Name: Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Lernen Sie die präzise Quantifizierung von Nukleosiden und Nukleotiden in Pflanzen mittels HPLC-MS/MS. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht schnelle Analysen und liefert wertvolle Einblicke in den pflanzlichen Stoffwechsel.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten (KJQN202060), die National Natural Science Foundation of China (31900907), die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20190528), das International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) bis M.C. und die Fundamental Research Funds for the Central Universities (LGZD202004) bis X.L.

1 Pflanzenwachstum und Materialsammlung
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass Arabidopsis-Samen für 10 Minuten in 70% Ethanol sterilisiert und auf die Agarplatten gesät werden, die mit halbstarken Murashige- und Skoog-Nährstoffen zubereitet wurden.</li>
	<li>Die Platten, die Arabidopsis-Samen enthalten, werden 48 h lang unter Dunkel bei 4 °C inkubiert und dann in eine kontrollierte Wachstumskammer unter 16 h Licht von 55 μmolm-2 s-1 bei 22 °C und 8 h dunkel bei 20 °C überführen.</li>
	<li>Ernten Sie 100 mg 2-wöchige Sämlinge (Frischgewicht) und frieren Sie in flüssigem Stickstoff für die Metabolitenextraktion ein. VORSICHT: Forscher sollten handschuhe, schutzbrillen und einen Laborkittel angemessen tragen, um die Kontamination des menschlichen Gewebes während der Materialsammlung zu vermeiden.</li>
</ol>2 Nukleoside/Nukleotidextraktion
<ol><li>100 mg gefrorenes Pflanzengewebe mit 7-8 Stahlperlen in einer vorkalten Mischermühle für 5 min bei einer Frequenz von 60 Hz gemahlen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Extraktionslösung vor, die Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1 enthält.</li>
	<li>Die homogenisierten Materialien (einschließlich der meisten Metaboliten, aber nicht der Proteine) werden mit 1 ml Extraktionslösung resuspendiert.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>0,5 ml der Suspension in ein neues 1,5 ml Röhrchen geben und im flüssigen Stickstoff einfrieren.</li>
	<li>Die gefrorene Probe in einem Gefrierfärber verdampfen und in 0,1 ml 5% Acetonitril und 95% Wasser wieder auffüllen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung (0,1 ml) bei 40.000 x g für 10 min bei 4 °C. Laden Sie den Überstand zur LC-MS/MS-Messung in eine Durchstechflasche.</li>
</ol>3 LC-MS/MS Messung
<ol><li>Bereiten Sie einen 10 mM Ammoniumacetatpuffer vor, indem Sie 1,1 g Ammoniumacetat in 2 L doppelt deionisiertem Wasser (mobile Phase A) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 9,5 x 10% Ammonium- und Acetatsäure ein.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 L hochreines 100% Methanol (mobile Phase B1) für die Nukleosidemessung vor. Bereiten Sie auch 2 L hochreines 100% Acetonitril (Mobile Phase B2) für die Nukleotidmessung vor.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,02 ml vorbehandelte Metabolitenextraktion jeder Probe aus Schritt 2.7 in ein HPLC-System mit Binärenpumpen (LC) in Verbindung mit einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (MS). ACHTUNG: Das HPLC-System verwendet eine C18-Säule (50 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm; arbeitet bei 25 °C) Pufferung mit mobiler Phase A und B1 (Abbildung 1A) für die Nukleosidentrennung und verwendet eine poröse Graphitkohlenstoffsäule (PGC) (50 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm; arbeitet bei 25 °C) mit mobiler Phase A und B2 (Abbildung 1B) für die Nukleotidabscheidung. Jede Probe wurde dreimal für die technische Replikation injiziert.</li>
	<li>Programmieren Sie die Methode wie in Tabelle 1 für die Spalte C18 und die Methode wie in Tabelle 2 für die SPALTE PGC dargestellt. Stellen Sie eine Durchflussrate von 0,65 mL min-1 ein. HINWEIS: Die Massenübergänge (Tabelle 3) wurden mit einem Massenspektrometer überwacht. Die Massenspektrumanalysebedingungen von acht Nukleotiden und fünf Nukleotiden, die kanonische und modifizierte Nukleoside enthalten, sind in Tabelle 3aufgeführt.</li>
	<li>Erfassen Sie die Spitzenbereiche jeder Zielverbindung (Abbildung 1).</li>
</ol>4 Generierung der Standard-Kalibrierkurven
<ol><li>Sechs Probenextraktionen, die nach der Beschreibung in Abschnitt 2 hergestellt wurden, bündeln und vortexieren. Dann aliquot es wieder auf sechs Extraktionen (gleiches Volumen), um jeden Hintergrund zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie diesen sechs Extraktionen jeweils sechs verschiedene Konzentrationen jedes Standards hinzu und injizieren Sie sie nach Schritt 3.3 nacheinander.</li>
	<li>Erfassen Sie die Spitzenbereiche jedes Standards in unterschiedlichen Konzentrationen über die Massenübergänge, wie in den Schritten 3.4 und 3.5 beschrieben.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Peakfläche gegen die Nominalkonzentration jedes Standards auf, um eine Sechs-Punkte-Kurve zu erzeugen. HINWEIS: Die in Schritt 3.5 erfassten Spitzenbereiche von Nukleosiden/Nukleotiden sollten in den Bereich der Standardkalibrierungskurven fallen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Gleichung einer geraden Linie für jede Standardverbindung: Y = aX + b</li>
</ol>5 Quantifizierung der Metaboliten
<ol><li>Berechnen Sie den Inhalt der Metaboliten anhand der in Schritt 3.5 aufgezeichneten Peakfläche und der Gleichung aus Schritt 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Organismen enthalten verschiedene Nukleoside/ Nukleotide, einschließlich kanonischer und abweichender. Der Ursprung und die metabolischen Endpunkte von ihnen, insbesondere modifizierte Nukleoside, sind jedoch noch unklar. Darüber hinaus muss das aktuelle Verständnis der Funktion und Homöostase des Nukleoside/Nukleotidstoffwechsels noch erforscht und erweitert werden. Um sie zu untersuchen, muss eine präzise und goldstandardhafte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Metaboliten eingesetzt werden. Hier ha...

Nukleoside/ Nukleotide sind zentrale Stoffwechselkomponenten in allen lebenden Organismen, die die Vorläufer für Nukleinsäuren und viele Coenzyme wie Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) sind und wichtig für die Synthese von Makromolekülen wie Phospholipiden, Glykolipiden und Polysacchariden sind. Strukturell enthält Nukleosid eine Nukleobase, die ein Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin oder Thymin sein kann, und einen Zuckerteil, der eine Ribose oder eine Desoxyribose1,2sein kann. Nukleotide haben bis zu drei Phosphatgruppen, die an die 5-Kohlenstoff-Position des Zuckerteils der Nukleosidebinden 3. Der Stoffwechsel von Nukleotiden in Pflanzen ist essentiell für die Samenkeimung und das Blattwachstum4,5,6. Um ihre physiologische Rolle in der Pflanzenentwicklung besser zu verstehen, sollten die Methoden zur absoluten Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide in vivo etabliert werden.
Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze zur Messung von Nukleosiden/ Nukleotiden verwendet eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit einem ultraviolett-sichtbaren (UV-VIS)Detektor 4,7,8,9,10,11. Im Jahr 2013 quantifizierten Dahncke und Witte mit HPLC verschiedene Arten der Nukleoside in Arabidopsis thaliana7. Sie identifizierten einen erhöhten Guanosingehalt in einer T-DNA-Insertionsmutante, die auf das Guanosin-Deaminase-Gen abzielt, verglichen mit der Wildtyppflanze. Ein weiteres Pyrimidinnukleosid, Cytidin, wurde ebenfalls quantitativ in Pflanzen nachgewiesen, die diese Methode anwenden, was zur Identifizierung eines echten Cytidin-Deaminase-Gens4führte. Basierend auf dem UV-Detektor kann diese Methode jedoch nicht leicht die Nukleoside unterscheiden, die ähnliche Spektren und Retentionszeiten aufweisen, z. B. Guanosin oder Xanthosin. Die Nachweisgrenze der HPLC-Methode ist relativ hoch, daher wird sie häufig für die Messung eines hohen Gehalts an Nukleosiden in vivo wie Cytidin, Uridin und Guanosin verwendet.
Darüber hinaus kann die gaschromatographische gekoppelte Massenspektrometrie (GC-MS) auch in der Nukleosidmessung eingesetzt werden. Davon profitieren Hauck et. al. erfolgreich Uridin und Harnsäure, die ein nachgeschalteter Metabolit des Nukleosid-Katabolweges ist, in den Samen von A. thaliana12nachgewiesen wurden. GC wird jedoch normalerweise zur Trennung flüchtiger Verbindungen verwendet, ist jedoch nicht für die thermisch labilen Substanzen geeignet. Daher ist eine mit der Massenspektrometrie gekoppelte Flüssigkeitschromatographie (LC-MS/MS) wahrscheinlich eine geeignetere und genauere Analysetechnik zur In-vivo-Identifizierung, Trennung und Quantifizierung der Nukleoside/Nukleotide13,14. Mehrere frühere Studien berichteten, dass eine HILIC-Säule für Nukleoside und Nukleotide-Trennung15,16 verwendet werden kann und isotopisch markierte interne Standards für die Compound-Quantifizierung17verwendet wurden. Beide Komponenten sind jedoch relativ teuer, insbesondere die kommerziellen isotopenmarkierten Standards. Hier berichten wir über einen wirtschaftlich anwendbaren LC-MS/MS-Ansatz zur Nukleoside/Nukleotid-Messung. Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide, einschließlich ATP, N6-Methyl-AMP, AMP, GMP, Uridin, Cytidin und Pseudouridin1, 5,6,18, in Pflanzen und Drosophilaeingesetzt. Darüber hinaus kann die Methode, über die wir hier berichten, auch in anderen Organismen angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>ammonium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>cytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hypercarb column</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-methyladenosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-methylguanosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 5 C18A column</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseudouridine</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

pflanzenprobenvorbereitung zur messung des nukleosid-/nukleotidgehalts mit einer hplc-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nukleoside/Nukleotide sind Bausteine von Nukleinsäuren, Teilen von Cosubstraten und Coenzymen, Zellsignalmolekülen und Energieträgern, die an vielen Zellaktivitäten beteiligt sind. Hier beschreiben wir eine schnelle und zuverlässige Methode zur absoluten Qualifizierung von Nukleosid-/Nukleotidgehalten in Pflanzen. Kurz gesagt, 100 mg homogenisiertes Pflanzenmaterial wurden mit 1 ml Extraktionspuffer (Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1) extrahiert. Später wurde die Probe fünfmal in einem Gefriertrockner konzentriert und dann in eine HPLC-MS/MS injiziert. Nukleotide wurden auf einer porösen Graphitkohlenstoffsäule (PGC) und Nukleoside auf einer C18-Säule getrennt. Die Massenübergänge jedes Nukleosids und Nukleotids wurden massenspektrometisch überwacht. Die Gehalte der Nukleoside und Nukleotide wurden anhand ihrer externen Standards (ESTDs) quantifiziert. Mit dieser Methode können Forscher daher Nukleoside/Nukleotide in verschiedenen Pflanzen leicht quantifizieren.

Hier zeigen wir beispielsweise die Identifizierungund Quantifizierung von N1-Methyladenosin, einem bekannten modifizierten Nukleosid, in 2 Wochen alten Arabidopsis Wildtyp -Sämlingen (Col-0). Das Massenspektrometrieprofil zeigt an, dass dieaus dem N1-Methyladenosin-Standard erzeugten Produktionen 150 m/z und 133 m/z betragen (Abbildung 2A), und das gleiche Profil wird auch bei der Col-0-Extraktion beobachtet (<strong class="xfig...

Eine präzise und reproduzierbare Methode zur in vivo Nukleoside/Nukleotidquantifizierung in Pflanzen wird hier beschrieben. Diese Methode verwendet eine HPLC-MS/MS.

Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Nukleoside und Nukleotide sind zentrale Stoffwechselkomponenten in allen lebenden Organismen. Der Stoffwechsel von ihnen ist für die Zellentwicklung erforderlich. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Quantifizierung dieser Metaboliten.Diese Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Quantifizierung von Nukleotiden und Nukleotiden in Pflanzen. Komplette Probenvorbehandlungen und LC-MS/MS-Analysen dauern etwa zwei Tage für einen Satz von 10 bis 20 Proben. Diese Methode kann auf alle Pflanzen und sogar andere Organismen angewendet werden.Changhua Zhu, ein außerordentlicher Professor des Chen-Labors, wird das Verfahren demonstrieren. Um die Pflanzen zu züchten, stellen Sie sicher, dass Arabidopsis-Samen 10 Minuten lang in 70% Ethanol sterilisiert und auf Agarplatten mit 1/2 Stärke Murashige und Skoog Nährstoffen ausgesät werden. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius und übertragen Sie sie dann in eine kontrollierte Wachstumskammer unter 16 Stunden Licht bei 22 Grad Celsius und acht Stunden Dunkelheit bei 20 Grad Celsius.Ernten Sie 100 Milligramm zweiwöchige Setzlinge und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff für die Metabolitenextraktion ein. 100 Milligramm gefrorenes Pflanzengewebe mit sieben bis acht Stahlperlen in einer vorgekühlten Mischermühle fünf Minuten lang mit einer Frequenz von 60 Hertz mahlen. Bereiten Sie die Extraktionslösung vor, die Methanol, Acetonitril und Wasser in einem Verhältnis von zwei zu zwei zu eins enthält.Die homogenisierten Materialien mit einem Milliliter der Extraktionslösung wieder aufsaugen. Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 12.000 XG für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, geben Sie dann 0,5 Milliliter der Suspension in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein. Die gefrorene Probe in einem Gefriertrockner verdampfen und in 0,5 Milliliter 5% Acetonitril und 95% Wasser wieder auffüllen.Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 4.000 XG für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Laden Sie den Überstand zur LC-MS/MS-Messung in eine Durchstechflasche. Bereiten Sie einen 10 Millimolaren Ammoniumacetatpuffer vor, indem Sie 1,5 Gramm Ammoniumacetat in zwei Liter doppelt deionisiertem Wasser auflösen.Stellen Sie den pH-Wert mit 10% Ammonium- und Acetatsäure auf 9,5 ein. Bereiten Sie zwei Liter hochreines 100% Methanol für die Nukleosidemessung vor und bereiten Sie dann zwei Liter hochreines Acetonitril für die Nukleotidmessung vor. Injizieren Sie 0,02 Milliliter der vorbehandelten Metabolitenextraktion jeder zuvor vorbereiteten Probe in ein HPLC-System mit Binärempumpumpen, gekoppelt mit einem dreifachen Vierfach-Massenspektrometer.Um die Standardkalibrierungskurven zu generieren, gruppieren Sie sechs Probenextraktionen zusammen und wirbeln Sie die Mischung vor, dann aliquotieren Sie sie erneut auf sechs Extraktionen, um jeden Hintergrund zu erhalten. Fügen Sie diesen sechs Extraktionen sechs verschiedene Konzentrationen jedes Standards hinzu und injizieren Sie sie nacheinander in das HPLC-System. Erfassen Sie die Spitzenflächen jedes Standards in unterschiedlichen Konzentrationen über die Massenübergänge.Dieses Protokoll wurde verwendet, um N1-Methyladenosin, ein bekanntes modifiziertes Nukleosid, in zwei Wochen alten Arabidopsis-Wildtyp-Sämlingen zu identifizieren und zu quantifizieren. Das massenspektrometrische Profil zeigte, dass die aus dem N1-Methyladenosin-Standard erzeugten Produktionen im Verhältnis 150 und 133 MZ liegen. Und das gleiche Profil wurde bei der kolumbianischen Nullextraktion beobachtet.Aufgrund der hohen Häufigkeit des Produktions von 150 MZ wurde für die N1-Methyladenosin-Identifizierung der Massenübergang von 282,1 bis 150 gewählt. Die Retentionszeit des Zielpeaks betrug 7,05 Minuten. Identisch mit der Retentionszeit des N1-Methyladenosin-Standards.Eine Konzentrationsserie von N1-Methyladenosin-Standards wurde in sechs Probenextraktionen hinzugefügt. Die Standardproben wurden in die LC-MS/MS injiziert und die erhöhten Spitzenbereiche von N1-Methyladenosin wurden gegen die Nominalkonzentrationen der Standards aufgezeichnet. Die sechs gleichen Hintergrundextraktionen sind wichtig, um eine genaue und wiederholbare Kalibrierkurve für die Quantifizierung zu erstellen.Unsere Methode kann angewendet werden, um Stoffwechselwege in Pflanzen zu erforschen. Durch den Vergleich der Metabolitenprofile zwischen Wildtyp- und Funktionsverlustmutanten konnte der Stoffwechselfluss gezogen werden.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

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Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

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Das hier beschriebene Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare Methode dar, die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verwendet, um den Purinstoffwechsel an chronischen lymphatischen Leukämie (CLL)-Zellen zu messen, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine LC-MS-basierte Sequenzierungsmethode, die als direkte Methode zur Sequenzierung kurzer RNA (&lt;35 nt pro Lauf) ohne cDNA-Zwischenprodukt und als allgemeine Methode zur Sequenzierung verschiedener Nukleotidmodifikationen in einer einzigen Studie mit Einzelbasenpräzision verwendet werden kann.

2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen

In diesem Protokoll stellen wir einen optimierten Workflow vor, der eine effiziente und schnelle Probenvorbereitung vieler Proben kombiniert. Darüber hinaus bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Reduzierung analytischer Variationen für die Hochdurchsatzbewertung metabolischer GWAS-Studien.

Large-scale Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Richtlinien für die Probenvorbereitung und Normalisierung

Posttranskriptionelle Modifikationen der RNA stellen eine wenig untersuchte Schicht der Translationsregulation dar, die kürzlich mit der Plastizität des zentralen Nervensystems in Verbindung gebracht wurde. Hier wird die Probenvorbereitung und der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Ansatz zur gleichzeitigen Charakterisierung zahlreicher RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen beschrieben.

Charakterisierung von RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen mittels Massenspektrometrie

Lernen Sie die präzise Quantifizierung von Nukleosiden und Nukleotiden in Pflanzen mittels HPLC-MS/MS. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht schnelle Analysen und liefert wertvolle Einblicke in den pflanzlichen Stoffwechsel.

Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS

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