Name: Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese bei der Ameise Harpegnathos saltator. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Grundlagen von Kommunikation und sozialem Verhalten in eusozialen Insekten.

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Die Autoren danken den Labors von Danny Reinberg und Claude Desplan an der New York University und Jürgen Liebigs Labor an der Arizona State University für ihre Unterstützung bei der Ameisengenetik. Hua Yan dankt der National Science Foundation I/UCRC, dem Center for Arthropod Management Technologies unter der Fördernummer IIP-1821914 und von Industriepartnern. Maya Saar wurde vom United States - Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19 unterstützt.

1. Regelmäßige Pflege von Harpegnathos saltator Kolonien
<ol><li>Pflegen Sie Wildtyp-Kolonien von H. saltator in transparenten Plastikboxen in einem Ameisenaufzuchtraum bei 22-25 ° C und einer Fotoperiode von 12 Stunden Licht: 12 Stunden dunkel (12L: 12D) Beleuchtungsplan.<ol><li>Verwenden Sie kleine Kisten (9,5 x 9,5 cm2), um einzelne Arbeiter oder kleine Kolonien aufzuziehen. Verwenden Sie mittlere Boxen (19 x 13,5 cm 2) oder große Boxen (27 x 19 cm2), um größere Kolonien zu züchten (Abbildung 1).</li>
		<li>Um Nistkästen zu erstellen, verwenden Sie Gips, um Böden für die Kästen herzustellen. Da der nasse Pflaster im Medium und in den großen Kästen trocknet, drücken Sie einen Schaumstoffblock einige Zentimeter tief und einige Zentimeter von der Rückseite des Kastens in den Putz, um einen unteren Nestbereich zu bezeichnen. Sobald der Gips getrocknet ist, bedecken Sie den vorgesehenen Nestbereich mit einem quadratischen Stück Glas. HINWEIS: In kleinen Boxen ist es nicht erforderlich, einen unteren Nestbereich zu bestimmen. Wenn Ameisen es versäumen, die vorgesehene untere Nestregion zu verwenden, kann es hilfreich sein, das Glas mit einem quadratischen Stück rotem Zellophan zu bedecken. Dies erweckt den Eindruck eines dunklen unterirdischen Raums, der Nestern ähnelt, die H. saltator in freier Wildbahn benutzt, und kann sie ermutigen, ihre Brut in die vorgesehene Region zu bringen.</li>
	</ol></li>
	<li>Füttern Sie Kolonien zweimal pro Woche mit lebenden Grillen. HINWEIS: Kolonien sollten so weit gefüttert werden, dass sie alle Grillen vor ihrer nächsten Fütterung verzehren. Füttern Sie alle isolierten Ameisen und mutierten Ameisenkolonien mit Grillen, die von Arbeitern einer regulären Kolonie 2-3 Mal pro Woche gestochen werden.</li>
	<li>Tragen Sie regelmäßig Wasser mit einer Waschflasche auf den Boden des Gipsnistkastens auf. HINWEIS: Das Pflaster sollte feucht genug sein, dass es sich nicht staubig anfühlt, aber es sollte trocken genug sein, dass das gesamte hinzugefügte Wasser vom Pflaster absorbiert wird. Es ist wichtig, dass die Nester nicht übermäßig bewässert werden. Im Durchschnitt benötigen Nistkästen einmal pro Woche eine kleine Menge Wasser.</li>
	<li>Wann immer die Fütterung stattfindet, entfernen Sie Müll und tote Individuen. Frieren Sie alle Abfälle und toten Ameisen über Nacht bei -30 °C ein, bevor Sie diese Materialien als normalen Müll entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie den Kolonien regelmäßig eine Prise getrocknetes Sägemehl hinzu; Dies hilft den Larven bei der Verpuppung und hilft den Arbeitern, den Nistkasten sauber zu halten.</li>
</ol>2. Herstellung von Mikroinjektionsnadeln aus Quarzglas
<ol><li>Verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Glas-Mikroinjektionsnadeln zu ziehen.</li>
	<li>Wählen Sie das zu ziehende Glas aus. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Glas in einer staubfreien und sauberen Umgebung gelagert wurde. HINWEIS: Hier wurde dünnwandiges filamentöses Quarzglas mit einem Außendurchmesser von 1,0 mm, einem Innendurchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 7,5 cm zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln verwendet. Bei der Injektion eines weichen Embryos können auch Borosilikatnadeln anwendbar sein, aber Borosilikatnadeln sind nicht in der Lage, hartes Chorion zu durchdringen.</li>
	<li>Legen Sie die Parametereinstellungen des Pullers fest. Verwenden Sie einen zweistufigen Prozess, um Mikroinjektionsnadeln für H. saltator-Embryonen zu ziehen: Parameter für den ersten Schritt umfassen Hitze von 575, Filament von 3, Geschwindigkeit von 35, Verzögerung von 145 und einen Zug von 75; Zu den Parametern des zweiten Schritts gehören Wärme von 425, Filament von 0, Geschwindigkeit von 15, Verzögerung von 128 und ein Zug von 200. Stellen Sie nach dem zweiten Schritt sicher, dass die resultierende Nadel eine 2-mm-Verjüngung und eine Spitze von 0,5 μm aufweist (Abbildung 2). HINWEIS: Dieser Parametersatz sowie Parameter für andere Nadeltypen finden Sie in der Bedienungsanleitung17. Handbücher für Pipettenzieher enthalten oft empfohlene Parameter für eine Vielzahl von Techniken. Einige Versuche und Irrtümer können erforderlich sein, um zu bestimmen, welche Parameter die besten Nadeln für bestimmte Anforderungen erzeugen. Eine kurze Verjüngung ist ideal für H. saltator-Injektionen, da sie das harte Chorion von H. saltator-Embryonen durchdringen kann . Wenn ein weicher Embryo injiziert wird, z. B. einer, der dechorioniert wurde (z. B. Drosophila), kann eine längere Verjüngung um 10 mm bessere Ergebnisse liefern. Bedienungsanleitungen für Pipettenzieher enthalten in der Regel spezifische Parameter für das Ziehen von Nadeln, die für unterschiedliche Anforderungen geeignet sind. Es ist wichtig, dass beim Umgang mit Glasfilamenten und dem Ziehen von Nadeln Handschuhe getragen werden. Öle aus bloßen Händen können auf das Glas übergehen, wenn keine Handschuhe getragen werden.</li>
	<li>Sobald die Parameter eingestellt sind, verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Nadeln für die Mikroinjektion zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass die Nadeln bis zur Verwendung in einer staubfreien und sauberen Umgebung aufbewahrt werden. HINWEIS: Es wird empfohlen, frisch gezogene Mikroinjektionsnadeln zu verwenden. Wenn vorgezogene Nadeln verwendet werden, sollten sie ordnungsgemäß in einer Box aufbewahrt werden, um eine Beschädigung der Nadelspitzen und eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Nadeln, die einer Langzeitlagerung unterzogen wurden, werden nicht für Embryoinjektionen empfohlen.</li>
</ol>3. Herstellung des Mikroinjektors
<ol><li>Verwenden Sie einen Mikroinjektor, um gewünschte Materialien in Ameisenembryonen zu injizieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Mikroinjektionsmischung aus Cas9-Proteinen und in vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs (sgRNAs) vor10. Halten Sie die Mischung auf Eis, bis es Zeit ist, eine Mikroinjektionsnadel zu laden. Bei Nichtgebrauch das Mikroinjektionsgemisch bei -80 °C lagern. HINWEIS: Die Konzentrationen variieren bei verschiedenen Spezies. Eine hohe Konzentration kann zu einer hohen Mortalität führen, während eine niedrige Konzentration die Effizienz verringern kann. Wir verwenden 0,2 μg/μL Cas9-Proteine und 0,2 μg/μL sgRNAs für die Injektion von H. saltator-Embryonen. Das Design unserer sgRNAs folgte einem zuvor etablierten Protokoll18. Gensequenzen wurden aus DNA-Datenbanken gewonnen. Die Genomsequenz von H. saltator wurde zuvor ebenfalls berichtet19,20.</li>
	<li>Passen Sie die Injektionsparameter für H. saltator-Embryonen an: einen Injektionsdruck von 140 Hektopascal (hPa), einen konstanten Druck von 70 hPa und eine Zeit von 0,4 Sekunden. Stellen Sie den konstanten Druck so ein, dass das Material nur in eine Richtung fließt. Passen Sie den Injektionsdruck und die Injektionszeit nur an, wenn kein Material von der Nadel in den Embryo fließt. HINWEIS: Wenn Sie eine andere Art von Embryo injizieren, ist der primäre Parameter, der sich ändern kann, ein konstanter Druck, der dafür verantwortlich ist, dass Flüssigkeit aus dem Embryo nicht in die Nadel zurückfließt. Die Lautstärke wird in diesem Protokoll nicht gesteuert. Die Einstellung der Parameter des Mikroinjektors reicht aus, um konsistente Injektionen zu erhalten.</li>
	<li>Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit 2 μL der Mischung unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen. Tun Sie dies langsam, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Mischung bilden. HINWEIS: Wenn sich Blasen bilden, kann es schwierig sein, konsistente Mikroinjektionen aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Brechen Sie nur die Spitze der Nadel, indem Sie entlang der Kante des Bandes brechen, so dass eine schmale Verjüngung beibehalten wird. Stellen Sie sicher, dass die Nadel gerade so weit gebrochen ist, dass die Spitze geöffnet wird, aber nicht so sehr, dass die Verjüngung abgebrochen ist. HINWEIS: Wenn die Öffnung der Nadel nach dem Brechen zu breit ist, sieht der Benutzer, dass Flüssigkeit aus der Nadel ausläuft, wenn sie vor der Anwendung des Einspritzdrucks am unter Druck stehenden Mikroinjektor montiert wird. Einige Mikroinjektionsprotokolle empfehlen, Nadeln zu brechen, indem die Spitze mit einer Schere geschnitten wird. Diese Methode wird nicht empfohlen, da eine Schere dazu führen kann, dass die Nadelspitze zerbricht. Die Injektion von Embryonen mit einer zerbrochenen Nadel wird sehr schädlich sein.</li>
	<li>Befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator</li>
</ol>4. Injektion von Embryonen
<ol><li>Wählen Sie Embryonen für die Mikroinjektion aus dem Synzytialstadium aus: die Zeit während der Entwicklung, in der sich die Kerne ohne Zytokinese teilen. HINWEIS: Dies ist der ideale Zeitpunkt während der Entwicklung für die Genom-Editierung durch Mikroinjektion, wie zuvor in Drosophila21 entdeckt. H. saltator-Embryonen passieren das Synzytialstadium und erreichen die Zellular etwa 36 h nach der Eiablagerung10. Eine höhere Effizienz wird erreicht, wenn jüngere Embryonen für Injektionen verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie Embryonen auf ein Stück doppelseitiges Klebeband, das an einem Glasobjektträger befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen gut am Klebeband befestigt sind, um Bewegungen während der Injektion zu verhindern. Legen Sie die Embryonen in eine vertikale Ausrichtung, so dass sich die laterale Seite des Embryos am Rand des Bandes befindet (Abbildung 3). Legen Sie den Objektträger und die ausgekleideten Embryonen an einem dafür vorgesehenen Mikroinjektionsarbeitsplatz auf den Tisch des Mikroskops. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Embryonen so anzuordnen, dass aufeinanderfolgende Injektionen durchgeführt werden können, indem der Objektträger auf der Bühne bewegt wird, anstatt die Nadelposition bei jeder Injektion anzupassen. Dadurch können aufeinanderfolgende Injektionen effizienter durchgeführt werden.</li>
	<li>Richten Sie die Nadel mit dem ersten Embryo aus, der mit dem Mikromanipulator injiziert werden soll (Abbildung 4a).</li>
	<li>Punktieren Sie die Nadel seitlich in den ersten Embryo entlang seiner dorsalen/ventralen Achse unter einem Mikroskop.</li>
	<li>Injizieren Sie die Mikroinjektionsmischung. Achten Sie auf eine leichte Bewegung des Embryos, die auf einen Anstieg des Innendrucks aufgrund der injizierten Flüssigkeit hinweist. Achten Sie außerdem auf die Bildung eines kleinen Tröpfchens mit sichtbaren Spuren von Gewebe und/oder Lipiden auf der äußeren Membran des Embryos (Abbildung 4b). HINWEIS: Das Vorhandensein von Spuren von Gewebe und / oder Lipid im Tröpfchen zeigt an, dass die Nadel erfolgreich sowohl Chorion als auch Vitellinmembran des Embryos punktiert hat. Wenn Spuren dieser Materialien nicht vorhanden sind, wurde die Injektion nicht erfolgreich durchgeführt und sollte wiederholt werden. Nach einigen Sekunden wird das Tröpfchen vom Embryo resorbiert und ist nicht mehr sichtbar.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel sofort vorsichtig vom Embryo und fahren Sie mit der nächsten fort, indem Sie die Position des Objektträgers anpassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen injiziert wurden.</li>
	<li>Sobald alle Embryonen auf dem Objektträger erfolgreich injiziert wurden, geben Sie den Objektträger für 1 Stunde in eine feuchte Box, um den Embryonen Zeit zu geben, sich vom Injektionsprozess zu erholen, bevor sie aus dem Objektträger entfernt werden.</li>
</ol>5. Aufzucht injizierter Embryonen
<ol><li>Nach 1 Stunde Inkubation in einer feuchten Box entfernen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig mit einer federleichten Pinzette vom Band und übertragen Sie sie in ein Röhrchen, das mit einer kleinen Menge von 70% Ethanol gefüllt ist. Drehen Sie die Röhre mehrmals um, um die Embryonen auf den Boden der Röhre zu übertragen. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche einmal, gefolgt von drei Wäschen mit autoklaviertem Wasser.</li>
	<li>Übertragen Sie alle injizierten Embryonen mit einem kleinen und weichen Pinsel auf 1% Agarplatten mit 2% Antibiotikum-Antimykotikum. Tragen Sie das Antibiotikum-Antimykotikum nach dem Abkühlen der gegossenen Agarplatten auf, indem Sie es mit einem Zellspreizer über die Oberfläche der Platte verteilen. Verschließen Sie die Agarplatte mit Parafilm, um das Austrocknen von Agar zu verhindern. HINWEIS: Versuchen Sie nicht, injizierte Embryonen nach Injektionen in eine Kolonie zurückzubringen, da Arbeiter die meisten injizierten Embryonen zerstören können. Das Überleben wird daher optimiert, indem sich Embryonen auf Agarplatten außerhalb einer normalen Kolonieumgebung entwickeln können.</li>
	<li>Die Agarplatten bei 25 °C ca. 4 Wochen inkubieren. Überprüfen Sie regelmäßig das Schlüpfen.</li>
	<li>Sobald der erste Embryo zu einer Larve geschlüpft ist, bringen Sie alle Embryonen und Larven mit ein paar jungen Krankenschwestern in einen Nistkasten zurück, um sich um die Jungtiere zu kümmern. Füttern Sie mit Grillen, die von einer größeren Wildtypkolonie vorgestochen wurden, entfernen Sie Abfallprodukte und fügen Sie Wasser nach dem gleichen Protokoll hinzu, das in Abschnitt 1 beschrieben wird. HINWEIS: Kleine Boxen (9,5 x 9,5 cm2) sind ideal für solche Kolonien. H. saltator vermehrt sich gut in Gefangenschaft. Daher können mutierte Embryonen bis zum Erwachsenenalter aufgezogen werden. Die Isolierung mutierter Erwachsener induziert den Übergang in das reproduktive Gamergate-Stadium. Kontrollierte Kreuzungen werden verwendet, um mutierte Kolonien mit heterozygoten oder homozygoten Individuen zu etablieren (Abbildung 5).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Entwicklung der Eusozialität bei Insekten, einschließlich Ameisen, Bienen, Wespen und Termiten, hat zum Auftreten neuer Verhaltens- und morphologischer Merkmale geführt, von denen viele durch eine Kombination von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst werdensollen 1,2,3,4. Leider wurde die Attraktivität und Nützlichkeit eusozialer Insekten als Forschungsmodelle auf dem Gebiet der Gene...

Die Entwicklung der Eusozialität bei Insekten, insbesondere bei den Ordnungen Hymenoptera und Blattodea (früher Isoptera), hat zu einzigartigen und oft anspruchsvollen Verhaltensmerkmalen geführt, die sich sowohl auf individueller als auch auf Kolonieebene manifestieren. Die reproduktive Arbeitsteilung, ein Merkmal, das die fortgeschrittensten Gruppen sozialer Insekten charakterisiert, beinhaltet oft Kastensysteme, die aus mehreren verhaltensmäßig und oft morphologisch unterschiedlichen Gruppen bestehen. Diese Verhaltens- und morphologische Vielfalt zwischen den Kasten wird nicht nur durch ihr genetisches System, sondern oft auch durch die Umwelt gesteuert 1,2,3,4, was eusoziale Insekten zu attraktiven Subjekten für genetische und epigenetische Forschung macht.
Die Fähigkeit, das genetische System eusozialer Insekten zu manipulieren, hat sich als Herausforderung erwiesen, da sich viele Arten im Labor nicht paaren und vermehren. Die meisten eusozialen Insekten haben auch sehr wenige reproduktive Individuen in einer Kolonie, was die Anzahl der Nachkommen, die produziert werden können, begrenzt und folglich die Stichprobengröße für genetische Manipulation begrenzt5. Darüber hinaus haben viele eusoziale Insekten eine lange Generationszeit im Vergleich zu Insekten, die üblicherweise für genetische Studien verwendet werden (wie Drosophila), was die Schwierigkeit, genetische Linien zu etablieren, erschwert5. Einige eusoziale Arten können jedoch einen großen Anteil an reproduktiv aktiven Individuen in einer Kolonie erzeugen, was die Herausforderungen lindert und Möglichkeiten bietet, mutierte oder transgene Linien zu etablieren.
Im Falle der ponerinen Ameisenart, Harpegnathos saltator, können alle Arbeiterinnen nach dem Tod einer Königin oder sozialer Isolation fortpflanzungsaktiv werden. Diese Arbeiter werden als "Gamergates" bezeichnet und können verwendet werden, um neue Kolonien zu generieren6. Darüber hinaus kann es mehr als ein Gamergate in einer Kolonie geben, wodurch die Nachkommenproduktion 5,7,8 erhöht wird. Bisher wurden mutierte und/oder transgene Linien bei der europäischen Honigbiene, Apis mellifera, und bei den Ameisenarten H. saltator, Ooceraea biroi und Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 entwickelt. . Genetische Analysen bei sozialen Bienen und Ameisen haben den Weg zu einem besseren Verständnis der Eusozialität geebnet und bieten eine Reihe von Möglichkeiten, Gene und ihre Auswirkungen auf eusoziales Insektenverhalten und kastenspezifische Physiologie zu untersuchen.
Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung über das CRISPR/Cas9-System in H. saltator zur Verfügung. Insbesondere wurde diese Technik verwendet, um eine Keimbahnmutation in Orco zu erzeugen, dem Gen, das den obligaten Co-Rezeptor aller Geruchsrezeptoren (ORs) kodiert10. OR-Gene wurden in eusozialen Hymenopteren-Insekten bemerkenswert erweitert16, und ORCO spielt eine wesentliche Rolle bei der Geruchswahrnehmung von Insekten; in seiner Abwesenheit montieren sich OPs nicht oder funktionieren nicht normal. Mutationen des Orco-Gens stören daher die olfaktorische Empfindung, die neuronale Entwicklung und das damit verbundene soziale Verhalten 9,10.
In diesem Protokoll werden Cas9-Proteine und kleine Guide-RNAs (sgRNAs) mittels Mikroinjektion in Ameisenembryonen eingeführt, um die Mutagenese eines Zielgens zu induzieren. Hier werden wir das Mikroinjektionsverfahren im Detail beschreiben, zusammen mit Anweisungen zur Pflege von Kolonien und injizierten Embryonen. Diese Methoden eignen sich zur Induktion der Mutagenese in einer Vielzahl verschiedener Gene bei H. saltator-Ameisen und können auf ein breiteres Spektrum von Hautflügler-Insekten angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Protein mit NLS, hohe Konzentration</td><td>PNA Bio</td><td>CP02</td><td></td></tr><tr><td>Cellophan Roll 20 Zoll X 5 Fuß</td><td>Hypogloss Produkte</td><td>B00254CNJA</td><td>Das Produkt hat viele Farbvariationen. Kaufen Sie es in rot, um es beim Bau von Ameisennestern zu verwenden.</td></tr><tr><td>Eclipse Ci-S aufrechtes Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Ci-S</td><td></td></tr><tr><td>Federleichte Pinzette, schmale Spitze</td><td>BioQuip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet ll Mikroinjektor</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Dieses Produkt wird von Eppendorf nicht mehr verkauft oder unterstützt. Stattdessen kann ein vergleichbarer Mikroinjektor verwendet werden.</td></tr><tr><td>Microloader-Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>930001007 NCBI-Datenbank</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Center for Biotechnology Information</td><td>Gen-ID: 105183395&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>P-2000 Mikropipetten-Abzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffboxen (19 x 13,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>079C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffboxen (27 x 19 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>195C</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffboxen (9,5 x 9,5 cm2)</td><td>Pioneer Plastics</td><td>028C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglas ohne Filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>Q100-50-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere, 8.5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Winsor & Ltd. Newton Cotman Aquarell Serie 111 Synthetikpinsel mit kurzem Griff - Rund #000</td><td>Winsor und Newton</td><td>5301030</td><td></td></tr></tbody></table>

embryo-injektionen für crispr-vermittelte mutagenese im ant harpegnathos saltator

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Die einzigartigen Merkmale eusozialer Insekten, wie Sozialverhalten und reproduktive Arbeitsteilung, werden durch ihr genetisches System gesteuert. Um zu untersuchen, wie Gene soziale Merkmale regulieren, haben wir mutierte Ameisen entwickelt, indem wir den CRISPR-Komplex in junge Embryonen während ihres Synzytialstadiums abgegeben haben. Hier stellen wir ein Protokoll der CRISPR-vermittelten Mutagenese in Harpegnathos saltator zur Verfügung, einer ponerinen Ameisenart, die eine auffällige phänotypische Plastizität aufweist. H. saltator Ameisen werden leicht in einer Laborumgebung aufgezogen. Embryonen werden für die Mikroinjektion mit Cas9-Proteinen und in vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs (sgRNAs) mit hausgemachten Quarznadeln gesammelt. Embryonen nach der Injektion werden außerhalb der Kolonie aufgezogen. Nach dem Schlüpfen der ersten Larve werden alle Embryonen und Larven mit einigen Pflegekräften zur weiteren Entwicklung in einen Nistkasten transportiert. Dieses Protokoll eignet sich zur Induktion der Mutagenese zur Analyse der kastenspezifischen Physiologie und des Sozialverhaltens bei Ameisen, kann aber auch auf ein breiteres Spektrum von Hautflüglern und anderen Insekten angewendet werden.

Mit dem hier bereitgestellten Protokoll wurde die Genom-Editierung in Harpegnathos-saltator-Embryonen erfolgreich durchgeführt. Diese Ergebnisse wurden durch Polymerase-Kettenreaktion und pGEM-Klonierung von DNA validiert, die aus injizierten Embryonen extrahiert wurde, gefolgt von DNA-Sequenzierung. Die Effizienz der somatischen Mutagenese mit diesem Protokoll erreichte etwa 40%. F1-mutierte Männchen wurden mit Wildtyp-Weibchen verpaart, um heterozygote F2-Weibchen zu produziere...

Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, genetisch veränderte Ameisen zu erzeugen, um die Funktion von Genen in Kommunikation und Verhalten in einem sozialen Umfeld zu verstehen. Die Manipulation des genetischen Systems eusozialer Insekten ist eine Herausforderung, da sich viele Arten im Labor nicht paaren und vermehren. Die auffallende Phänotyp-Plastizität im hypernasalen Zellboden der Ameisen ermöglicht es uns, CRISPR-vermittelte Mutantenlinien zu etablieren.Kayli Sieber, Doktorandin aus einem Labor, demonstriert das Verfahren. Pflegen Sie Wildtyp-Kolonien von H.saltator in transparenten Plastikboxen in einem Ameisenaufzuchtraum bei 22 bis 25 Grad Celsius und einem 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkellichtplan. Verwenden Sie kleine Boxen, um einzelne Arbeiter oder kleine Kolonien aufzuziehen, und mittlere oder große Boxen, um größere Kolonien aufzuziehen.Um Nistkästen zu erstellen, verwenden Sie Gips, um die Böden zu machen. Da der nasse Pflaster im Medium und in den großen Kästen trocknet, drücken Sie einen Schaumstoffblock einige Zentimeter tief und einige Zentimeter von der Rückseite des Kastens in den Putz, um einen unteren Nestbereich zu bezeichnen. Sobald der Gips getrocknet ist, bedecken Sie den vorgesehenen Nestbereich mit einem quadratischen Stück Glas.Füttern Sie die Kolonien zweimal pro Woche mit lebenden Grillen und tragen Sie regelmäßig Wasser mit einer Waschflasche auf den Boden des Kunststoff-Nistkastens auf. Wann immer die Fütterung stattfindet, entfernen Sie Müll und tote Individuen. Frieren Sie alle Abfälle und toten Ameisen über Nacht bei minus 30 Grad Celsius ein, bevor Sie diese Materialien als normalen Müll entsorgen.Fügen Sie den Kolonien regelmäßig eine Prise getrocknetes Sägemehl hinzu, um den Larven bei der Verpuppung zu helfen und den Arbeitern zu helfen, den Nistkasten sauber zu halten. Verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Glas-Mikroinjektionsnadeln zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Glas in einer staubfreien und sauberen Umgebung gelagert wurde.Verwenden Sie einen zweistufigen Prozess, um Mikroinjektionsnadeln zu ziehen. Stellen Sie für den ersten Schritt die Wärme auf 575, das Filament auf 3, die Geschwindigkeit auf 35, die Verzögerung auf 145 und den Zug auf 75 ein. Stellen Sie für den zweiten Schritt die Wärme auf 425, das Filament auf 0, die Geschwindigkeit auf 15, die Verzögerung auf 128 und den Zug auf 200.Stellen Sie sicher, dass die resultierende Nadel eine 2-Millimeter-Verjüngung und eine Spitze von 0,5 Mikrometern hat. Nachdem Sie die Nadeln gezogen haben, bewahren Sie sie bis zum Gebrauch in einer staubfreien und sauberen Umgebung auf. Bereiten Sie die Mikroinjektionsmischung aus Caseinproteinen und in-vitro synthetisierten kleinen Guide-RNAs vor.Halten Sie die Mischung auf Eis, bis es Zeit ist, eine Mikroinjektionsnadel zu laden. Bei Nichtgebrauch das Mikroinjektionsgemisch bei minus 80 Grad Celsius lagern. Stellen Sie die Injektionsparameter auf einen Injektionsdruck von 140 Hektopascale, einen konstanten Druck von 70 Hektopascal und eine Zeit von 0,4 Sekunden ein.Stellen Sie den konstanten Druck so ein, dass das Material nur in eine Richtung fließt, und passen Sie den Injektionsdruck und die Zeit nur an, wenn kein Material von der Nadel in den Embryo fließt. Beladen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit zwei Mikrolitern der Mischung unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen. Tun Sie dies langsam, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Mischung bilden.Brechen Sie nur die Spitze der Nadel entlang der Bandkante, so dass eine schmale Verjüngung noch erhalten bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Nadel gerade so weit gebrochen ist, dass die Spitze geöffnet wird, aber nicht so sehr, dass die Verjüngung abgebrochen ist. Dann montieren Sie die Nadel am Mikromanipulator.Wählen Sie Embryonen für die Mikroinjektion aus dem Synzytialstadium aus, bei dem sich die Kerne ohne Zytokinese teilen. Legen Sie die Embryonen auf einer Platte aus doppelseitigem Klebeband aus, die an einem Glasmikroskopobjektträger befestigt ist, und stellen Sie sicher, dass sie gut am Klebeband befestigt sind, um Bewegungen während der Injektion zu verhindern. Legen Sie die Embryonen in eine vertikale Ausrichtung, so dass sich die laterale Seite jedes Embryos am Rand des Bandes befindet.Legen Sie den Objektträger und die ausgekleideten Embryonen an einem dafür vorgesehenen Mikroinjektionsarbeitsplatz auf den Tisch des Mikroskops. Richten Sie die Nadel mit dem ersten Embryo aus, der mit dem Mikromanipulator injiziert wird, und punktieren Sie den ersten Embryo seitlich entlang seiner dorsalen oder ventralen Achse unter einem Mikroskop. Injizieren Sie die Mikroinjektionsmischung und achten Sie auf eine leichte Bewegung des Embryos, was auf einen Anstieg des Innendrucks aufgrund der injizierten Flüssigkeit hinweist.Achten Sie außerdem auf die Bildung eines kleinen Tröpfchens mit sichtbaren Spuren von Gewebe oder Lipiden auf der äußeren Membran des Embryos. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel vom Embryo und fahren Sie mit dem nächsten Embryo fort, indem Sie die Position des Objektträgers anpassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen injiziert wurden.Sobald alle Embryonen auf dem Objektträger erfolgreich injiziert wurden, geben Sie den Objektträger für eine Stunde in eine feuchte Box, um den Embryonen Zeit zu geben, sich zu erholen, bevor sie aus dem Objektträger entnommen werden. Nach der Inkubation waschen Sie den Objektträger mit Ethanol, entfernen Sie die injizierten Embryonen vorsichtig mit einer federleichten Pinzette vom Band und übertragen Sie sie in ein Röhrchen, das mit einer kleinen Menge 70% Ethanol gefüllt ist. Drehen Sie die Röhre mehrmals um.Übertragen Sie alle injizierten Embryonen mit einem kleinen und weichen Pinsel auf 1% Agarplatten mit 2% antibiotischen Antimykotika. Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius für etwa vier Wochen und überprüfen Sie regelmäßig das Schlüpfen. Sobald der erste Embryo zu einer Larve geschlüpft ist, bringen Sie alle Embryonen und Larven mit ein paar jungen Krankenschwestern in einen Nistkasten zurück, um sich um die Jungtiere zu kümmern.Pflegen Sie die Kolonie nach den zuvor demonstrierten Methoden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich Genome Editing in Harpegnathos saltator Embryonen durchzuführen. Die Ergebnisse wurden mittels PCR- und pGEM-Klonierung von DNA validiert, die aus injizierten Embryonen extrahiert wurde, gefolgt von DNA-Sequenzierung.Die Effizienz der somatischen Mutagenese unter Verwendung dieses Protokolls erreichte etwa 40%F1-mutierte Männchen wurden mit Wildtyp-Weibchen verpaart, um heterozygote F2-Weibchen zu produzieren, die, wenn sie nicht gepaart wurden, F3-Männchen produzierten. Mutierte F3-Männchen wurden mit heterozygoten Weibchen verpaart, um F4-homozygote mutierte Weibchen zu erzeugen. Als Ergebnis der erfolgreichen Mutagenese wurden ungewöhnliche Verhaltensweisen beobachtet, die mit dem Verlust des Zielgens korrelierten.Der Verlust von Orco ist mit einem Verlust der Pheromonwahrnehmung, der Unfähigkeit, Beute zu erkennen, einer beeinträchtigten Fruchtbarkeit und dem Abwandern von der Kolonie verbunden. Bei der Durchführung dieses Protokolls müssen Embryoschäden während der Injektion minimiert werden. Dies kann erreicht werden, indem sichergestellt wird, dass die Nadelspitze nicht zu weit geöffnet wird, und indem die Nadel beim Injizieren langsam bewegt wird.Ähnliche Techniken können verwendet werden, um transgene Ameisen zu erzeugen und zu erhalten, die ausgefeiltere Werkzeuge zur Untersuchung neuronaler Aktivität und Verhalten bieten. CRISPR-vermittelte Neurogenese wurde bei anderen eusozialen Insektenarten wie Honigbienen, klonaler Räuberameise und Feuerameisen eingesetzt. Genetische Veränderungen werden die funktionellen Studien zu Entwicklung, Physiologie und Sozialverhalten bei eusozialen Insekten erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Hier stellen wir ein Protokoll zur Injektion von Cricket-Eiern vor, eine Technik, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten im Cricket dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Dieser Artikel demonstriert die CRISPR-Cas9-vermittelte Genomtechnik im Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen (EPN: insektenparasitären) Nematoden, und einem entstehenden genetischen Modell. Die beschriebene Technologie ist nützlich zur Erzeugung von Mutanten und ermöglicht die Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie, die für mutualistische und parasitäre Symbiose relevant sind.

CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien

Diese Studie entwickelte einen Arbeitsablauf zur Erstellung und Pflege stabiler Mutantenlinien für die Süßwasser-Apfelschnecke Pomacea canaliculata. Die Protokolle umfassen die Sammlung von Zygoten, deren Mikroinjektion mit den Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems zur Induzierung der Genom-Editierung, Ex-Ovo-Kultur von Embryonen und Genotypisierung nach kontrollierten Kreuzungen.

Die Goldapfelschnecke Pomacea canaliculata: Von Zygoten zu stabilen mutierten Linien

Lernen Sie Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese bei der Ameise Harpegnathos saltator. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Grundlagen von Kommunikation und sozialem Verhalten in eusozialen Insekten.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

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