Name: Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie ein Mausmodell für rezidivierende Harnwegsinfektionen durch UPEC und Gardnerella vaginalis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Interaktionen im Blasengewebe.

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Die Autoren danken Lynne Foster für die technische Unterstützung bei Infektionsexperimenten, James Fitzpatrick vom Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) für den Zugang zum SEM, Scott Hultgren für den UTI89kanR UPEC-Stamm und David Hunstad für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), vom Center for Women's Infectious Disease Research an der Washington University School of Medicine (Pilot Research Award an NMG), von der American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) und #14POST20020011 (NMG) und von den National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) und NIDDK unterstützt: R21 DK092586 (ALLE), P50 DK064540-11 (SJH, Projekt II PI:ALL) und K01 DK110225-01A1 (NMG). Einige der Tierversuche wurden in einer Einrichtung durchgeführt, die durch den NCRR-Zuschuss C06 RR015502 unterstützt wurde. Das Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; wo SEM durchgeführt wurde) und MSJ wurden von der Washington University School of Medicine, dem Children's Discovery Institute der Washington University und dem St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), der Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) und dem National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie haben.

Der erste kritische Schritt in diesem Modell, um Mäuse zu identifizieren, die UPEC-Bakterien während der primären UTI-Phase nicht beseitigt haben. Diese Mäuse müssen aus dem Experiment entfernt werden, da sie sonst die Raten der UPEC-Bakteriurie nach der Exposition von G. vaginalis verwirren würden. Nach der ersten UPEC-Impfung sollte wöchentlich Urin gesammelt werden, um die bakterielle Clearance zu überwachen. Etwa 65-80% der C57BL/6-Mäuse werden eine UTI89-kanR-Infektion innerhalb von 4 Wochen beseitigen. Andere Inzuchtmäusestämme haben unterschiedliche Neigungen zur UPEC-Clearance42,43 und zur Reservoirbildung und sind daher möglicherweise nicht für dieses Modell geeignet. Der zweite kritische Punkt ist, dass empirische Studien festgestellt haben, dass zwei aufeinanderfolgende Impfungen von G. vaginalis (entweder 12 h oder 1 Woche auseinander) notwendig sind, um eine signifikante Reservoiremergenz über dem spontanen Hintergrundauftreten auszulösen, das bei Kontrollmäusen auftritt, die nur PBS ausgesetzt sind. Andere Zeiträume zwischen den beiden sequentiellen Expositionen wurden nicht getestet, könnten aber zu ähnlichen Ergebnissen führen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine Reduktion der UPEC-Blasentiter nur in dem Modell beobachtet wurde, in dem G. vaginalis-Expositionen 1 Wochen auseinander39 verabreicht wurden. Während mehr als zwei Expositionen verabreicht werden können, deuten empirische Beweise darauf hin, dass eine wiederholte Katheterisierung allein die Emergenz erhöht, was die Interpretation der Ergebnisse verwirren kann oder eine größere Anzahl von Tieren erfordert, um Unterschiede zwischen Expositionsgruppen und Kontrollen zu unterscheiden. Schließlich hat die In-situ-Blasenfixierungsmethode mehrere kritische Schritte. Etwas Geschick ist erforderlich, um sicherzustellen, dass das Fixiermittel in den geklemmten Blasen verbleibt. Entleerte Blasen werden von REM schwieriger abzubilden sein. Es ist auch wichtig, sehr sanft zu sein, wenn das Fixiermittel in die Blase geimpft wird, da das Abkratzen des Urothels mit dem fixativ enthaltenden Katheter ein Urothelpeeling unabhängig von dem, was durch G. vaginalis ausgelöst wird, induzieren kann. Alle im fixativen Cocktail genannten Konzentrationen sind Endkonzentrationen. Unsachgemäße Verhältnisse von diesen können zu unzureichender Fixierung und Schwellung oder Schrumpfung der Zellen führen. Fixiermittel sollten auf physiologische Temperaturen erwärmt werden, um Temperaturschocks in Zellen und Geweben zu vermeiden. Die Erwärmung bietet auch eine leichte Verbesserung der Diffusionsrate von Fixiermitteln durch Plasmamembranen. Während die Osmiumfärbung bei Proben, die für die REM-Analyse vorbereitet wurden, oft weggelassen werden kann, ist es ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll, um Lipide zu stabilisieren und das Reißen von Zellmembranen während der kritischen Punkttrocknung zu verhindern.
Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um andere UPEC- und/oder G. vaginalis-Stämme auf ihre Fähigkeit zu testen, Reservoirs zu bilden bzw. ihre Entstehung auszulösen. Andere experimentelle Faktoren können ebenfalls hinzugefügt werden, wie die Exposition gegenüber anderen vaginalen Bakterien (z. B. Lactobacillus crispatus PVAS100) oder hitzeabgetötetes G. vaginalis, von denen keiner in diesem Modell39 eine Pathologie zeigt. Bei der Auswahl anderer zu testender Bakterienstämme ist es wichtig, ein konsistentes Wachstum nachzuweisen, so dass in allen Experimenten eine Standard-Inokulumkonzentration verwendet werden kann. Das Wachstum von JCP8151BSmR wurde in einer anaeroben Kammer optimiert. Dieser Stamm könnte wahrscheinlich in einem anaeroben GasPak-System kultiviert werden, aber dies würde eine Optimierung erfordern, um ein robustes Bakterienwachstum zu gewährleisten. Schließlich kann es möglich sein, das Timing bestimmter Schritte im Modell zu ändern. Zum Beispiel kann Urin zu früheren Zeitpunkten während der UPEC-Reservoirbildungsphase gesammelt werden, um die Reaktionen von CFU oder Wirt zu überwachen. Eine nachteilige Wirkung der Entnahme von Urinproben zu frühen Zeitpunkten (3, 6, 12 hpi) auf das Fortschreiten der Infektion oder die Etablierung von Reservoirs wurde in diesem Modell nicht beobachtet. Es wurde berichtet, dass das Auftreten von UPEC-Reservoirs nach zwei JCP8151BSmR-Dosen mit 12 h oder 1 Woche auftritt, aber andere Zeitintervalle wurden noch nicht getestet. Es kann auch möglich sein, die Gesamtdauer für das Modell zu reduzieren, indem die UPEC-Reservoirbildungsphase auf 2 Wochen (statt 4 Wochen) reduziert wird, da viele der Mäuse zu diesem Zeitpunkt Bakterien beseitigen. Frühere Studien, in denen die UPEC-Entstehung nach Blasenexposition gegenüber chemischen Peelings untersucht wurde, verwendeten eine 1- oder 2-wöchige UPEC-Reservoirbildungsphase17,18. Die Verkürzung der Zeit für die UPEC-Bakteriurie-Clearance kann jedoch auf Kosten der Notwendigkeit gehen, mehr Tiere aus dem Versuch zu keulen. Schließlich kann die REM-Analyse der Blase zu zusätzlichen Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Dauer der Wirkung von G. vaginalis auf das Urothel zu beobachten.
In Bezug auf die Fehlerbehebung gibt es einige wichtige Überlegungen speziell in Bezug auf die Blasen-SEM-Analyse. Abhängig vom verwendeten Maushintergrund und der Menge der vorhandenen Entzündung weisen einige Blasen sehr dünne Wände auf. Diese Blasen neigen dazu, sich während der kritischen Punkttrocknung stärker zu kräuseln und können zu einer kaurimuschelartigen Form führen. In diesem Fall ist die beste Methode, die schalenförmige Blase entlang der gekräuselten Grenzfläche in zwei Hälften zu schneiden und dann ein zweites Mal den Großteil des überhängenden Gewebes zu entfernen. Das Schneiden funktioniert am besten mit einer PTFE-beschichteten zweischneidigen Rasierklinge. Überschüssiges Fett kann manchmal während der Osmium-Färbeschritte auflösen. Dies kann zu unerwünschten unlöslichen Fetttröpfchen führen, die sich während der Spül- und Dehydratisierungsschritte möglicherweise nicht abwaschen und sich während der anschließenden Trocknung auf der Blasenoberfläche absetzen können. Diese Tröpfchen können entweder als kleine Kugeln oder als scheibenartige Strukturen auftreten, die über die Probe verstreut sind (Abbildung 4D). Dies kann gemildert werden, indem sichergestellt wird, dass so viel Fettgewebe wie möglich aus der Nähe der Blase entfernt wird. Platin kann durch Iridiumbeschichtung ersetzt werden, aber Dicken sollten auf ein Minimum beschränkt werden, um die Maskierung feiner Strukturdetails zu reduzieren. Die Verwendung eines rotierenden Tisches während der Beschichtung wird dringend empfohlen.
Eine Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass es eine große Anzahl von Mäusen benötigt. Nur 65-80% der C57BL/6-Mäuse werden ihre UPEC-Bakteriurie beseitigen und für eine nachfolgende G. vaginalis- oder PBS-Impfung geeignet sein (siehe Abbildung 2C). Um 10-12 Mäuse pro Gruppe (G. vaginalis-Impfung vs. PBS) zu erhalten, sollten ~ 30 Mäuse zunächst mit UPEC infiziert werden. Darüber hinaus sind wahrscheinlich mehrere Experimente erforderlich, um die biologischen Replikate zu erreichen, die zum Nachweis der statistischen Signifikanz erforderlich sind. Wenn die Expositionen im Abstand von 1 Woche verabreicht wurden, trat bei 14 % der Mäuse, die PBS ausgesetzt waren, ein UPEC-Auftreten auf (Abbildung 3B). Daher erfordert der Nachweis eines signifikanten Anstiegs des UPEC rUTI bei G. vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS-Kontrollen (mit einer Leistung von 0,8; alpha=0,05 [einseitig]) das Testen einer kumulativen Gesamtzahl von mindestens 40 Mäusen für jede Expositions-Gruppe. Eine weitere Überlegung ist, dass diese Experimente teuer und arbeitsintensiv sind. Mäuse müssen wöchentlich auf UPEC-Clearance überwacht werden und der experimentelle Zeitverlauf beträgt 4-5 Wochen, je nachdem, ob G. vaginalis zweimal in einem Zeitrahmen von 12 Stunden oder zweimal im Abstand von 1 Woche verabreicht wird. SEM ist arbeitsintensiv und kann je nach Verfügbarkeit des Mikroskops und Servicegebühren teuer sein. Die Vorbereitung der gesamten Blase für SEM bietet reichlich Material für die Analyse, aber der Nachteil ist, dass die Analyse jeder Blase zeitaufwendig sein kann. Daher ist es wahrscheinlich, dass nur eine begrenzte Anzahl von Blasen von REM analysiert werden kann, verglichen mit den höheren Tierzahlen, die für Urin- und Gewebetiter verwendet werden. Darüber hinaus erfordert das Erhalten hochwertiger Bilder der gekrümmten Oberflächen der Blasen-"Tassen" Geschick aufgrund von Schatten, die die Sicht beeinträchtigen können. Obwohl Blasen-REM ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung des Urothel-Peelings ist, ist diese Methode weitgehend qualitativ. Da die Probe in runder Form fixiert ist und aufgrund der Verwendung von Glutaraldehyd im Fixiermittel ein Screening auf fluoreszierend exprimierende Bakterien mittels Lichtmikroskopie nicht möglich ist. Immunfärbende und chemische Farbstoffe sind mit diesem Prozess aufgrund der Verwendung von Glutaraldehyd, das die meisten Antigene und Osmium vernetzt und die Antigenstellen maskiert und das Gewebe verdunkelt, nicht kompatibel. Allerdings ist die REM-Technik nützlich für Parameter, die quantitativ ohne den Einsatz zusätzlicher Sonden ausgewertet werden können, wie z.B. die Zellgröße48,49.
Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, die über die zuvor beschriebenen Methoden hinausgehen. Es ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen von UPEC rUTI, die durch das Auftauchen aus Blasenreservoirs verursacht werden, im Gegensatz zur Wiedereinführung aus einer externen Quelle in die Blase. Andere Modelle von rUTI aufgrund des Auftretens aus Blasenreservoirs verwenden chemische Mittel (Protaminsulfat oder Chitosan), um ein Urothelpeeling zu verursachen17,18, das bei Frauen keine Auslöser von rUTI wäre. G. vaginalis ist ein weit verbreitetes urogenitales Bakterium, das im Urin nachgewiesen wurde, der direkt aus der Blase durch Katheterisierung oder suprapubische Aspiration bei einigen Frauen23,26 gesammelt wurde. Diese Tatsache, gepaart mit der bekannten Assoziation zwischen BV (bei der G. vaginalis in der Vagina überwächst) und UTI, deutet darauf hin, dass G. vaginalis ein klinisch plausibler Auslöser von rUTI ist. Schließlich bewahrt die In-situ-Blasenfixierungsmethode die Blasenultrastruktur und begrenzt Schäden, wodurch sichergestellt wird, dass sich die Blasenschichten nicht voneinander trennen. Frühere Methoden zur Visualisierung des Urothels haben den Benutzer traditionell dazu gebracht, die Blase aseptisch zu ernten, zu halbieren, zu dehnen und auf eine Dissektionsschale zu stecken, bevor er die gestreckte Blase in Fixiermittel48 eintaucht. Diese Methode führt zu einer sehr flachen Probe, gewährleistet jedoch keine gleichmäßige oder natürliche Dehnung des Gewebes und kann zu Bereichen führen, die über- und unterdehnt sind (was zu stark faltigem Gewebe führt) und eine Trennung der Blasenschicht verursachen können. Darüber hinaus können diese physikalischen Manipulationen der Blase, um das Gewebe zu dehnen und zu fixieren, Schäden verursachen, einschließlich Urothelpeeling. Eine andere Methode besteht darin, intakte Blasen in Fixiermittel zu tauchen, bevor sie in Paraffin eingebettet werden und dünne Abschnitte mit einem Mikrotom aufnehmen. Dünne Schnitte sind für immunhistochemische Experimente von unschätzbarem Wert, um die Lokalisation von Bakterien und Wirtsproteinen zu untersuchen, aber ein dünner Schnitt erlaubt keine Visualisierung der Urotheloberfläche. Mit dieser REM-Methode kann die Oberfläche der gesamten Blase auf einmal untersucht werden.
Wie beschrieben, umfassen zukünftige Anwendungen dieses Modells das Testen anderer UPEC-Stämme, um festzustellen, ob sie intrazelluläre Reservoirs bilden, und das Testen anderer G. vaginalis-Stämme , um zu beurteilen, ob sie ein Peeling und UPEC-Emergenz auslösen, um rUTI zu verursachen. Andere Mausstämme jenseits von C57BL/6-Mäusen können ebenfalls getestet werden, obwohl Mäuse mit einer hohen Neigung zur Entwicklung einer chronischen Blasenentzündung (wie Mäuse auf dem C3H-Hintergrund) nicht empfohlen werden, da zu viele Mäuse aus dem Experiment aussortiert werden müssten. Ein weiterer Vorteil von C57BL/6-Mäusen ist, dass viele genetische Knockout-Stämme im Handel erhältlich sind. Solche Stämme bieten die Möglichkeit, die Wirtsfaktoren zu hinterfragen, die an der Reservoirbildung und/oder -entstehung beteiligt sind.

Harnwegsinfektionen (UTI) stellen weltweit eine erhebliche Belastung für die Gesundheitsversorgung dar und beeinträchtigen jedes Jahr die Lebensqualität von Millionen von Menschen, insbesondere von Frauen,1. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) sind die häufigste Ursache fürHarnwegsinfektionen 1. Viele Patienten (ca. 20-30%), die eine Harnwegsinfektion entwickeln, werden trotz antibiotikavermittelter Clearance der Erstinfektion innerhalb von 6 Monaten eine rezidivierende Harnwegsinfektion (rUTI) erleben2. Leider leiden bis zu 5% der prämenopausalen Frauen jedes Jahran 3 oder mehr rUTI 3,4. Sequenzielle Episoden von rUTI können durch Persistenz desselben UPEC-Stammes aus dem Indexfall 5,6,7,8 verursacht werden. Daten aus menschlichen Proben und Mausmodellen deuten darauf hin, dass rUTI mit gleichem Stamm durch UPEC verursacht werden könnte, die sich in ruhenden Reservoirs in der Blase befindet. Beim Menschen wurden UPEC in Epithelzellen und Blasenbiopsien von Patienten mit Harnwegsinfektionen 9,10,11,12,13 nachgewiesen. Studien an C57BL/6-Mäusen haben gezeigt, dass einige UPEC-Stämme ruhende intrazelluläre Reservoirs in der Blase aufbauen können, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie und durch Homogenisierung und Kultur von Blasengewebe nachgewiesen wurden, die monatelang nach Auflösung der Bakteriurie14,15,16 aufrechterhalten werden. Die Behandlung der Blase mit Mitteln, die ein Peeling des Blasenepithels (Urothel) induzieren, z. B. Protaminsulfat17 oder Chitosan18, lösen das Auftreten von UPEC aus Reservoirs aus, um rUTI zu verursachen. Diese Daten deuten darauf hin, dass bei Frauen, die Blasen-UPEC-Reservoirs aus einer früheren Infektion beherbergen, Blasenexpositionen, die zu einem Urothelpeeling führen, rUTI auslösen können.
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die vaginale Mikrobiota zur Harnwegsinfektion beiträgt19,20. Gardnerella vaginalis ist ein häufiges Mitglied sowohl der vaginalen als auch der urinalen Mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. In der Vagina ist das Vorhandensein hoher G. vaginalis-Spiegel mit einer mikrobiellen Dysbiose verbunden, die als bakterielle Vaginose (BV) bekannt ist und ~ 30% der Frauen30,31,32 betrifft. Frauen mit BV haben ein höheres Risiko, an Harnwegsinfektionen zu erkranken, verglichen mit Frauen mit einer vaginalen Gemeinschaft, die von Lactobacillus33,34,35,36,37 dominiert wird. In Mausmodellen verursacht G. vaginalis ein epitheliales Peeling sowohl in der Vagina38 als auch in der Blase39. Bei C57BL/6-Mäusen, die UPEC-Blasenreservoirs beherbergen, führen zwei aufeinanderfolgende Blasenexpositionen gegenüber G. vaginalis - aber nicht gegenüber PBS - zu einem Wiederauftreten von UPEC aus Reservoirs, um UPEC rUTI zu verursachen. Das Auftreten wird durch das Auftreten von UPEC-Titern im Urin von Mäusen belegt, die zuvor die UPEC-Bakteriurie aufgelöst hatten, und eine anschließende Abnahme der UPEC-Blasenhomogenattiter bei der Aufopferung im Vergleich zu PBS-exponierten Kontrolltieren39. Interessanterweise gibt es keine dauerhafte Besiedlung durch G. vaginalis in der Blase. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle reichen zwei kurze Expositionen mit jeweils weniger als 12 (h) lebensfähigem G. vaginalis im Urin aus, um ein urotheliales Peeling auszulösen und die rUTI zu fördern.
Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell von rUTI, das durch UPEC verursacht wird, das sich in intrazellulären Blasenreservoirs befindet, wobei die Blasenimpfung von G. vaginalis verwendet wird, um das Wiederauftreten auszulösen. Der Fortschritt, den dieses Modell erzielt, besteht darin, dass G. vaginalis im Vergleich zu bisher verwendeten chemischen Mitteln ein klinisch relevanter biologischer Auslöser von rUTI ist. Darüber hinaus ermöglicht das relativ kurzlebige Überleben von G. vaginalis in den Harnwegen der Maus die Untersuchung der Auswirkungen vorübergehender mikrobieller Expositionen auf das Urothel, wie sie nach sexueller Aktivität auftreten könnten. Neben der Skizzierung des rUTI-Modells beschreibt dieses Protokoll auch Methoden zur Urinzytologie und in situ Blasenfixierung und Bildgebung des Urothels mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM).
Dieses Protokoll der G. vaginalis-induzierten rezidivierenden UPEC UTI verwendet den UPEC-Stamm UTI89 mit einer Kanamycin-Widerstandskassette (UTI89kanR)40. Nicht alle getesteten UPEC-Stämme waren in der Lage, während des akuten Infektionsstadiums bei Mäusen 41 intrazelluläre Bakteriengemeinschaften zu bilden, und es ist noch nicht bekannt, ob alle UPEC-Stämme die Fähigkeit haben, latente intrazelluläreReservoirs zu bilden. Die Reservoirbildung sollte vor der Verwendung anderer UPEC-Stämme im Modell bestätigt werden. Dieses Protokoll verwendet ein spontanes Streptomycin-resistentes G. vaginalis-Isolat, JCP8151BSmR38. Die Induktion von rUTI durch JCP8151BSmR erfordert zwei aufeinanderfolgende G. vaginalis-Impfungen, die entweder 12 h oder 7 Tage (d) im Abstandvon 39 gegeben sind. Ob andere G. vaginalis-Stämme ein Peeling und/oder UPEC rUTI induzieren, muss mit diesem Modell noch bestimmt werden. Es ist wichtig, UPEC- und G. vaginalis-Stämme mit bekannter Antibiotikaresistenz (wie Kanamycin oder Spectinomycin für UPEC und Streptomycin für G. vaginalis) zu verwenden, da Antibiotika zu Agarplatten hinzugefügt werden können, um das Wachstum endogener Mausmikrobiota zu verhindern, die sonst die Aufzählung koloniebildender Einheiten (CFU) zur Überwachung der Infektion stören könnten. Dies ist besonders wichtig für die Kultivierung von Urinproben, da Mausurin häufig andere Bakterien enthält, die ohne Antibiotika auf Kulturplatten überwachsen können. Der Ursprung dieser endogenen Bakterien im Mausurin ist unbekannt, spiegelt aber wahrscheinlich periurethrale und urogenitale Bakterien wider, die während der Urinsammlung aufgenommen wurden.
G. vaginalis ist ein fakultatives anaerobes Bakterium und daher beschreibt dieses Protokoll den Anbau von G. vaginalis JCP8151BSmR in einer anaeroben Kammer. Wenn keine anaerobe Kammer verfügbar ist, können andere Methoden zur Aufrechterhaltung anaerober Wachstumsbedingungen (z. B. ein GasPak-Beutel in einem luftdichten Behälter) verwendet werden. Alternativ wachsen einige Stämme von G. vaginalis (einschließlich JCP8151B SmR) in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (5% CO2). So wie die Verwendung anderer G. vaginalis-Stämme als JCP8151BSmR Tests erfordert, um sicherzustellen, dass sich die Bakterien in diesem Modell ähnlich verhalten, erfordert die Änderung der Wachstumsbedingungen eine empirische Bestimmung der idealen Dauer für Kultur (auf Platten und in Flüssigkeit) und optische Dichte (OD) 600-Äquivalente, um die gewünschten lebensfähigen Inokulumkonzentrationen zu erreichen. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob die Wachstumsbedingungen die Pathobiologie von G. vaginalis beeinflussen.
Schließlich sollten sich die Forscher bei der Überlegung, ob dieses Modell verwendet werden soll, bewusst sein, dass es eine größere Anzahl von Tieren pro Gruppe erfordern kann als typische UTI-Mausmodelle. Dies liegt zum Teil daran, dass die Induktion von rUTI erfordert, dass die Mäuse die durch die Erstinfektion der Blase verursachte UPEC-Bakteriurie auflösen. Daher ist jede Maus, die keine Bakteriurie (ein Phänotyp, der normalerweise auf eine anhaltende Niereninfektion hinweist) nicht in die rUTI-Phase des Protokolls einbezogen. Die Anzahl der Mäuse, die benötigt werden, um diese Studien durchzuführen, wird auch durch die Rate des "spontanen" UPEC-Auftretens in den Urin beeinflusst (durchschnittlich 12-14%). Schließlich haben verschiedene Mausstämme unterschiedliche Neigungen zur Entwicklung chronischer Bakteriurie im Vergleich zur intrazellulären Reservoirbildung42,43. Bei Verwendung anderer Mausstämme als C57BL/6 in diesem Modell muss bestätigt werden, dass die Tiere ruhende intrazelluläre UPEC-Reservoirs entwickeln.

<table><tbody><tr><td>30G x 1/2 Nadeln</td><td>BD</td><td>305106</td><td>für Katheter</td></tr><tr><td>5 1/2" gerade Pinzette Hämostat</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ Blasenfixierung</td></tr><tr><td>ACE 600 Sputter-Coater</td><td>Leica</td><td></td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Aluminium-REM-Stummel</td><td>Ted Pella</td><td>16111</td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ für Blasenfixierung</td></tr><tr><td>leitfähige Carbon-Klebelasche&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Leitfähige Silberfarbe</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>CPD 300 Kritischer Punkttrockner</td><td>Leica</td><td></td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Cytofunnel-Metallclip</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>zytogesponnene Urinanalyse</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Glukose & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ Blasenfixierung</td></tr><tr><td>Hema 3 Färbekit</td><td>Fisher</td><td>23123869</td><td>zytogesponnene Urinanalyse</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>25-060-Cl</td><td>für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Iridium</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>REM-Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td></td><td></td><td>Mausanästhesie</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>zu UPEC LB selektiven Platten hinzufügen (50 ug/ml)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani-Agar</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>UPEC-Wachstumsplatten</td></tr><tr><td>Luria-Bertani Bouillon</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Merlin FE-REM</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Rasterelektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Milli-Q Wasseraufbereiter</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>REM Probenaufbereitung</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Olympus Vanox AHBT3 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Cytospun Urinanalyse</td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>REM Probenverarbeitung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ Blasenfixierung</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>für Katheter</td></tr><tr><td>Proteose Pepton #3&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>DF-122-17-4</td><td>für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>PTFE-beschichtete Doppelschneidklinge</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>Schneidblasen für SEM</td></tr><tr><td>Shandon Zytozentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>zytogesponnene Urinanalyse</td></tr><tr><td>Shandon Cytofunnel Filter</td><td>Simport</td><td>M965FWDV</td><td>zytogesponnene Urinanalyse</td></tr><tr><td>Shandon Doppelter Cytofunnel</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>Zytospun-Urinanalyse</td></tr><tr><td>Shandon-Doppel-Zyto-Zyto-Objektträger (beschichtet)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>zytogesponnene Urinanalyse</td></tr><tr><td>Natrium-Cacodylat-Trihydrat</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ Blase-Fixations-Spektrophotometer</td></tr><tr><td></td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>zur Messung von bakteriellen OD600-Streptomycin-Gibco-11860038</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>hinzufügen zu G. vaginalis NYCIII selektive Platten (1 mg/ml)</td></tr><tr><td>Tuberkulin Slip Tip Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td>für Katheter</td></tr><tr><td>Hefeextrakt&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien</td></tr></tbody></table>

rezidivierende escherichia coli harnwegsinfektion, ausgelöst durch gardnerella vaginalis blasenexposition bei mäusen

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Rezidivierende Harnwegsinfektionen (rUTI), die durch uropathogene Escherichia coli (UPEC) verursacht werden, sind häufig und kostspielig. Frühere Artikel, die Modelle der Harnwegsinfektion bei männlichen und weiblichen Mäusen beschreiben, haben die Verfahren zur bakteriellen Inokulation und Aufzählung in Urin und Gewebe veranschaulicht. Während einer anfänglichen Blaseninfektion bei C57BL/6-Mäusen etabliert UPEC latente Reservoirs in Blasenepithelzellen, die nach Clearing der UPEC-Bakteriurie bestehen bleiben. Dieses Modell baut auf diesen Studien auf, um rUTI zu untersuchen, die durch das Auftreten von UPEC aus latenten Blasenreservoirs verursacht werden. Das urogenitale Bakterium Gardnerella vaginalis wird in diesem Modell als Auslöser von rUTI verwendet, da es häufig in den urogenitalen Trakten von Frauen vorhanden ist, insbesondere im Zusammenhang mit vaginaler Dysbiose, die mit Harnwegsinfektionen in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wird eine Methode zur In-situ-Blasenfixierung mit anschließender Rasterelektronenmikroskopie (REM) der Analyse des Blasengewebes beschrieben, mit einer möglichen Anwendung auf andere Studien mit der Blase.

Nach der Impfung sind UPEC-Titer im Urin nachweisbar (Abbildung 2B). Das Versäumnis, Urinproben auf selektiven Medien zu platten, die Kanamycin enthalten, wird wahrscheinlich zu einem Überwachsen der endogenen Mausmikrobiota führen, die den Urin kontaminiert. Das Niveau der UPEC-Bakteriurie wird wahrscheinlich an Tag 1 hoch sein und kann in der ersten Woche ansteigen, bevor es zu späteren Zeitpunkten abnimmt (Abbildung 2C). Etwa 65-80% der Mäuse haben bei 28 dpi keine nachweisbare UPEC im Urin (Abbildung 2C, grüner Kreis). Diese Mäuse können in den nachfolgenden Schritten des Modells verwendet werden. Mäuse, die bakteriell bleiben (Abbildung 2C, rote Ellipse), sollten aus dem Experiment eliminiert werden.
Zwei aufeinanderfolgende G. vaginalis-Expositionen im Abstand von 12 h (Abbildung 3A) oder 1 Woche (Abbildung 3B) führen zur Entstehung von UPEC aus intrazellulären Reservoirs, um rezidivierende Bakterien zu verursachen. Sowohl der Spiegel der UPEC-Bakteriurie (Mann-Whitney-Test) als auch der Anteil der Mäuse, die UPEC rUTI (Fishers exakter Test) aufweisen, sind bei Mäusen, die G. vaginalis ausgesetzt sind, im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe signifikant höher. Die zytologische Urinanalyse weist PMNs im Urin von G. vaginalis-exponierten Mäusen nach, die UPEC-Emergenz zeigten (Abbildung 3C). In dem Modell mit zwei Expositionen im Abstand von 1 Woche sind die UPEC-Titer im Blasengewebe bei G. vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS niedriger (Abbildung 3D), vermutlich aufgrund des Auftretens von UPEC aus Reservoirs und der anschließenden Clearance.
Die Visualisierung von in situ fixiertem Blasengewebe durch REM zeigt große oberflächliche Umbrella-Urothelzellen, die die Blasenoberfläche bei Kontrollmäusen auskleiden, die nur PBS ausgesetzt sind (Abbildung 4A). Das urotheliale Peeling wird durch einen Verlust oberflächlicher Schirmzellen nachgewiesen, die bei Mäusen, die G . vaginalis ausgesetzt sind, kleinere darunter liegende Übergangsepithelzellen freilegen (Abbildung 4B). Früh nach der UPEC-Inokulation während der Etablierung intrazellulärer Reservoirs sind UPECs auf dem Urothel sichtbar und filamentieren aus Peelingzellen (Abbildung 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Abbildung 2. Überwachung der UPEC-Titer im Urin während der Phase 1 (Reservoirbildung). (A) Schematische Darstellung der Beschichtung von koloniebildenden Einheiten (KBE). (B) Repräsentatives Bild von UPEC-Titern im Urin auf LB+Kanamycin. Schwarze Kreise zeigen Urinprobenflecken an, die gezählt werden sollten, um CFU/ml zu berechnen. (C) Zeitlicher Verlauf der UPEC-Bakteriurie bei C57BL/6-Mäusen. Jede Linie stellt eine einzelne Maus dar, die die UPEC-Urintiter im Laufe der Zeit verfolgt. Die gepunktete Linie zeigt die Nachweisgrenze (1000 KBE/ml) an. Die rote Ellipse zeigt vier Mäuse (von 20) an, die die UPEC-Bakteriurie nicht auflösen konnten und daher nicht für das G. vaginalis-induzierte rUTI-Modell verwendet werden würden . Umgekehrt zeigt der grüne Kreis Mäuse an, die die UPEC-Bakteriurie auflösten und zu nachfolgenden Phasen übergingen. (D) Tabelle der Daten, die zur Erstellung von Schaubildern in Tafel C verwendet wurden. Gelbe, nachweisbare KBE; grün, keine KBE. (E) Randomisierung von Mäusen in Expositionsgruppen auf der Grundlage des Zeitpunkts, zu dem UPEC-CFU nicht mehr im Urin nachgewiesen wurden ("Tag aufgelöst"). Die Mausnummern in der linken Spalte von Bedienfeld D sind die gleichen Mausnummern, die in Bedienfeld E angegeben sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Abbildung 3. G. vaginalis löst UPEC rUTI aus. UPEC-Titer im Urin nach zwei aufeinanderfolgenden Harnwegsexpositionen bei PBS (Kreise) oder G. vaginalis (Gvag; Quadrate) im Abstand von 12 h (A) oder 1 Woche (B). Jedes Symbol steht für eine einzelne Maus. Die höchste CFU/ml UPEC, die von jeder Maus zwischen 1-3 d nach der zweiten Exposition nachgewiesen wurde, werden aufgetragen. Mäuse ohne nachweisbare Bakterien werden an der Nachweisgrenze (gepunktete Linie) aufgetragen. (C) Urinzytologische Analyse mit UPEC- (Pfeilspitzen) und polymorphkernigen (PMN) Zellen (Pfeile). Maßstabsleiste = 20 μm. (D) UPEC-Titer im Blasengewebe, die 3 d nach zwei aufeinanderfolgenden Harnwegsexpositionen im Abstand von 1 Woche gesammelt wurden. Jedes Symbol steht für eine andere Maus und Nullen werden an der Nachweisgrenze (gepunktete Linie) dargestellt. In A, B und D befinden sich die Kästchen im ersten und dritten Quartil, wobei der Median markiert ist und die Schnurrhaare von min bis max. Mann-Whitney U Tests * P &lt; 0,05; ** P &lt; 0,01; P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Abbildung 4. REM-Analyse von in situ fixierten Blasen. Blasen wurden von Mäusen 3 h nach zwei Expositionen (im Abstand von 12 h) bei PBS (A) oder G. vaginalis (C) gesammelt. Gepunktete Linien zeigen eine einzelne Harnepithelzelle, die in G. vaginalis-exponierten Blasen kleiner ist, weil die großen oberflächlichen Zellen ein Peeling abblättern und das darunter liegende Übergangsepithel freilegen . (B) Die Blase wurde 6 h nach der ersten Inokulation mit UPEC während der Phase 1 des Modells gesammelt und zeigte ein urotheliales Peeling und extrazelluläre UPEC. (D) Beispiel für unlösliche Fetttröpfchen auf der Blasenoberfläche. Maßstabsbalken sind 20 μm in den Hauptbildern und 2 μm im Einschub. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Ein Mausmodell der uropathogenen transurethralen E. coli (UPEC) -Inokulation zur Etablierung latenter intrazellulärer Blasenreservoirs und einer anschließenden Blasenexposition gegenüber G. vaginalis zur Induktion einer rezidivierenden UPEC-Harnwegsinfektion ist nachgewiesen. Ebenfalls demonstriert werden die Aufzählung von Bakterien, die Urinzytologie und die In-situ-Blasenfixierung und -verarbeitung für die Rasterelektronenmikroskopie.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Wiederkehrende Harnwegsinfektionen sind ein ernstes Gesundheitsproblem. Dieses Protokoll wird uns helfen zu verstehen, wie eine kurzlebige Exposition gegenüber Urogenitalbakterien zu einer Schädigung der Blase führt und E.Coli-rezidivierende Harnwegsinfektionen auslöst. Ein Vorteil dieses Modells ist, dass Blasenpeeling und rezidivierende Harnwegsinfektionen durch das urogenitale Bakterium Gardnerella vaginalis ausgelöst werden, das bei Frauen mit rezidivierenden Harnwegsinfektionen häufig vorkommt.Beginnen Sie damit, den G.vaginalis-Stamm von einem Gefriergut bei minus 80 Grad Celsius in eine anaerobe Kammer zu bringen. Streichen Sie die Bakterien ohne Antibiotika auf eine NYCIII-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius anaerob für 24 Stunden.In der anaeroben Kammer inokulieren fünf Milliliter anaerobes NYCIII-Medium mit einer Ein-Mikroliter-Schleife voller Zellen aus der NYCIII-Platte und inkubieren Sie die Kultur statisch bei 37 Grad Celsius unter anaeroben Bedingungen für 18 Stunden. Nehmen Sie keine Antibiotika in das Wachstumsmedium auf. Bestimmen Sie den OD600 der Kultur mit einem Spektralphotometer.Dann zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 9.600 G und saugen Sie das Medium an. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in PBS auf die gewünschte Konzentration und verdünnen und plattieren Sie das Inokulum seriell. Geben Sie 10 Mikroliter Urin zu 90 Mikrolitern PBS in eine Zytotrichterkassette mit angeschlossenem Filter.Legen Sie die Kassetten mit einem Objektträger in die Zytozentrifuge und drehen Sie sie sechs Minuten lang mit hoher Beschleunigung bei 600 bis 800 mal G. Nachdem Sie die Objektträger entfernt und über Nacht trocknen gelassen haben, färben Sie die Objektträger mit einem Hämatologie-Färbeset und analysieren Sie sie lichtmikroskopisch auf das Vorhandensein von PMNs und Epithelzellen. Sobald Sie die Tuberkulin-Slip-Tip-Spritze mit dem Fixiermittel versehen haben, befestigen Sie einen Katheter am Ende, wobei die Abschrägung gegenüber den Spritzenmarkierungen zeigt.Schneiden Sie den überschüssigen Schlauch ein bis zwei Millimeter vom Ende der Nadel entfernt ab und achten Sie darauf, dass die Nadelspitze nicht freiliegt. Schnippen Sie mit der Spritze, um Blasen zu entfernen, und drücken Sie den Kolben, um Luft abzulassen. Füllen Sie dann den Katheter mit Fixiermittel über einem Mikrozentrifugenröhrchen. Nachdem Sie die Maus betäubt und geopfert haben, öffnen Sie den Beckenbereich der Maus mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere, um die Blase freizulegen.Schieben Sie das angrenzende Fett vorsichtig beiseite, lassen Sie die Blase jedoch an Ort und Stelle. Halten Sie die Spritze mit der dominanten Hand und der Nadel nach unten. Tauchen Sie die Katheterspitze in steriles Gleitmittel und positionieren Sie die Katheterspitze an der Harnröhrenöffnung, wobei Sie den Spritzenzylinder in einem Winkel von 30 bis 45 Grad über den Mauskörper halten.Üben Sie mit leichten Bewegungen im Uhrzeigersinn Druck nach unten aus und führen Sie den Katheter vorsichtig in die Harnröhre ein. Richten Sie die Spritze beim Eintritt der Katheterspitze in Richtung des Mausschwanzes aus, während Sie den Katheter weiter in die Harnröhre schieben, bis der Spritzenzylinder parallel zur Arbeitsfläche ist. Der gesamte Katheternadelschaft sollte in die Maus eindringen und die Katheterspitze im Blasenlumen positionieren. Geben Sie langsam 50 bis 80 Mikroliter Fixiermittel ab, wodurch sich die Blase wie ein Ballon aufbläht.Halten Sie den Katheter an Ort und Stelle, heben Sie die Spritze leicht an, indem Sie die Spitze nach oben kippen. Öffnen Sie mit der anderen Hand ein Blutstillmittel und schieben Sie einen Stift unter die Katheternadel am Schnittpunkt der Harnröhre. Schließen Sie das Blutstillmittel teilweise, bis es gerade noch mit der Nadel in Berührung kommt.Schieben Sie die Katheternadel vorsichtig aus der Blase und klemmen Sie gleichzeitig das Blutstillungsmittel vollständig fest und verriegeln Sie es, um einen Verlust des Fixiermittels zu verhindern. Fassen Sie das Blutstillungsmittel so, dass es parallel zur Arbeitsfläche ist und die Blase darauf aufliegt. Heben Sie den Hämostaten vorsichtig an und schneiden Sie vorsichtig unter den Hämostaten, um die Blase zu entfernen, während der Hämostat noch befestigt ist.Legen Sie die Blase und das daran befestigte Blutstillstand in ein Falcon-Röhrchen mit erwärmtem Fixiermittel. Stellen Sie sicher, dass die Blase vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist und nicht gegen die Wände des Schlauchs gedrückt wird. Um die Blase mittels Rasterelektronenmikroskopie abzubilden, halbieren Sie mit einer sauberen, doppelseitigen Rasierklinge oder einem Skalpell sagittal und machen Sie einen zweiten Schnitt tangential zum Hämostaten, um die Blase freizugeben.Daraus ergeben sich zwei halbe Blasenbecher. Wenn sich an der Außenseite der Blase noch Fettpolster befinden, entfernen Sie diese vorsichtig. Spülen Sie die Blasenhälften dreimal mit Natriumcacodylatpuffer aus.Färben Sie das Gewebe mit 1%Osmiumtetroxid in 0,15-molaren Cacodylatpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Führen Sie diesen Schritt mit dem in Folie eingewickelten Färbegefäß durch, um eine dunkle Umgebung zu erhalten. Spülen Sie die Blasenhälften nach dem Färben dreimal mit Reinstwasser aus.Wenn osmikatisiertes Öl auf der Wasseroberfläche zu sehen ist, saugen Sie es an oder leiten Sie es ab, um eine Kontamination während der Trocknungsschritte zu vermeiden. Nachdem Sie das Gewebe dehydriert haben, halbieren Sie die Blasenhälften mit einem sauberen, doppelseitigen Rasierer, um insgesamt vier Stücke zu erhalten. Nach der Inokulation sind UPEC-Titer im Urin nachweisbar.Das Niveau der UPEC-Bakteriurie ist am ersten Tag hoch und kann in der ersten Woche ansteigen, bevor es zu einem späteren Zeitpunkt abnimmt. Etwa 65 bis 80 % der Mäuse haben 28 Tage nach der Inokulation kein nachweisbares UPEC im Urin. Diese Mäuse können in den nachfolgenden Schritten des Modells verwendet werden.Mäuse, die bakteriell bleiben, sollten aus dem Experiment ausgeschlossen werden. Zwei aufeinanderfolgende G.vaginalis-Expositionen, die im Abstand von 12 Stunden oder einer Woche verabreicht werden, führen zum Auftreten von UPEC aus intrazellulären Reservoiren, um eine rezidivierende Bakteriurie zu verursachen. Die zytologische Analyse des Urins kann zum Nachweis polymorphkerniger Zellen im Urin von G.Vaginalis-exponierten Mäusen mit UPEC-Emergenz verwendet werden.In dem Modell mit zwei Expositionen, die im Abstand von einer Woche verabreicht wurden, sind die UPEC-Titer im Blasengewebe bei G.vaginalis-exponierten Mäusen im Vergleich zu PBS niedriger, vermutlich aufgrund des Austretens von UPEC aus Reservoiren und der anschließenden Clearance. Die Visualisierung von in situ fixiertem Blasengewebe mittels SEM zeigt große, oberflächliche Regenschirm-Urothelzellen, die die Blasenoberfläche bei Kontrollmäusen auskleiden, die nur PBS ausgesetzt waren. Das Urothelpeeling zeigt sich durch einen Verlust von oberflächlichen Schirmzellen, wodurch bei Mäusen, die G. vaginalis ausgesetzt waren, ein kleineres darunterliegendes Übergangsepithel zum Vorschein kommt.Zu Beginn der UPEC-Inokulation, während der Etablierung intrazellulärer Reservoire, sind Bakterienzellen auf dem Urothel sichtbar und filamentieren aus den Peeling-Zellen. Die hier beschriebenen Methoden ebnen den Weg für zukünftige Studien, um die Wirkung zusätzlicher Gardnerella-Stämme oder anderer urogenitaler Spezies auf E.coli rUTI zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert Methoden zur transurethral induzieren Maus Harnwegsinfektionen und zu quantifizieren, das Ausmaß der daraus resultierenden Infektionen.

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Quelle: O'Brien, V. P., et al., Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert den Einsatz der Rasterelektronenmikroskopie, um bakterielle Besiedlung und Wirts-Pathogen-Interaktionen im Blasenepithel eines vorinfizierten Mausmodells zu visualisieren.

Vorbereitung von Mausblasengewebe zur Visualisierung bakterieller Infektionen

Quelle: O'Brien, V.P. et al. Wiederholende Harnwegsinfektion mit Escherichia coli ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenbelastung bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Herstellung eines Gardnerella vaginalis-Inokulums zur Etablierung eines Mausmodells wiederkehrender Harnwegsinfektionen.

Herstellung von Gardnerella vaginalis Inoculum zur Modellierung wiederkehrender Harnwegsinfektionen bei Mäusen

Quelle: Conover, M. S. et al., J. Etablierung und Charakterisierung von Harnwegsinfektionen und CAUTI in einem Mausmodell. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Montage und Implantation eines transurethralen Katheter in einer weiblichen Maus, gefolgt von einer bakteriellen Impfung zur Etablierung katheterassoziierter Harnwegsinfektion und zur Untersuchung biofilmvermittelter Wirts-Pathogen-Interaktionen.

Katheterassoziierte Harnwegsinfektion in einem Mausmodell

Quelle: Conover, M. S. et al., Etablierung und Charakterisierung von Harnwegsinfektionen und CAUTI in einem Mausmodell. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert den Nachweis intrazellulärer bakterieller Gemeinschaften (IBCs) im Gewebe der Mausblase, infiziert mit β-galactosidase-exprimierender Escherichia coli. Nach Gewebefixation, Permeabilisierung und Färbung mit X-gal erscheinen IBCs als blaue Puncta unter einem Sektionsmikroskop, was eine bakterielle Invasion während der...

Visualisierung intrazellulärer Bakteriengemeinschaften in einer infizierten Mausblase

In diesem Video beschreiben wir die Technik zur intravesikalen Verabreichung von uropathogenen Bakterien, um ein Harnwegsinfektionsmodell bei Mäusen zu erstellen. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Ausbreitung uropathogener bakterieller Infektionen im Harnsystem und die Mechanismen zu verstehen, die die Anfälligkeit für Harnwegsinfektionen bestimmen.

Generierung eines Harnwegsinfektionsmodells: Eine Technik zur Verabreichung uropathogener Bakterien in der Maus zur Entwicklung eines Harnwegsinfektionsmodells

Dieses Video zeigt die Etablierung einer uropathogenen Escherichia coli-Infektion in einer weiblichen Mausblase durch transurethrale Katheterinstillation. Die injizierten Bakterien etablieren erfolgreich eine Harnwegsinfektion in der Blase und bieten eine wertvolle Plattform für die Untersuchung von nosokomialen Erkrankungen im Zusammenhang mit den Harnwegen.

Transurethrale Katheterisierung und bakterielle Inokulation zur Erstellung eines Harnwegsinfektionsmodells bei männlichen Mäusen

Etablierung eines Modells für Harnwegsinfektionen bei weiblichen Mäusen

Die Fähigkeit, Harnwegsinfektionen (HWI) zu modellieren, ist entscheidend, um die bakterielle Pathogenese verstehen und die Entwicklung neuartiger Therapeutika vorantreiben zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Mausmodelle für experimentelle Harnwegsinfektionen und katheterassoziierte Harnwegsinfektionen zu demonstrieren, die die beim Menschen beobachteten Ergebnisse rekapitulieren und vorhersagen.

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Das etablierte Modell der transurethrale Katheterisierung von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Erkrankungen der Blase, einschließlich urinausscheidende Fläche Infektion, aber kann nur bei Frauen durchgeführt werden. Ein neues Modell der männlichen transurethrale Instillation, das hier vorgestellte wird Forschung in einem Gebiet, geprägt von starken klinischen und epidemiologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu ermöglichen.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Erfahren Sie ein Mausmodell für rezidivierende Harnwegsinfektionen durch UPEC und Gardnerella vaginalis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Interaktionen im Blasengewebe.

Rezidivierende Escherichia coli Harnwegsinfektion, ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenexposition bei Mäusen

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