Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation
6. Juni 2021
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .
Diese Methode eignet sich für die Live-Bildgebung der zytoplasmatischen Dynamik mit Froschei-Extrakten, die die Untersuchung von räumlichen Musterinformationen im Zytoplasma ermöglichen. Proben können zu einer Schicht mit einer gleichmäßigen und einstellbaren Dicke geformt und über ein 2D-Feld oder 3D-Volumen abgebildet werden. Diese Methode ist kostengünstig und einfach zu implementieren.
Beginnen Sie mit dem Auftragen einer Schicht FEP-Klebeband auf einen Glasobjektträger mit einem Rollenapplikator. Schneiden Sie überschüssiges Klebeband über die Kanten mit einer sauberen Rasierklinge ab. Als nächstes bereiten Sie FEP-bandbeschichtete Deckblätter auf die gleiche Weise vor.
Tragen Sie dann einen doppelseitigen, klebrigen Abstandshalter auf die mit FEP-Klebeband beschichtete Seite des Objektträgers auf, wobei die Schutzfolie nicht geschält bleibt. Die Eier in einen 400-Milliliter-Glasbecher geben und durch Dekantieren so viel Eiablagepuffer wie möglich entfernen. Dann die Eier in 100 Milliliter frisch zubereiteter Dejelly-Lösung bebrüten und vorsichtig schwenken.
Nach etwa drei Minuten gießen Sie die Lösung ab und fügen Sie 100 Milliliter frische Dejelly-Lösung hinzu. Setzen Sie die Inkubation fort, bis die Eier dicht gepackt sind, aber vermeiden Sie es, Eier länger als insgesamt fünf Minuten in der Dejelly-Lösung zu lassen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Dejelly-Lösung so weit wie möglich und waschen Sie die Eier in 0,25x MMR-Puffer.
Die Eier schwenken und dann den Puffer abgießen. Wiederholen Sie dies einige Male, bis insgesamt ein Liter des Puffers für die Wäschen verwendet wird. Als nächstes waschen Sie die Eier einige Male mit insgesamt 400 Milliliter Eilysepuffer und entfernen Sie abnormale Eier zwischen den Wäschen.
Verwenden Sie dann eine Transferpipette mit einer breit geschnittenen Spitze, um die Eier in ein 17-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden zu überführen, das einen Milliliter Eilysepuffer enthält. Drehen Sie das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 400 g für 15 Sekunden, um die Eier zu verpacken. Entfernen Sie dann mit einer Pasteur-Pipette so viel Eilysepuffer wie möglich.
Bestimmen Sie das ungefähre Volumen der verpackten Eier. Dann fügen Sie je fünf Mikrogramm pro Milliliter Aprotinin, Leupeptin und Cytochalasin B und 50 Mikrogramm pro Milliliter Cyclohexamid direkt auf die verpackten Eier hinzu. Zerkleinern Sie die Eier, indem Sie das Rohr 15 Minuten lang bei 12.000 g und vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimerrotor zentrieren.
Als nächstes befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel an einer Spritze. Mit der Nadelspitze nach oben stechen Sie das Röhrchen von der Seite am Boden der zytoplasmatischen Schicht und gewinnen Sie den Extrakt durch langsames Ziehen zurück. Den gewonnenen zytoplasmatischen Extrakt in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und auf Eis halten.
Wenn Sie zum Abbilden bereit sind, ergänzen Sie den Extrakt mit den gewünschten Reagenzien und Fluoreszenz-Bildgebungssonden. Entfernen Sie die obere Schutzfolie aus dem Bildabstandshalter auf dem vorbereiteten Objektträger und legen Sie etwa sieben Mikroliter Extrakt in der Mitte des Bohrlochs ab. Tragen Sie sofort den mit FEP-Klebeband beschichteten Abdeckstreifen auf, wobei die FEP-Seite dem Extrakt zugewandt ist, um das Bohrloch zu versiegeln und schnell mit der Bildgebung fortzufahren.
Stellen Sie den Objektträger auf ein inverses oder aufrechtes Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und einer Digitalkamera. Bilden Sie die Extrakte an den gewünschten räumlichen Positionen in Zeitintervallen sowohl in hellen Feld- als auch in Fluoreszenzkanälen ab. Ein Zeitrafferexperiment mit Xenopus laevis Ei-Extrakten zur Untersuchung der Selbstorganisation des Zytoplasmas während der Interphase ist hier gezeigt.
Nach etwa 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur waren Bereiche mit lichtstreuenden zytoplasmatischen Komponenten sowohl in hellen Feld- als auch in Mitochondrienkanälen sichtbar. Nach etwa 60 Minuten bei Raumtemperatur sollte ein räumliches Muster aus zellartigen Kompartimenten gut etabliert sein, wobei Mikrotubuli eine hohle kranzartige Struktur bilden und Mitochondrien klar in jedes Kompartiment unterteilt sind. Ein Vergleich der Extraktleistung in Bildgebungskammern mit und ohne FEP-Bänder auf Glas wird hier gezeigt.
In der Kammer aus FEP-Klebeglas organisiert sich der Extrakt selbst in normale zellartige Muster. In der Kammer, in der die Glasoberflächen nicht vom FEP-Band bedeckt waren, zeigte der Extrakt abnormale helle Feld- und Mikrotubulimuster, die im Laufe der Zeit zunehmend gestört wurden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beim nuklearen Import des GST-mCherry-NLS-Proteins beobachtet.
Es ist wichtig, die Glasoberflächen mit FEP-Klebeband zu passivieren und alle schlechten Eier während der Extraktvorbereitung zu entfernen. Mit diesem System können wir die Dicke der Extraktprobe leicht kontrollieren und den Weg für die Abbildung zytoplasmatischer Muster in 3D mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie ebnen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine optimierte Methode zur Herstellung und Live-Bildgebung unverdünnter zytoplasmatischer Extrakte aus Eiern von Xenopus laevis vor. Die Technik ermöglicht die Untersuchung zytoplasmatischer Dynamiken und die Entwicklung räumlicher Muster im Zytoplasma und trägt so zum Verständnis der zellulären Organisation bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Mikroskopie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Die zytoplasmatischen Dynamiken sind entscheidend für das Verständnis der zellulären Organisation.
- Extrakte aus Froscheiern bieten ein geeignetes System, um diese Prozesse zu untersuchen.
- Lebend-Aufnahmetechniken erweitern die Erforschung der räumlichen Musterbildung im Zytoplasma.
Verwendete Methoden
- Herstellung undiluierter zytoplasmatischer Extrakte aus Xenopus laevis-Eiern.
- Verwendung von FEP-Band zur Probensicherung während der Bildgebung.
- Live-Bildgebung unter Anwendung fluoreszenter Marker und Hellfeldmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Selbstorganisation in zytoplasmatischen Extrakten über die Zeit.
- Entwicklung zellähnlicher Kompartimente mit definierten Mikrotubuli-Strukturen.
- Der Vergleich der Abbildungsleistung basierend auf Oberflächenbehandlungen zeigte signifikante Auswirkungen auf die Organisation der Extrakte.
Schlussfolgerungen
- Die Studie beschreibt eine praktische Methode zur Abbildung zytoplasmatischer Strukturen und Dynamiken.
- Die Ergebnisse erweitern unser Verständnis zellulärer Prozesse und unterstreichen die Bedeutung von Probenvorbereitungstechniken.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Live-Bildgebung zytoplasmatischer Dynamiken in Ei-Extrakten von Xenopus laevis und bietet ein skalierbares, kostengünstiges System zur Untersuchung räumlicher Musterbildung und Selbstorganisationsprozesse, die für die zelluläre Organisation relevant sind. Durch den Verzicht auf chemische Oberflächenbehandlungen und die Nutzung von massenweise hergestellten Verbrauchsmaterialien ermöglicht sie eine reproduzierbare, hochauflösende Visualisierung der Organisation von Mikrotubuli, Kernen und Mitochondrien in einer kontrollierten in-vitro-Umgebung. Der Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen in mechanistischen Studien zum zytoplasmatischen Verhalten und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien sowie die Assay-Entwicklung in Entdeckungsplattformen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit der Selbstorganisation des Zytoplasmas und räumlichen Musterbildungsmechanismen zusammenhängen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die dynamische Organisation des Zytoplasmas in einem physiologisch relevanten Extrakt-System sichtbar gemacht wird.
- Translationeller Biomarker: Erleichtert die Identifizierung dynamischer zytoplasmatischer Merkmale, die mit funktionalen zellulären Zuständen korrelieren könnten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Standardisierung: Bietet eine reproduzierbare Plattform zur Herstellung von Extrakten mit einheitlicher Dicke und Stabilität unter Verwendung einer Passivierung mit FEP-Band.
- Quantitative Auswertung: Ermöglicht die Messung zytoplasmatischer Dynamiken und räumlicher Organisation mittels Zeitrafferaufnahmen im Hellfeld und in der Fluoreszenzbildgebung.
- Eignung für Screening: Stellt ein skalierbares, kostengünstiges System bereit, das mit Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie zur Bewertung von Substanzeffekten kompatibel ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevante Systematik: Dient als mechanistisches Modell zur Untersuchung konservierter zytoplasmatischer Prozesse, die für die Zellteilung und -organisation relevant sind.
- Vorhersagevertrauen: Unterstützt die Risikominderung von Zielstrukturen, die an der Zytoskelettregelierung und räumlichen Musterbildung beteiligt sind, durch direkte Visualisierung der Selbstorganisation von Extrakt.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Beobachtungen mit präklinischer Validierung, indem ein konsistentes, bildgebungsgeeignetes zytoplasmatisches Modell etabliert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Hypothesenprüfung des Targets über die Assay-Entwicklung bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für Targets, die die Dynamik des Cytoskeletts und die subzelluläre Organisation beeinflussen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem die direkte Visualisierung der Dynamik von Mikrotubuli und Mitochondrien in Interphasen-Extrakten ermöglicht wird.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Extraktpräparation und stabile Bildgebungsbedingungen ohne chemische Oberflächenbehandlungen.
- Analytik: Erzeugt quantitative räumliche und zeitliche Daten zur zytoplasmatischen Organisation und ermöglicht vergleichende Analysen unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, indem ein konsistentes Modell zur Untersuchung evolutionär konservierter Prozesse der zellulären Organisation bereitgestellt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, kostengünstige Bildgebungsplattform, die an verschiedene Zielstrukturen und Screening-Kampagnen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in Studien zur zytoplasmatischen Organisation verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Extraktpräparation und Oberflächenpassivierung basierend auf FEP-Folie.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine frühzeitige Visualisierung phänotypischer Effekte auf zytoplasmatische Dynamiken ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem mechanistische Einblicke in Verbindungen bereitgestellt werden, die die zelluläre Organisation beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Xenopus-Eiern, in der Herstellung von Extrakten und in lebenden Abbildungstechniken.
- Setzt den Zugang zu Zentrifugen, Mikroskopiesystemen (Weitfeld/Konfokal) sowie FEP-Klebeband und Abbildungsabstandshaltern voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei den Protokollen zum Waschen, Entfernen der Eigelatine und Gewinnen der Extrakte.
- Die Anpassung an die 3D-Bildgebung kann die Integration mit Lichtscheibenmikroskopie und die Optimierung der Kontrolle der Probendicke erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber der Eiqualität und die Notwendigkeit, während der Vorbereitung abnormale Eier zu entfernen, um die Konsistenz der Extrakte sicherzustellen.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
