Funktionalisierte spirozyklische Heterocyclensynthese und Zytotoxizitätstest
9. Februar 2021
Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.
Dieses Protokoll verwendet eine recycelbare und modifizierte Methode zur Herstellung spirocyclischer Verbindungen. Der MTT-Assay hilft, die Frage nach der Zytotoxizität dieser neuartigen Moleküle zu beantworten. Diese Technik erzeugt neuartige modifizierbare Moleküle unter Verwendung eines regenerierenden Ausgangsmaterials.
Der MTT-Assay liefert relativ schnelle und einfach zu analysierende biologische Ergebnisse Beginnen Sie mit der Durchführung der Festphasensynthese der spirozyklischen Heterozyklen sechs und sieben, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie 20 Milliliter einer fünf Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung mit sterilem PBS als Verdünnungsmittel vor. Filtern und lagern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius.
Anschließend wird eine Eins-zu-eins-Verdünnung der MTT-Lösung in DMEM hergestellt. Bereiten Sie je einen Milliliter Stammlösungen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Testverbindungen aus DMSO vor. Lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.
Bereiten Sie 200 Mikroliter pro Dosis der Arbeitslösungen von Testverbindungen durch Verdünnen der Stammkonzentrationen vor. Ein bis 1000 in serumfreiem Medium. In den Gewebekultursamen behandelten COS-sieben Zellen in vollständigem Medium auf flachem Boden Gewebekultur 96 Well-Platten mit einer Konzentration von 4.000 Zellen pro 200 Mikroliter pro Well.
Mit einem Mehrkanal-Pipeter. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält. Am nächsten Tag saugen Sie den Überstand aus den Brunnen mit einer Glasweidepipette ab, die an einer Vakuumpumpe befestigt ist.
Dosieren Sie die Zellen dreifach mit den Testverbindungen unter Verwendung der zuvor hergestellten Arbeitslösungen. Dann bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück. Nach 24 Stunden saugen Sie den Überstand aus den Vertiefungen ab und fügen Sie jedem Bohrloch 200 Mikroliter MTT-Lösung hinzu.
Inkubieren Sie die Platte für vier Stunden. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen ab, ohne die violetten Formazankristalle zu stören. Fügen Sie 200 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung hinzu, um die Kristalle aufzulösen.
Anschließend die Platte bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Messen Sie die Absorption für jede Vertiefung bei 590 oder 600 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenleser. Verwenden Sie Vertiefungen ohne Zellen als Hintergrund und mitteln Sie den Absorptionswert.
Die Spirozyklischen Gox-Nähte sechs und sieben wurden mit einem modifizierten Protokoll synthetisiert. Der Verlauf der Reaktion wurde überwacht, indem das Verschwinden der alpha-beta-ungesättigten Esther mittels Infrarotspektroskopie nachgewiesen wurde. Der MTT-Assay wurde zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit verwendet.
Cisplatin, von dem bekannt ist, dass es bei hohen Konzentrationen den Zelltod induziert, diente als Positivkontrolle. Wie erwartet, ist die Zelllebensfähigkeit umso geringer, je höher die Konzentration von Cisplatin ist. Der MTT-Assay wurde dann verwendet, um die spirocyclischen Verbindungen sechs und sieben und Furfurylamin zu testen.
Furfurylamin und spirozyklische Gox-Naht sechs zeigten eine ähnliche Zytotoxizität. Die Toxizität der spirocyclischen Verbindung sieben war jedoch deutlich größer als die von Furfurylamin und sechs. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die N-Alkylierung unter Verwendung sperriger Acylhalogenide die Beta-Eliminationsrate reduziert und somit die Produktausbeute verringert.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Beurteilung der Zytotoxizität neuartiger spirozyklischer Oxime mittels des MTT-Assays. Das Protokoll legt den Schwerpunkt auf die Festphasensynthese und bewertet die Vitalität von mit den synthetisierten Verbindungen behandelten COS7-Zellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Bioassays
- Toxizitätstestung
- Synthese spirocyclischer Verbindungen
Hintergrund
- Forschung zu spirocyclischen Verbindungen
- Bedeutung der Zytotoxizität in der Arzneimittelentwicklung
- Anwendung des MTT-Assays als zuverlässige Methode
Verwendete Methoden
- Festphasensynthese von spirocyclischen Heterocyclen
- COS7-Zelllinie als biologisches Modell
- MTT-Assay zur Bestimmung der Zellviabilität
Hauptergebnisse
- Vergleich der zytotoxischen Wirkungen von spirocyclischen Verbindungen und Furfurylamin
- Die Beobachtungen zeigten, dass die spirocyclische Verbindung sieben eine höhere Toxizität aufwies als die anderen
- Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von Cisplatin als positiver Kontrolle validiert
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt die Wirksamkeit von spirocyclischen Verbindungen bei der Induktion des Zelltods auf
- Die Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse für die Krebsforschung und die Arzneimittelentwicklung
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Arbeit stellt eine optimierte Festphasensynthese für spirocyclische Heterocycle vor, die die Anzahl der Syntheseschritte reduziert und toxische Reagenzien eliminiert, wodurch die Effizienz bei der Identifizierung von Leitstrukturen in der onkologischen Wirkstoffforschung verbessert wird. Der MTT-Assay ermöglicht eine schnelle, quantitative Untersuchung der zytotoxischen Wirkung von mikromolaren Verbindungskonzentrationen und unterstützt so die frühe Zielvalidierung sowie die mechanistische Entschärfung von Risiken. Zusammen verbessern diese Methoden die Vorhersagegenauigkeit bei der Priorisierung spirocyclischer Gerüste für weitere präklinische Evaluierungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung zytotoxischer Wirkungen neuartiger spirocyclischer Heterocycle zur Bewertung der Tragfähigkeit therapeutischer Hypothesen.
- Operativer Wert: Die Festphasensynthese an einer schwach beladenen REM-Linker-Harz ermöglicht die Einführung voluminöser aromatischer Seitenketten und erweitert so die chemische Diversität für Target-Bindungsstudien.
- Prädiktiver Wert: Zytotoxizitätsdaten aus dem MTT-Assay unterstützen Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie die Induktion von Zelltod relativ zur Cisplatin-Kontrolle quantifizieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Der MTT-Assay liefert eine reproduzierbare, farbmetrische Messung der Zellviabilität in COS7-Zellen, die mit Testsubstanzen behandelt wurden.
- Operativer Wert: Das kommerziell verfügbare MTT-Reagenz und ein unkomplizierter Protokoll ermöglichen die Kompatibilität mit Hochdurchsatz-Screenings.
- Bereitschaft des Assays: Arbeitslösungen, die in DMSO hergestellt und in serumfreiem Medium verdünnt werden, gewährleisten eine konsistente Applikation der Verbindungen über alle Wiederholungen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationskontinuität: Die zytotoxische Profilierung von spirocyclischen Verbindungen und Furfurylamin schafft eine Struktur-Wirkungs-Beziehung als Grundlage für die nachfolgende Optimierung.
- Präklinische Relevanz: Die beobachtete differenzielle Toxizität – insbesondere die erhöhte Zytotoxizität der spirocyclischen Verbindung sieben – unterstützt die identifizierung wirksamer Wirkstoffe basierend auf SAR.
- Mechanistische Ent风险ung: Die Verwendung von Cisplatin als positivem Kontrollmittel bestätigt die Empfindlichkeit des Assays und stärkt das Vertrauen in die spezifischen Effekte der Verbindungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der integrierte Arbeitsablauf positioniert die Festphasensynthese, gefolgt von einer auf MTT basierenden zytotoxischen Screening-Methode, als Brücke von der Entdeckung bis zur präklinischen Bewertung heterozyklischer Verbindungen in der Onkologie.
- Entdeckungsbiochemie: Die Festphasensynthese ermöglicht die schnelle Erzeugung modifizierbarer spirocyclischer Grundgerüste für die Hypothesenprüfung und die Untersuchung von Signalwegen.
- Screening: Der MTT-Assay liefert quantitative, endpunktbasierte Messungen der Zellviabilität, um die Wirkstärke und Selektivität von Verbindungen zu vergleichen.
- Analytik: Absorptionsmessungen bei 590–600 nm, normiert auf leere Wells, liefern zuverlässige Daten zur Abschätzung des IC50-Werts für die Struktur-Wirkungs-Modellierung.
- Translationale Forschung: Die Rangfolge der Zytotoxizität von Verbindungen (z. B. Verbindung sieben > sechs ≈ Furfurylamin) dient der Priorisierung für anschließende mechanistische Untersuchungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Festphasenplattform und der MTT-Assay sind auf heterocyclische Bibliotheken übertragbar und unterstützen eine wiederverwendbare Entdeckungsinfrastruktur.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Die Verringerung der Anzahl an Syntheseschritten und der Verzicht auf toxische Reagenzien verbessern die Sicherheit und Skalierbarkeit der Routen für die Bibliothekssynthese.
- Operationeller Wert: Harze mit niedriger Beladung an REM-Linkern ermöglichen die Verträglichkeit mit sterisch anspruchsvollen Substituenten und erhöhen so die Erfolgsraten bei der Synthese vielfältiger Chemotypen.
- Strategischer Wert: Die zytotoxische Profilierung beschleunigt die Identifizierung wirksamer spirozyklischer Treffer und verringert das Risiko von Ausscheiden in späteren Entwicklungsphasen.
- Portfolio-Wirkung: Quantitative Vitalitätsdaten unterstützen die risikoadjustierte Priorisierung spirozyklischer Kandidaten für die Optimierung in der medizinischen Chemie.
Durchführungsaspekte
- Es sind Kenntnisse in der Festphasen-Organischen Synthese und im Umgang mit Zellkulturen erforderlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Zur Ausstattung gehören ein 96-Well-Plattenreader, der Absorptionsmessungen im Bereich von 590–600 nm ermöglicht, sowie eine Zellkulturwerkbank zur sterilen Applikation von Verbindungen.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen erfordert eine einheitliche Herstellung der MTT-Lösung, Lagerung bei –20 °C und dreifache Dosierprotokolle.
- Die Übertragung auf andere Modellsysteme kann eine Optimierung der Zellsaatdichte und der Inkubationszeiten entsprechend der Proliferationsraten erforderlich machen.
- Sperrige Acylhalogenide in N-Alkylierungsschritten können die Beta-Eliminationsrate verringern und die Produktausbeute senken, wie im Protokoll beschrieben.
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