Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca²⁺ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Patch-Clamp- und Calcium-Imaging-Experimente sind arbeitsintensiv, zeitaufwändig und herausfordernd. Dieses Protokoll bietet eine bequeme Methode zur Isolierung hochwertiger atrialer und ventrikulärer Kardiomyozyten von Mäusen, die sich für Patch-Clamp-Experimente und gleichzeitig durchgeführte Kalziumbildgebung eignet. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten aus demselben Tier gewinnen können.

Die Isolierung von murinen atrialen Kardiomyozyten ist eine besondere Herausforderung und war ein limitierender Faktor für frühere Experimente. Beginnen Sie damit, das Langendorff-Gerät mit Perfusionspuffer vorzubefüllen und sicherzustellen, dass es luftfrei ist. Befestigen Sie eine Aortenkanüle unter dem Dissektionsmikroskop und verbinden Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit Perfusionspuffer gefüllt ist.

Nachdem Sie das Herz aus der euthanasierten Maus entnommen haben, legen Sie das Herz in einen Perfusionspuffer bei Raumtemperatur und kanülieren Sie die Aorta so schnell wie möglich mit einer stumpfen Nadel unter dem Mikroskop. Binden Sie das Herz mit einem Stück Nahtseide fest an die Nadel und trennen Sie die Spritze. Nach der Aortenkanülierung ist das kanülierte Herz sofort mit dem Langendorff-Apparat zu verbinden, um das Eindringen von Luft in das System zu vermeiden.

Perfundieren Sie das Herz eine Minute lang mit Perfusionspuffer bei genau 37 Grad Celsius und einer Perfusionsrate von vier Millilitern pro Minute. Wechseln Sie von Perfusion zu Verdauungspuffer und perfusionieren Sie genau neun Minuten lang bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius und einer Perfusionsrate von vier Millilitern pro Minute. Wenn Sie fertig sind, geben Sie das verdaute Herz in eine Petrischale mit genügend Verdauungspuffer, um es vollständig bedeckt zu halten.

Präparieren Sie dann vorsichtig die Vorhöfe und Ventrikel unter dem Mikroskop. Übertragen Sie die Vorhöfe in eine Petrischale mit 1,5 Millilitern Verdauungspuffer und die Ventrikel in eine weitere Petrischale mit drei Millilitern Verdauungspuffer. Ziehen Sie die Vorhöfe vorsichtig, aber schnell mit einer stumpfen Pinzette in winzige Stücke auseinander.

Lösen Sie das Gewebe auf, indem Sie vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze auf und ab pipettieren, die zuvor abgeschnitten wurde, um die Spitzenöffnung zu erweitern. Geben Sie die Lösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer hinzu, indem Sie an der Seite des Röhrchens hinunterpipettieren. Führen Sie alle drei Milliliter der Lösung durch ein 200-Mikrometer-Nylonnetz, um die verbleibenden größeren Gewebestücke zu entfernen, die nicht vollständig verdaut wurden.

Um eine ventrikuläre Dissektion durchzuführen, schneiden Sie das Ventrikelgewebe mit einer Dissektionschere oder Pinzette in winzige Stücke und pipettieren Sie mit einer weiteren 1000-Mikroliter-Pipettenspitze auf und ab, um es aufzulösen. Übertragen Sie die Zell- und Gewebelösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer hinzu, indem Sie ihn vorsichtig an der Seite des Röhrchens entlang pipettieren, um die Reaktion zu beenden. Führen Sie alle sechs Milliliter der Zell- und Gewebelösung durch ein 200-Mikrometer-Nylonnetz, um größere Stücke zu entfernen, die nicht vollständig verdaut wurden.

Lassen Sie sowohl die atrialen als auch die ventrikulären Zellsuspensionen sechs Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank, damit sie sich absetzen können. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen zwei Minuten lang bei 5G. Entsorgen Sie die Überstände mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie die Zellpellets vorsichtig in 10 Millilitern kalziumfreier Tyrode-Lösung.

Lassen Sie die Vorhof- und Ventrikelzellen acht Minuten lang zur Sedimentation. Zentrifugieren Sie die Vorhofzellen eine Minute lang bei 5G. Entsorgen Sie dann die Überstände aus beiden Zellproben und resuspendieren Sie die Pellets vorsichtig in 10 Millilitern Tyrode-Lösung mit 100 mikromolarem Kalzium.

Lassen Sie die Zellen acht Minuten lang zur Sedimentation und wiederholen Sie dann die Zentrifugation der Vorhofzellen. Die Überstände werden verworfen und die Zellpellets vorsichtig in 10 Millilitern Tyrode-Lösung mit 400 mikromolaren Kalzium resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal, indem Sie die Zellen in der Tyrode-Lösung mit einem Millimolar Calcium resuspendieren.

Alle Vorhofzellen sind klein mit Zellkapazitäten im Bereich von etwa 35 bis 100 Picofarad. Hier ist eine typische Zelle aus dem atrialen arbeitenden Myokard dargestellt. Ventrikuläre Myozyten sind stäbchenförmiger und größer, mit Zellkapazitäten von 100 bis etwa 400 Pikofaraden.

Beispiele für L-Typ-Calciumstrommessungen mit gleichzeitigen zytosolischen Calciumtransienten von einem atrialen Myozyten und einem ventrikulären Myozyten sind hier dargestellt. Bevor Sie diese Technik ausprobieren, stellen Sie sicher, dass Sie den Organraub üben. Es ist entscheidend, dass der Schritt schnell durchgeführt wird und alle Gewebeschnitte an den richtigen Stellen vorgenommen werden.

Wenn die Organentnahme in reproduzierbarer Qualität durchgeführt wird, nehmen Sie sich etwas Zeit, um die Kanülierung zu perfektionieren. Zellen, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, eignen sich für Patch-Clamp-Messungen. Darüber hinaus können sie mit Fluoreszenzfarbstoffen beladen werden, was eine breite Palette von bildgebenden Experimenten ermöglicht.