwischen Experimenten in Pipelines zur Zielvalidierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die hypothesengetriebene Zielidentifizierung sowie die präklinische Validierung, indem sie anatomisch aufgelöste molekulare Daten aus dem Kleinhirn bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung, indem sie die Korrelation der Genexpression (z. B. Aldolase C, Parvalbumin, KCNG4) mit regionaler Kleinhirnfunktion ermöglicht.
- Screening: Erzeugt standardisierte RNA-Extrakte, die eine hochsensible Detektion ermöglichen und somit einen zuverlässigen Vergleich molekularer Zustände unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erleichtern.
- Analytik: Liefert quantitative Auswertungen aus qPCR und RNA-seq, die es Teams ermöglichen, die Zielmolekülbindung und die Modulation von Signalwegen mit regionaler Präzision zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Befunde mit verhaltensbezogenen Phänotypen, indem sie die Analyse von Regionen ermöglicht, die mit Affekt, Kognition und motorischer Koordination in Krankheitsmodellen assoziiert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Präparationsansatz, der auf verschiedene Mausstämme und Krankheitsmodelle übertragbar ist und somit redundante Methodenentwicklung reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Zielvertrauen, indem regionsspezifische molekulare Mechanismen aufgedeckt werden, die in Ganzhirn-Analysen des Kleinhirns verborgen bleiben.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Schritte bei der Dissektion, Einfrierung und RNA-Isolierung und verringert so die technische Varianz.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem mechanistische Klarheit bezüglich kleinhirnbezogener Zielstrukturen geschaffen wird, wodurch das Risiko spätzeitiger Fehlschläge in ZNS-Programmen reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf regionalen Expressionsmustern und Krankheitsrelevanz.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Neuroanatomie und mikrochirurgischen Dissektionstechniken, um eine saubere Trennung der cerebellären Regionen sicherzustellen.
- Ist abhängig vom Zugang zu kryogenen Geräten (flüssiger Stickstoff, −80 °C-Gefrierschrank) und Präzisionswerkzeugen (Vektor-Scheren, stumpfe Pinzette, Mikrospatel) für die Gewebemanipulation.
- Erfordert standardisierte Schulung der Teams, um Konsistenz bei der Einstichtiefe für Gewebeproben und der Identifizierung der Regionen zu gewährleisten.
- Muss den Risiken einer RNA-Degradation Rechnung tragen, indem die Verarbeitungszeit minimiert und die Kühlkette von der Dissektion bis zur Resuspension aufrechterhalten wird.
- Ist durch die geringe Gewebeausbeute aus kleinen Regionen wie dem DCN begrenzt, was eine Optimierung der Inputmengen für nachgeschaltete Anwendungen wie RNA-Seq mit geringem Input erfordert.
