Name: Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Zubereitung von Xenopus laevis Ei-Extrakten und Live-Bildgebung zur Visualisierung zytoplasmatischer Dynamik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung räumlicher Muster und zellulärer Selbstorganisation.

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Wir danken J. Kamenz, Y. Chen und W. Y. C. Huang für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 und R35 GM131792) unterstützt, die James E. Ferrell, Jr.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.
1. Vorbereitung von Dias und Deckgläsern
<ol><li>Tragen Sie eine Schicht fluoriertes Ethylenpropylen (FEP)-Klebeband mit einem Rollenapplikator auf einen Objektträger auf. Schneiden Sie überschüssiges Klebeband über die Kanten mit einer sauberen Rasierklinge ab. Bereiten Sie FEP-bandbeschichtete Deckgläser auf die gleiche Weise vor (Abbildung 1A).</li>
	<li>Tragen Sie einen doppelseitigen, klebrigen Abstandshalter auf die mit FEP-Klebeband beschichtete Seite des Objektträgers auf. Lassen Sie die Schutzfolie auf der Oberseite ungeschält (Abbildung 1A). HINWEIS: Die Objektträger und Deckgläser sollten vor dem Versuch vorbereitet werden. Sie können sofort verwendet oder in Kartons gelagert werden, um Staubansammlungen auf Oberflächen zu verhindern. Die Vertiefung im Abbildungsabstandhalter ist 120 μm tief und hat einen Durchmesser von 9 mm.</li>
</ol>2. Herstellung und Live-Bildgebung von Interphase-Arrest-Ei-Extrakten
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Deming und Kornbluth19, Murray20 und Smythe und Newport25 mit Modifikationen übernommen. Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Drei bis zehn Tage vor der Eizellentnahme reife weibliche Xenopus laevis Frösche subkutan in den dorsalen Lymphsack mit 100 IE trächtigem Stutenserumgonadotropin (PMSG) injizieren.</li>
	<li>Sechzehn bis achtzehn Stunden vor der geplanten Eizellentnahme injizieren Sie den Fröschen aus Schritt 2.1 500 IE humanes Choriongonadotropin (hCG). Frösche bei 18 °C im Eiablagepuffer (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mMMgSO4·7H2O, 2,5 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA) belassen, als 20x Stammlösung bei pH 7,4 vorbereiten und vor Gebrauch mit sauberem Froschtankwasser auf 1x verdünnen) bis zur Eientnahme verdünnen.</li>
	<li>Sammeln Sie am Tag des Experiments Eier in einer großen Glas-Petrischale und beurteilen Sie die Eiqualität. Verwerfen Sie alle Eier, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen oder in einer Schnur erscheinen (Abbildung 1B). Untersuchen Sie die Eier unter einem Stereoskop, behalten Sie die Eier mit normalem Aussehen (Abbildung 1C) und verwerfen Sie die Eier mit unregelmäßigem oder gesprenkeltem Pigment (Abbildung 1D). HINWEIS: Dieses Protokoll funktioniert mit Eiern, die von einem einzelnen Frosch gesammelt wurden, der typischerweise 25 ml Eier bis 16 Stunden nach der hCG-Injektion legt. In der Regel werden insgesamt 3 bis 6 Frösche durch hCG induziert, und für das Extraktpräparationsexperiment wird der Frosch mit der höchsten Eiqualität ausgewählt.</li>
	<li>Die Eier in ein 400-ml-Glasbecherglas geben und durch Dekantieren so viel Eiablagepuffer wie möglich entfernen.</li>
	<li>Die Eier in 100 ml frisch zubereiteter Dejelly-Lösung (2% w/v L-Cystein in Wasser, pH 8,0 mit NaOH) bebrüten und regelmäßig vorsichtig schwenken. Nach etwa 3 Minuten gießen Sie die Lösung ab und fügen Sie 100 ml frische Dejelly-Lösung hinzu. Setzen Sie die Inkubation fort, bis die Eier dicht gepackt sind (kein Abstand zwischen den Eiern), aber vermeiden Sie es, Eier länger als insgesamt 5 Minuten in der Dejelly-Lösung zu lassen.</li>
	<li>Durch Dekantieren wird so viel wie möglich von der Dejelierlösung entfernt und die Eier in 0,25x MMR-Puffer (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, als 10x Stammlösung hergestellt, mit NaOH auf pH 7,8 eingestellt und vor Gebrauch in Milli-Q-Wasser verdünnt) gewaschen. Die Eier schwenken und dann den Puffer abgießen. Wiederholen Sie dies einige Male, bis insgesamt 1 L des Puffers für die Wäschen verwendet wird.</li>
	<li>Waschen Sie die Eier einige Male mit insgesamt 400 ml Eilysepuffer (250 mM Saccharose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, frisch gemacht und mit KOH auf pH 7,7 eingestellt). Entfernen Sie Eier mit ungewöhnlichem Aussehen mit einer Pasteur-Pipette zwischen den Wäschen. HINWEIS: Eier mit abnormalem Aussehen beziehen sich auf solche, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen (Abbildung 1B), eine gesprenkelte Pigmentierung aufweisen (Abbildung 1D), sich mit einer wachsenden weißen Region verschlechtern (Abbildung 1E) oder einen dunklen und kontrahierten pigmentierten Bereich in der tierischen Hemisphäre aufweisen (Abbildung 1F).</li>
	<li>Mit einer Transferpipette mit weit geöffneter Spitze werden die Eier in ein 17-ml-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden überführt, das 1 ml Eilysepuffer enthält. Drehen Sie das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 400 x g für 15 Sekunden, um die Eier zu verpacken.</li>
	<li>Entfernen Sie so viel Eierlysepuffer wie möglich mit einer Pasteur-Pipette von der Oberseite der verpackten Eier. HINWEIS: Es ist wichtig, so viel Puffer wie möglich aus den verpackten Eiern zu entfernen, um die Verdünnung des Eiextrakts zu minimieren. Manchmal ist es notwendig, einige lose Eier zusammen mit dem Restpuffer zu entfernen, um dies zu erreichen.</li>
	<li>Bestimmen Sie das ungefähre Volumen der verpackten Eier und fügen Sie dann 5 μg / ml Aprotinin, 5 μg / ml Leupeptin, 5 μg / ml Cytochalasin B und 50 μg / ml Cycloheximid direkt auf die verpackten Eier hinzu. HINWEIS: Aprotinin und Leupeptin sind Proteaseinhibitoren. Cytochalasin B hemmt die Aktinpolymerisation und verhindert, dass sich der Extrakt zusammenzieht und geliert26. Cycloheximid hemmt die Proteinsynthese und hält so den Extrakt in der Zwischenphase des Zellzyklus.</li>
	<li>Zerkleinern Sie die Eier, indem Sie das Röhrchen bei 12.000 x g, 4 °C, 15 Minuten lang in einem schwingenden Eimerrotor zentrifugieren. HINWEIS: Am Ende der Zentrifugation sollten die Eier gerissen und das Lysat in drei Hauptschichten getrennt sein: eine gelbe Lipidschicht oben, der zytoplasmatische Extrakt (auch Rohextrakt genannt) in der Mitte und eine dunkle dichte Schicht mit den Pigmentkörnern unten (Abbildung 1G).</li>
	<li>Befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel an einer Spritze. Mit der Abschrägung der Nadelspitze nach oben punktieren Sie das Röhrchen von der Seite am Boden der zytoplasmatischen Schicht und gewinnen Sie den Extrakt durch langsames Ziehen. HINWEIS: Ziehen Sie den zytoplasmatischen Extrakt langsam, um die Aufnahme von kontaminierendem Inhalt aus der gelben Lipidschicht zu vermeiden.</li>
	<li>Den gewonnenen zytoplasmatischen Extrakt in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und auf Eis halten. Verwenden Sie den Extrakt innerhalb von 1 Stunde.</li>
	<li>Wenn Sie bereit sind, den Extrakt mit den gewünschten Reagenzien und Fluoreszenz-Bildgebungssonden zu ergänzen. HINWEIS: Fluoreszenzbildgebungssonden markieren spezifische zytoplasmatische Strukturen, so dass sie mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können.</li>
	<li>Entfernen Sie die obere Schutzfolie aus dem Bildabstandshalter auf dem in Schritt 1.2 vorbereiteten Objektträger, und legen Sie etwa 7 μl Extrakt in der Mitte der Vertiefung ab. Tragen Sie das mit FEP-Klebeband beschichtete Deckglas sofort mit der FEP-Seite zum Extrakt auf, um das Bohrloch zu versiegeln. Fahren Sie schnell mit der Bildgebung fort (Abbildung 1H, I).</li>
	<li>Stellen Sie den Objektträger auf ein inverses oder aufrechtes Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und einer Digitalkamera. Bilden Sie die Extrakte an gewünschten räumlichen Positionen und Zeitintervallen sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzkanal ab. HINWEIS: In der Regel wird ein 5x-Objektiv für die Bildgebung verwendet. Der motorisierte Tisch ermöglicht eine automatisierte Bildaufnahme an mehreren definierten räumlichen Positionen. Die Hellfeldmikroskopie visualisiert zytoplasmatische Strukturen mit unterschiedlichen Transparenzgraden. Die Fluoreszenzmikroskopie visualisiert die zytoplasmatischen Strukturen, die von den in Schritt 2.14 hinzugefügten Fluoreszenzbildgebungssonden spezifisch markiert wurden. Die Kamera nimmt Zeitrafferbilder dieser Strukturen auf und erfasst so die Dynamik der zytoplasmatischen Organisation.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li>
<li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF%2C+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li>
<li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li>
<li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li>
<li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li>
<li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+polymerization+dynamics%2C+opposed+motors%2C+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li>
<li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li>
<li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).</li>
<li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly%2C+DNA+replication%2C+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li>
<li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li>
<li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li>
<li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li>
<li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li>
<li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li>
<li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li>
<li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li>
<li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li>
<li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Xenopus laevis Ei-Extrakte haben sich als leistungsfähiges Modellsystem für bildgebende Untersuchungen verschiedener subzellulärer Strukturen 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 und zytoplasmatische Organisation insgesamt herausgestellt </s...

Das Zytoplasma bildet das Hauptvolumen einer Zelle und hat eine ausgeprägte Organisation. Die Inhaltsstoffe des eukaryotischen Zytoplasmas können sich zu einer Vielzahl von räumlichen Strukturen wie Mikrotubuli-Astern und dem Golgi-Apparat zusammensetzen, die wiederum je nach Identität und physiologischem Zustand der Zelle dynamisch angeordnet und umgedreht werden. Das Verständnis der räumlichen Organisation des Zytoplasmas und seiner Verbindung zu zellulären Funktionen ist daher wichtig, um zu verstehen, wie die Zelle funktioniert. Xenopus laevis Ei-Extrakte wurden traditionell für biochemische Massentests 1,2,3,4,5,6,7,8 verwendet, aber neuere Arbeiten etablieren sie als leistungsfähiges Live-Bildgebungssystem für mechanistische Untersuchungen zytoplasmatischer Strukturen und ihrer zellulären Funktionen 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Diese unverdünnten Extrakte bewahren viele Strukturen und Funktionen des Zytoplasmas, während sie eine direkte Manipulation des zytoplasmatischen Inhalts ermöglichen, die in herkömmlichen zellbasierten Modellen nicht möglich sind19,20. Dies macht sie ideal für die Charakterisierung zytoplasmatischer Phänomene und die Analyse ihrer mechanistischen Grundlagen.
Bestehende Methoden zur Bildgebung von Extrakten erfordern chemische Oberflächenmodifikationen oder die Herstellung von mikrofluidischen Geräten. Ein Deckglas-basiertes Verfahren erfordert die Polyethylenglykol (PEG)-Passivierung von Glasdeckgläsern21. Ein mikroemulsionsbasiertes Verfahren erfordert die Gasphasenabscheidung von Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan auf Glasoberflächen22,23. Mikrofluidische Systeme ermöglichen eine präzise Kontrolle des Volumens, der Geometrie und der Zusammensetzung von Extrakttröpfchen, erfordern jedoch spezielle Mikrofabrikationsanlagen11,12,24.
Hier stellen wir eine alternative Methode zur Abbildung von Eiextrakten vor, die einfach zu implementieren ist und leicht verfügbare, kostengünstige Materialien verwendet. Dazu gehört die Vorbereitung einer Bildkammer mit einem Objektträger und einem Deckglas, das mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP)-Band beschichtet ist. Die Kammer kann für die Bildgebung von Extrakten mit einer Vielzahl von Mikroskopiesystemen verwendet werden, einschließlich Stereoskopen und aufrechten und inversen Mikroskopen. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Behandlung von Oberflächen und erreicht gleichzeitig eine ähnliche optische Klarheit, die mit den oben beschriebenen glasbasierten Methoden erzielt wird. Es wurde entwickelt, um eine Schicht von Extrakten mit einer gleichmäßigen Dicke über ein 2D-Feld abzubilden, und kann leicht erweitert werden, um ein 3D-Volumen von Extrakten abzubilden. Es eignet sich gut für die Zeitrafferbildgebung des kollektiven zytoplasmatischen Verhaltens über ein großes Sichtfeld.
Wir haben Interphase-Arrest-Ei-Extrakte verwendet, um unsere bildgebende Methode zu demonstrieren. Die Extraktzubereitung folgt dem Protokoll von Deming und Kornbluth19. Kurz gesagt, Eier, die natürlich in der Metaphase der Meiose II blockiert werden, werden durch einen Spin mit niedriger Geschwindigkeit zerkleinert. Dieser Spin befreit das Zytoplasma aus dem meiotischen Stillstand und ermöglicht es dem Extrakt, in die Interphase überzugehen. Normalerweise wird Cytochalasin B vor dem zerkleinernden Spin hinzugefügt, um die Bildung von F-Aktinen zu hemmen. Es kann jedoch weggelassen werden, wenn F-Aktin gewünscht wird. Cycloheximid wird auch vor dem Zerkleinerungsspin hinzugefügt, um zu verhindern, dass der Interphasenextrakt in die nächste Mitose gelangt. Die Extrakte werden anschließend in die vorgenannten Bildgebungskammern gegeben und auf ein Mikroskop gelegt. Schließlich werden Bilder über die Zeit in definierten Intervallen von einer an das Mikroskop angeschlossenen Kamera aufgenommen, wodurch Zeitraffer-Bildserien entstehen, die das dynamische Verhalten des Extrakts in einem 2D-Feld erfassen.

<table><tbody><tr><td>17 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm quadratisch #1 Deckglas</td><td>Corning</td><td>284522</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>MilliporeSigma</td><td>10236624001</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>MilliporeSigma</td><td>01810</td><td>Proteinsynthesehemmer</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>MilliporeSigma</td><td>C6762</td><td>Aktin Polymerisationsinhibitor</td></tr><tr><td>Weibliches Xenopus laevis Frösche</td><td>Nasco</td><td>LM00535MX</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes HiLyte 488 markiertes Tubulinprotein</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL488M-A</td><td>Zur Visualisierung des Mikrotubuli-Zytoskeletts</td></tr><tr><td>Fluoreszierendes HiLyte 647-markiertes Tubulinprotein</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M-A</td><td>Zur Visualisierung des Mikrotubuli-Zytoskeletts</td></tr><tr><td>Fluoriertes Ethylenpropylen (FEP) optisch klares Klebeband</td><td>CS Hyde Company</td><td>23-FEP-2-5</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Choriongonadotropin (hCG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebender Spacer</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70327-8S</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>MilliporeSigma</td><td>11017101001</td><td>Proteasehemmer</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-100B</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>MilliporeSigma</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7512</td><td>Zur Visualisierung von Mitochondrien</td></tr><tr><td>Trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>BioVendor</td><td>RP1782725000</td><td></td></tr><tr><td>Roller-Applikator</td><td>Amazon</td><td>B07HMBJSP8</td><td>Zum Anbringen des FEP-Tapes auf die Objektträger und Deckgläser</td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Zum Entfernen von überschüssigem FEP-Klebeband</td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus laevis ei-extrakt-zubereitung und live-bildgebungsverfahren zur visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen organisation

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis-Ei-Extrakte, die traditionell für biochemische Massentests verwendet werden, haben sich zu einem leistungsstarken bildgebenden Werkzeug für die Untersuchung zytoplasmatischer Phänomene wie Zytokinese, mitotische Spindelbildung und Aufbau des Kerns entwickelt. Aufbauend auf frühen Methoden, bei denen feste Extrakte abgebildet wurden, die zu spärlichen Zeitpunkten abgetastet wurden, nähern sich neueren Ansätzen Live-Extrakten mit Zeitraffermikroskopie und zeigen dynamischere Merkmale mit verbesserter zeitlicher Auflösung. Diese Methoden erfordern in der Regel anspruchsvolle Oberflächenbehandlungen des bildgebenden Gefäßes. Hier stellen wir eine alternative Methode zur Live-Bildgebung von Ei-Extrakten vor, die keine chemische Oberflächenbehandlung erfordern. Es ist einfach zu implementieren und verwendet massenproduzierte Laborverbrauchsmaterialien für die Bildgebung. Wir beschreiben ein System, das sowohl für die Weitfeld- als auch für die konfokale Mikroskopie eingesetzt werden kann. Es ist für die Abbildung von Extrakten in einem 2-dimensionalen (2D) Feld konzipiert, kann aber leicht auf die Bildgebung in 3D erweitert werden. Es eignet sich gut zur Untersuchung der räumlichen Musterbildung im Zytoplasma. Mit repräsentativen Daten zeigen wir die typische dynamische Organisation von Mikrotubuli, Zellkernen und Mitochondrien in Interphasenextrakten, die mit dieser Methode hergestellt werden. Diese Bilddaten können quantitative Informationen über zytoplasmatische Dynamik und räumliche Organisation liefern.

Xenopus laevis Ei-Extrakte können verwendet werden, um die Selbstorganisation des Zytoplasmas während der Interphase zu untersuchen. Abbildung 2A zeigt die Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments. Wir ergänzten Interphase-Arrest-Extrakte mit demembranierten Xenopus laevis Spermienkernen19 in einer Konzentration von 27 Kernen/μL und 0,38 μM gereinigtem GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (Fusionsprotein bestehend aus Glutathion...

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Diese Methode eignet sich für die Live-Bildgebung der zytoplasmatischen Dynamik mit Froschei-Extrakten, die die Untersuchung von räumlichen Musterinformationen im Zytoplasma ermöglichen. Proben können zu einer Schicht mit einer gleichmäßigen und einstellbaren Dicke geformt und über ein 2D-Feld oder 3D-Volumen abgebildet werden. Diese Methode ist kostengünstig und einfach zu implementieren.Beginnen Sie mit dem Auftragen einer Schicht FEP-Klebeband auf einen Glasobjektträger mit einem Rollenapplikator. Schneiden Sie überschüssiges Klebeband über die Kanten mit einer sauberen Rasierklinge ab. Als nächstes bereiten Sie FEP-bandbeschichtete Deckblätter auf die gleiche Weise vor.Tragen Sie dann einen doppelseitigen, klebrigen Abstandshalter auf die mit FEP-Klebeband beschichtete Seite des Objektträgers auf, wobei die Schutzfolie nicht geschält bleibt. Die Eier in einen 400-Milliliter-Glasbecher geben und durch Dekantieren so viel Eiablagepuffer wie möglich entfernen. Dann die Eier in 100 Milliliter frisch zubereiteter Dejelly-Lösung bebrüten und vorsichtig schwenken.Nach etwa drei Minuten gießen Sie die Lösung ab und fügen Sie 100 Milliliter frische Dejelly-Lösung hinzu. Setzen Sie die Inkubation fort, bis die Eier dicht gepackt sind, aber vermeiden Sie es, Eier länger als insgesamt fünf Minuten in der Dejelly-Lösung zu lassen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Dejelly-Lösung so weit wie möglich und waschen Sie die Eier in 0,25x MMR-Puffer.Die Eier schwenken und dann den Puffer abgießen. Wiederholen Sie dies einige Male, bis insgesamt ein Liter des Puffers für die Wäschen verwendet wird. Als nächstes waschen Sie die Eier einige Male mit insgesamt 400 Milliliter Eilysepuffer und entfernen Sie abnormale Eier zwischen den Wäschen.Verwenden Sie dann eine Transferpipette mit einer breit geschnittenen Spitze, um die Eier in ein 17-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden zu überführen, das einen Milliliter Eilysepuffer enthält. Drehen Sie das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 400 g für 15 Sekunden, um die Eier zu verpacken. Entfernen Sie dann mit einer Pasteur-Pipette so viel Eilysepuffer wie möglich.Bestimmen Sie das ungefähre Volumen der verpackten Eier. Dann fügen Sie je fünf Mikrogramm pro Milliliter Aprotinin, Leupeptin und Cytochalasin B und 50 Mikrogramm pro Milliliter Cyclohexamid direkt auf die verpackten Eier hinzu. Zerkleinern Sie die Eier, indem Sie das Rohr 15 Minuten lang bei 12.000 g und vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimerrotor zentrieren.Als nächstes befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel an einer Spritze. Mit der Nadelspitze nach oben stechen Sie das Röhrchen von der Seite am Boden der zytoplasmatischen Schicht und gewinnen Sie den Extrakt durch langsames Ziehen zurück. Den gewonnenen zytoplasmatischen Extrakt in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und auf Eis halten.Wenn Sie zum Abbilden bereit sind, ergänzen Sie den Extrakt mit den gewünschten Reagenzien und Fluoreszenz-Bildgebungssonden. Entfernen Sie die obere Schutzfolie aus dem Bildabstandshalter auf dem vorbereiteten Objektträger und legen Sie etwa sieben Mikroliter Extrakt in der Mitte des Bohrlochs ab. Tragen Sie sofort den mit FEP-Klebeband beschichteten Abdeckstreifen auf, wobei die FEP-Seite dem Extrakt zugewandt ist, um das Bohrloch zu versiegeln und schnell mit der Bildgebung fortzufahren.Stellen Sie den Objektträger auf ein inverses oder aufrechtes Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und einer Digitalkamera. Bilden Sie die Extrakte an den gewünschten räumlichen Positionen in Zeitintervallen sowohl in hellen Feld- als auch in Fluoreszenzkanälen ab. Ein Zeitrafferexperiment mit Xenopus laevis Ei-Extrakten zur Untersuchung der Selbstorganisation des Zytoplasmas während der Interphase ist hier gezeigt.Nach etwa 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur waren Bereiche mit lichtstreuenden zytoplasmatischen Komponenten sowohl in hellen Feld- als auch in Mitochondrienkanälen sichtbar. Nach etwa 60 Minuten bei Raumtemperatur sollte ein räumliches Muster aus zellartigen Kompartimenten gut etabliert sein, wobei Mikrotubuli eine hohle kranzartige Struktur bilden und Mitochondrien klar in jedes Kompartiment unterteilt sind. Ein Vergleich der Extraktleistung in Bildgebungskammern mit und ohne FEP-Bänder auf Glas wird hier gezeigt.In der Kammer aus FEP-Klebeglas organisiert sich der Extrakt selbst in normale zellartige Muster. In der Kammer, in der die Glasoberflächen nicht vom FEP-Band bedeckt waren, zeigte der Extrakt abnormale helle Feld- und Mikrotubulimuster, die im Laufe der Zeit zunehmend gestört wurden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beim nuklearen Import des GST-mCherry-NLS-Proteins beobachtet.Es ist wichtig, die Glasoberflächen mit FEP-Klebeband zu passivieren und alle schlechten Eier während der Extraktvorbereitung zu entfernen. Mit diesem System können wir die Dicke der Extraktprobe leicht kontrollieren und den Weg für die Abbildung zytoplasmatischer Muster in 3D mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie ebnen.

xenopus-laevis-egg-extract-preparation-live-imaging-methods-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Crude und fraktionierte Xenopus Ei Extrakte können verwendet werden, um Zutaten für die Wiedererrichtung zelluläre Prozesse für die morphologische und biochemische Analyse zu liefern. Egg Lyse und differentielle Zentrifugation werden verwendet, um den Rohextrakt, die wiederum in zur fraktionierten Extrakte und Licht Membranpräparationen vorbereiten.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Xenopus embryonalen Ektoderm hat sich ein attraktives Modell für Studien der Zellpolarität. Ein Assay ist beschrieben, in denen subzellulären Verteilung von fluoreszierenden Proteinen in Ectodermzellen beurteilt wird. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, Fragen im Zusammenhang mit räumlichen Steuerung der Signalisierung.

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Kultivierung neuronalen Explantaten aus...

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

Ein Protokoll für die Live-Darstellung von GFP-markierten Proteine ​​oder autofluoreszierenden Strukturen in den...

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Mechanismen der zellulären und intrazellulären Skalierung bleiben schwer fassbar. Die Verwendung von Xenopus-Embryoextrakten wird immer häufiger, um die Mechanismen der Organellengrößenregulation aufzuklären. Diese Methode beschreibt die Herstellung von Embryonenextrakten und einen neuartigen Kernskalierungsassay, durch den Mechanismen der Kerngrößenregulation identifiziert werden können.

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zur Entwicklung von mukociliären Epithelorganoiden aus tiefen Ektodermzellen, die aus Xenopus laevis Embryonen isoliert sind. Die multipotenten Vorläufer regenerieren epitheliale Kelchenzellvorläufer und ermöglichen eine Live-Tracking der Initiation und Progression der Zellübergänge auf der Oberfläche von Organoiden.

Mukociliäre Epithelorganoide aus Xenopus Embryonal cells: Generation, Culture und High-Resolution Live Imaging

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Erfahren Sie die Zubereitung von Xenopus laevis Ei-Extrakten und Live-Bildgebung zur Visualisierung zytoplasmatischer Dynamik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung räumlicher Muster und zellulärer Selbstorganisation.

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation (Video) | JoVE Journal

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

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