In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

Zu den bestehenden in vitro Methoden zur Untersuchung der Migration von MSCs gehören Transwell- oder Wundheilungsprotokolle. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um die Migration von MSCs zu Explantaten in Echtzeit zu verfolgen. In Bezug auf die Kultur des Explantats besteht der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen darin, dass sie eine Zeit- und Kostenreduzierung sowie eine Vereinfachung der experimentellen Schritte ermöglicht.

Diese Technik kann verwendet werden, um das Homing von Stammzellen zum Ziel in Echtzeit zu beobachten, was zur Entwicklung von Modellen mit optimierter Homing-Effizienz führt. Die Entfernung der Tektorialmembran ist für unerfahrene Forscher schwierig. Je nach Entwicklungsstadium ist es wichtig für den Erfolg dieses Protokolls, den richtigen Zeitpunkt für die Entfernung der Tektorialmembran zu verstehen.

Das Verfahren wird von Dr. Jeong-Eun Park und Dr.Su Hoon Lee, Forscherprofessoren aus meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Sterilisation der Laminar-Flow-Gewebekulturhaube, indem Sie das ultraviolette Licht etwa 30 Minuten lang einschalten. Sprühen Sie alle Oberflächen vor dem Gebrauch mit 70% Ethanol ein und lassen Sie sie trocknen.

Legen Sie die Sezierinstrumente 10 Minuten lang in 70%iges Ethanol und trocknen Sie sie dann vor der Verwendung. Nachdem Sie eine drei bis vier Tage alte Maus geköpft haben, tränken Sie die vorausschauende Maus in 70%igem Ethanol und legen Sie sie unter ein Serienmikroskop in der Laminar-Flow-Haube. Tränken Sie das Gewebe schnell in Gewebedissektionslösung, um das Ethanol zu entfernen.

Schneiden Sie mit der chirurgischen Klinge die Mittellinie des Schädels ab und legen Sie dann den Schädel frei, indem Sie die Haut nach vorne ziehen und den äußeren Gehörgang des Ohrs durchtrennen. Schneiden Sie vom vorderen zum hinteren Teil des Schädels quer über die Augenlinie, öffnen Sie dann den Schädel und entfernen Sie das Vorderhirn, das Kleinhirn und den Hirnstamm mit einer stumpfen Pinzette. Trennen Sie die Cochlea mit einer Mikrozange vom Schläfenbein und geben Sie sie in eine Petrischale mit einer Dissektionslösung.

Präparieren Sie vorsichtig die gesamte Cochlea-Kapsel, sodass nur das innere Cochlea-Weichgewebe übrig bleibt. Halten Sie den Modiolus der Cochlea mit einer Pinzette und den Cochlea-Gang mit einer weiteren Pinzette, dann trennen Sie langsam die beiden Gewebe. Entfernen Sie die Stria vascularis und die Tektorialmembran, indem Sie sie vorsichtig abziehen.

Legen Sie ein sterilisiertes Deckglas aus Kunststoff in eine neue Gewebedissektionslösung, legen Sie dann das Corti-Organ auf das Deckglas und achten Sie darauf, dass die Basilarmembran nach unten zeigt. Ruhigstellen Sie das Gewebe ein, indem Sie die Reissner-Membran und das verbleibende Modiolus-Gewebe mit einer Pinzette auf das Deckglas drücken. Übertragen Sie das Deckglas mit dem eingebetteten Gewebe in die Mitte einer 35 Millimeter großen konfokalen Schale.

Stellen Sie den Glasklonierzylinder mit dem Cochlea-Explantat in der Mitte der Schale auf die Schale und geben Sie 100 Mikroliter Explantat-Kulturmedium in den Zylinder. Geben Sie 5.000 aus dem Knochenmark gewonnene GFP-markierte mesenchymale Stammzellen oder MSCs in zwei Milliliter Kulturmedium außerhalb des Glaszylinders und stellen Sie die Schale in den Inkubator. Nach der Kultivierung der Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben, aspirieren Sie das gesamte Medium innerhalb und außerhalb des Zylinders und entfernen Sie den Glaszylinder aus der Konfokalschale.

Geben Sie zwei Milliliter frisches Nährmedium in die Schüssel. Legen Sie es in einen befeuchteten Inkubator, bis es für die Analyse bereit ist. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskopiesystem mit einem Tischinkubator.

Schalten Sie das konfokale Mikroskop, das Leuchtstoffröhrenlicht und den Computer ein. Stellen Sie die Bedingungen des Inkubators auf der Bühne auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxidatmosphäre ein. Stellen Sie die Probenschale auf das Fixiergefäß für die Schale, decken Sie sie mit dem Schalenfixierdeckel ab und verschließen Sie die Kammer mit dem oberen Heizdeckel.

Passen Sie den Zoom und den Fokus an, um das Organ von Corti und MSCs im Sichtfeld zu lokalisieren. Öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware. Wählen Sie unter der Option "Suchen" ein 20-faches Plan-Apochromat-Objektiv oder eine numerische Apertur von 0,8 und einen 0,5-fachen Zuschnittbereich aus.

Klicken Sie unter Erfassung auf Smart Setup und wählen Sie EGFP. Öffnen Sie die Kanalregisterkarte unter Erfassung und stellen Sie die Laserleistung auf 0,2 %, die Lochblende auf 44 Mikrometer, die Master-Verstärkung auf 750 Volt und die digitale Verstärkung auf 1,0 ein. Klicken Sie unter Imaging-Setup auf ESID und stellen Sie die ESID-Verstärkung auf vier und die digitale Verstärkung auf 7,5 ein.

Klicken Sie auf die Plättchen und setzen Sie, um 210 Plättchen zu produzieren. Öffnen Sie die Fokusstrategie und wählen Sie den Fokusmodus aus. Legen Sie unter Zeitreihen die Dauer auf 24 Stunden und das Intervall auf 10 Minuten fest.

Legen Sie bei der Erfassung die Framegröße auf 512 x 512 Pixel, die Scangeschwindigkeit auf acht, die Richtung auf bidirektional, die Mittelwertbildung auf 4X und die Bits pro Pixel auf 16 fest. Klicken Sie auf Experiment starten, um das Experiment zu starten. Der zweidimensionale Weg der mesenchymalen Stammzellen (MSCs) wurde in einer Wundheilungsmethode verfolgt, indem ein Glaszylinder als Barriere zwischen den MSCs und dem Corti-Organ verwendet wurde.

Als das Corti-Organ kultiviert wurde, wuchsen die Fibroblasten sehr schnell von den äußeren Haarzellen in der äußersten Schicht nach außen. Die meisten GFP-markierten MSCs wurden von schnell wachsenden Fibroblasten verdrängt. Nichtsdestotrotz drangen einige in die Schicht der Fibroblasten ein und wanderten erfolgreich in das Corti-Organ.

Die Ergebnisse der 72-stündigen Inkubation zeigten, dass MSCs in das Corti-Organ migrierten und hauptsächlich im Modiolus und im Bereich mit den vom Modiolus getrennten Cochlea-Nervenfasern lokalisiert waren. Die Morphologie der MSCs wurde in eine radiale Form verändert, die der von Nervenfasern ähnelt. Die Zellen wurden in eine lineare Form entlang der Limbuslinie und nicht im Bereich der Haarzellen transformiert.

Die MSCs waren in der Lage, im Bereich der Nervenfasersammlung zu wandern und zu wachsen, indem sie die verschiedenen Zellschichten und physikalischen Barrieren durchdrangen. Wenn durch eine 16-stündige Behandlung mit Kanamycin eine Schädigung der Haarzellen induziert wurde und die Zellen nach der Entfernung von Kanamycin für weitere 72 Stunden kultiviert wurden, waren MSCs nicht nur im Modiolus, sondern auch in den äußeren Haarzellen lokalisiert. Die Immobilisierung des Gewebes ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll, bei dem das Corti-Organ befestigt wird.

Es fällt nicht so leicht ab. Dies ist ein trivialer, aber hilfreicher Tipp für eine erfolgreiche Explantatkultur. Diese Methode kann angepasst werden, um die Wirksamkeit von Exosomen zu untersuchen, die von MSCs sezerniert werden.