Synthese von pH-abhängigem Pyrazol, Imidazol und Isoindolon Dipyrrinon Fluorophoren mit einem Claisen-Schmidt-Kondensationsansatz

Die Claisen-Schmidt-Kondensationsreaktion ist eine uralte Reaktion, die erstmals 1881 von Claisen und Schmidt gleichzeitig berichtet wurde. Es handelt sich um basisunterstützte Enolate, die ein Keton oder Aldehyd, blau dargestellt, zu einem aromatischen Aldehyd in Rot zuteilen. Zunächst führt die Zugabe des Enolates zur Bildung eines Alkohols, wie in den Klammern dargestellt.

Eine anschließende Dehydrierung führt jedoch letztlich zu einem Enon. Da das Aro-Aldehyd keinen Alpha-Wasserstoff enthält, kann es kein Enolate bilden. Als Ergebnis, oft schwache Basen, wie Hydroxid, kann verwendet werden, um das Enolate zu erzeugen.

Die Claisen-Schmidt Kondensation wurde im Laufe der Jahre verwendet, um eine Reihe von Verbindungen zu erzeugen. Es wurde jedoch ausgiebig verwendet, um die aromatischen Ringsysteme der Chalcones und Flavanones zu verbinden, die in Rot und Blau dargestellt sind. Der blaue Teil zeigt an, dass aus dem Enolate abgeleitet und das Rot ist von der aromatischen Portion.

Die Chalcones und Flavanone sind wesentlicher Kern einer Reihe von biologisch aktiven Molekülen, die eine Reihe von Aktivitäten besitzen, wie antibakterielle, antimykotische, entzündungshemmende und Anti-Tumor, je nach Substitutionsmuster. Eine weitere breite Klasse von Molekülen, die aus der Claisen-Schmidt-Kondensationsreaktion entstehen, sind die methin-überbrückten Verbindungen, von denen wir in dieser Studie Beispiele nennen. Unser Labor interessiert sich für fluoreszierende Bestandteile des Pigments Bilirubin, das natürlich ein Abbauprodukt von Häm produziert.

Die Synthese von Bilirubin und vielen seiner Bestandteile dreht sich um die Verdichtung vom Typ Claisen-Schmidt, die in den Strukturen des blauen Eolats und der roten aromatischen Aldehydkomponenten visualisiert werden kann. Typischerweise sind direkte Bestandteile von Bilirubin, wie Dipyrrinone, nicht fluoreszierend. Überbrückt man jedoch die beiden Stickstoffgruppen mit einer Methylen- oder Carbonylgruppe, werden die resultierenden Moleküle hochfluoreszierend, wie im Fall von Xanthoglows.

Normalerweise absorbieren Dipyrrinone UV- oder blaues Licht, was zu einem Z-Bis-E-Isomerisierungsprozess führt. Wie ungekürzte Dipyrrinone absorbieren die N in überbrückten Dipyrrinonen auch UV- oder blaues Licht, unterscheiden sich aber dadurch, dass sie sich in einem aufgeregten Zustand über Fluoreszenz entspannen. Wir haben vor kurzem eine Reihe von Dipyrrinonderivaten entdeckt, die tatsächlich fluoreszieren, ohne eine kovalente Brücke, die die beiden Stickstoffgruppen verbindet.

Stattdessen scheint eine Wasserstoffbindung den Prozess der Z-E-Isomerisierung abzuschrecken, was zu einer Fluoreszenz-Modus führt. Darüber hinaus wurde eine unerwartete Entdeckung gemacht, dass diese Moleküle in Grundlegendenmedien deprotoniert werden können, was zu rot verschobenen Absorptionsemissionsspektren in den deprotonierten Zuständen führt. Folglich können diese Moleküle einen Wert als ratiometrische pH-Sonden haben.

Die fluoreszierenden Dipyrrinonderivate werden verwendet, was eine leichte Anpassung an die traditionelle Claisen-Schmidt-Kondensationsreaktion erzeugt. Dieses Protokoll weicht von der traditionellen Claisen-Schmidt-Kondensationsreaktion ab, da ein aus einem Pyrrolinon oder Isoindolon abgeleitetes Vinylog-Enolate die nucleophile Quelle ist. Das Vinylogous-Enoat fügt entweder ein Pyrazol oder Imidazol-Aldehyd hinzu, um eine kleine Bibliothek von Dipyrrinon-Analoga zu erzeugen.

Das Verfahren, das zum Erstellen dieser Bibliothek verwendet wird, wird im Video veranschaulicht. Analoge Schritte können jedoch verwendet werden, um die traditionelle Claisen-Schmidt-Reaktion durchzuführen. Während die Claisen-Schmidt-Reaktion eine weit verbreitete synthetische Reaktion war und ist, ist dies die erste Videozählung dieser Methode, die wir kennen.

Um sich auf die Synthese eines fluoreszierenden Dipyrrinonanalogons mittels Aldolkondensation vorzubereiten, wiegen Sie gleiche Äquivalente des gewählten Nucleophils und Elektrophilen ab. Dann fügen Sie sie zu einem 25 Milliliter runden Bodenkolben mit einem magnetischen Rührstab hinzu. Messen Sie fünf Milliliter Ethanol mit einem abgestuften Zylinder.

Dann das Ethanol in den runden Bodenkolben geben. Messen Sie 2,4 Milliliter zuvor hergestelltes 10 Molkaliumhydroxid mit einem abgestuften Zylinder. Dann das Kaliumhydroxid in den Kolben geben.

Um den Kolben auf Reflux einzustellen, tragen Sie eine ausreichende Menge Vakuumfett auf das gemahlene Glasgelenk eines Reaktionskondensators auf, um eine Beschlagnahme der gemahlenen Glasfugen zu verhindern. Schließen Sie den Kondensator an eine Kaltwasserversorgung an und befestigen Sie dann das gefettete Gelenk des Kondensators am runden Bodenkolben. Dann legen Sie den Kolben entweder in ein Ölbad oder auf einen Aluminium-Heizblock, der eine konstante Temperatur über thermales Paar mit einem Heißplattenrührer halten kann.

Wärme zu Refluxtemperatur, während die Reaktion zu rühren. Das Reaktionsgemisch sollte durch Dünnschichtchromatographie in einer, drei, sechs, 12 und 24 Stunden überwacht werden, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu messen und den vollständigen Verbrauch der Ausgangsstoffe zu überprüfen. Lassen Sie den Kolben auf Raumtemperatur abkühlen und verdampfen Sie dann das Ethanollösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer.

Legen Sie den Kolben in ein Eisbad und lassen Sie den Kolben im Laufe von fünf Minuten auf die Temperatur des Eisbades ausweichen. Neutralisieren Sie alle verbleibenden Kaliumhydroxid im Kolben, indem Sie 1,7 Milliliter Essigsäure in einer einzigen Portion hinzufügen. Wenn die Kristallbildung nach der Neutralisation aufgetreten ist, dann folgen Sie dem Vakuumfiltrationsreinigungsverfahren.

Wenn keine Kristallbildung beobachtet wurde, dann folgen Sie dem Blitzsäulenchromatographie-Reinigungsverfahren. Legen Sie ein rundes Stück Filterpapier auf den Trichter und befeuchten Sie das Papier mit entionisiertem Wasser leicht, um es am Trichter zu haften. Zur Vorbereitung auf die Vakuumfiltration von Kristallen einen Hirsch- oder Buchner-Trichter mit einem angeschlossenen Gummiadapter in einen Seitenarmkolben einbauen.

Um eine Verstopfung des Filterpapiers zu vermeiden, die die Filtration behindern kann, haben wir einen größeren Hirsch- oder Buchner-Trichter verwendet, als es für ähnliche Skalenfiltrationsprozesse typisch ist. Gießen Sie den Inhalt aus dem runden Bodenkolben über das Filterpapier und lassen Sie die Mischung filtern. Spülen Sie die Kristalle während des Filtrationsprozesses mit 10 Milliliter eiskaltem entionisiertem Wasser.

Nach der Filtration die Kristalle in einen 25 Milliliter runden Bodenkolben übertragen. Tragen Sie eine leichte Schicht Vakuumfett auf einen Hochleistungs-Vakuum-Glasadapter auf und schließen Sie den Adapter an den runden Bodenkolben an. Sichern Sie das Glasgelenk mit einem Keck-Clip.

Um das Hochleistungsvakuum für die Trocknung der Kristalle eines Restlösungsmittels vorzubereiten, kühlen Sie die Glasvakuumfalle mit einer Mischung aus Trockeneis und Aceton ausreichend ab. Schließen Sie eine Hochstrom-Vakuumleitung an den Glasadapter an, der am runden Bodenkolben befestigt ist. Schalten Sie die Hochleistungs-Vakuumpumpe ein und lassen Sie die Kristalle mindestens eine Stunde trocknen.

Sobald die Kristalle unter Vakuum ausreichend getrocknet sind, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lösen Sie die Vakuumdichtung, um den runden Bodenkolben zu entfernen. Wiegen Sie die getrockneten Kristalle, um die Reaktionsprozentausbeute zu melden. Um sich auf die Reinigung mittels Blitzsäulenchromatographie vorzubereiten, fügen Sie die säurebehandelte Mischung, die keine Kristalle aus dem Syntheseverfahren bildet, einem Separatorentrichter hinzu.

Messen Sie 10 Milliliter Dichlormethan mit einem abgestuften Zylinder und verwenden Sie diese, um die säurebehandelte Mischung im Separatorentrichter zu verdünnen. Schließen und schütteln Sie den Trenntrichter vorsichtig, während Sie sicherstellen, dass er häufig entlüftet wird. Anschließend sollten zwei separate Ebenen im Trenntrichter sichtbar sein.

Extrahieren Sie die wässrige Schicht mit zusätzlichen fünf Milliliter Dichlormethan. Führen Sie diesen Schritt zwei weitere Male aus. Kombinieren Sie alle organischen Fraktionen und fügen Sie eine ausreichende Menge an wasserfreiem Natriumsulfat hinzu, um die organischen Fraktionen zu trocknen.

Die getrockneten organischen Fraktionen in einen runden Bodenkolben geben und das Dichlormethan mit einem Rotationsverdampfer entfernen. Den Rest mit weiteren fünf Millilitern Dichlormethan verdünnen. Bereiten Sie eine Säule mit ca. 75 Gramm Kieselgel vor und verwenden Sie diese zur Blitzsäulenchromatographie an der Probe, bei der 10 % Methanol in Dichlormethan als Eluent verwendet wird.

Verdampfen Sie das Eluent aus den gesammelten Fraktionen mit einem Rotationsverdampfer. Bereiten Sie die Hochleistungs-Vakuumpumpe und die Glaslösungsmittelfalle vor, wie zuvor im Vakuumfiltrationsverfahren beschrieben, und lassen Sie den gesammelten Feststoff mindestens eine Stunde lang unter Hochvakuum trocknen. Sobald die Kristalle unter Vakuum ausreichend getrocknet sind, wiegen Sie die getrockneten Kristalle, um die Reaktionsprozentausbeute zu melden.

Um die Struktur der einzelnen Dipyrrinonanaloga in der Bibliothek zu bestätigen, wurden mehrere spektroskopische Methoden in Kombination eingesetzt, darunter Kernspinresonanzspektroskopie, Infrarotspektroskopie und hochauflösende Massenspektrometrie. UV-Vis und fluoreszierende Spektroskopie wurden bei der photophysikalischen Charakterisierung der fluoreszierenden Dipyrrinonanaloga eingesetzt. Mit Hilfe der Kondensationsreaktion Claisen-Schmidt konnten wir eine kleine Bibliothek von 10 Verbindungen synthetisieren, darunter die einer Kontrollverbindung, die keine intermolekularen Wasserstoffbindungen eingehen kann.

Die Erträge für Dipyrrinonanaloga schwankten zwischen etwa 40% und nahezu quantitativ und sind unter jedem Molekül aufgeführt. Die Verbindungen mit den höchsten Quantenerträgen, sowohl in protonierter als auch in deprotonierter Form, wurden aus 2-Formylimidazol abgeleitet und werden in rosa farbengemäßen Boxen dargestellt. Die Kontrollverbindung, die nicht fluoresziert, befindet sich in einer Cyan-Box.

Die Dipyrrinonderivate unter einer Standard-365 Nanometer langen Wellenlängenlampe geben die beobachtete Fluoreszenz. Man kann die rot verschobene Fluoreszenz, die sich aus der Deprotonation ergibt, visuell beobachten. Durch die Farbe der Fläschchen wechseln sie von blau zu cyan in der Farbe.

Für quantitativere Daten über die photophysikalischen und anderen physikalischen Eigenschaften der Dipyrrinonderivate weisen wir die Betrachter an, zwei im schriftlichen Teil des Manuskripts zu unterstellen. Insgesamt bietet die Claisen-Schmidt-Kondensationsreaktion Zugang zu einer Reihe von Methin-verknüpften bizyklischen aromatischen Verbindungen. Es gibt jedoch einige Einschränkungen.

Die Reaktion ist abhängig von der Verwendung eines enolizierbaren Nucleophils und eines nicht enolizierbaren Aldehydelektrophils, wie z. B. eines Aro-Aldehyds, um eine erfolgreiche Kondensation zu durchlaufen. Wenn diese Grundanforderung nicht erfüllt wird, wird der Versuch, diese Reaktion auszuführen, wahrscheinlich dazu führen, dass die Ringsysteme und/oder die Erzeugung konkurrierender Nebenprodukte nicht miteinander verknüpft werden können. Eine weitere Überlegung ist, dass Grundbedingungen für die Erzeugung des Enolatencleophilen verwendet werden, das Inkompatibilitäten mit funktionellen Gruppen erzeugen kann, die anfällig für Reaktionen mit Hydroxid sind.

In solchen Fällen ist es möglich, Hydroxid durch stickstoffhaltige Basen oder Karbonat zu ersetzen, das mit DBU, Triethylamin, Piperidin, Hunig-Basis und Natriumcarbonat erreicht wurde. Wir haben uns einfach für Die Verwendung von Kaliumhydroxid aufgrund seiner Verfügbarkeit und des relativen Aufwands entschieden. Trotz dieser Einschränkungen kann die im Protokoll beschriebene Methode durch eine verfahrenstechnisch einfache und kostengünstige Einschrittreaktion aromatische Ringe für zahlreiche Systeme koppeln.

Bei den von uns synthetisierten Dipyrrinon-Analoga hat die Claisen-Schmidt-Kondensation eine der am besten zugänglichen Wege zu pH-abhängigen Fluorophoren ermöglicht, die bisher beschrieben wurden. Dennoch werden zukünftige Designs von Dipyrrinonanaloga nach dem skizzierten Verfahren entwickelt, um fluoreszierende Verbindungen mit stärkerer intermolekularer Wasserstoffbindungskapazität und niedrigeren pKa-Werten zu erzeugen. Erwarten Sie, dass diese verbesserten pH-abhängigen Sonden höhere Quantenerträge aufweisen und gleichzeitig die Visualisierung von pH-Schwankungen für eine breitere Palette intrazellulärer Ereignisse ermöglichen.