Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Die Charakterisierung einer Proteinstruktur ist für das Verständnis ihrer Funktion unerlässlich. Die Massenspektrometrie hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für diesen Zweck entwickelt, insbesondere für Proteinsysteme, die mit herkömmlichen Methoden schwer zu untersuchen sind. Um eine Proteinstruktur nach Massenspezifikation zu untersuchen, werden spezifische chemische Reaktionen in Lösung durchgeführt, die eine Proteinstrukturinformation in seine Masse kodieren.

Ein besonders effektiver Ansatz ist die Verwendung von Reagenzien, die die Seitenketten der lösungsfreien Aminosäuren kovalent modifizieren. Diese Reaktionen führen zu Massenzuwächsen, die in Kombination mit proteolytischem Aufschluss und Tandem-Massenspektrometrie mit Rückstandsauflösung lokalisiert werden können. Hier beschrieben wir die Protokolle, die mit der Verwendung von Diethylpyrocarbonat oder DEPC als kovalentes Markierungsreagenz zusammen mit der Massenspezifikationsdetektion verbunden sind.

DEPC ist ein hochelektrophiles Molekül, das in der Lage ist, bis zu 30% der Rückstände im durchschnittlichen Protein zu kennzeichnen und dadurch eine hervorragende strukturelle Auflösung zu bieten. DEPC wurde erfolgreich zusammen mit mass spec eingesetzt, um Strukturinformationen für viele verschiedene Proteine zu erhalten. Beginnen Sie mit der Herstellung einer gepufferten Lösung Ihres interessierenden Proteins in einer Konzentration im Bereich von Dutzenden von Mikromolaren.

Wir verwenden üblicherweise einen 10 Millimolar pH 7,4 MOPS Puffer. Alternativ kann eine vorhandene Proteinlösung ein Pufferaustausch in MOPS oder einen anderen Puffer sein, wenn die ursprüngliche Probe einen Puffer enthält, der nukleophile funktionelle Gruppen auftupert. Es ist notwendig, dass der Puffer keine nukleophilen funktionellen Gruppen hat, da sie die DEPC-Proteinreaktion stören.

Bereiten Sie in einem anderen Mikroröhrchen eine Stammlösung von 100 Millimolar DEPC in trockenem Acetonitril vor. Die Vorbereitung der Stammlösung in trockenem Acetonitril ist notwendig, um eine Hydrolyse von DEPC zu verhindern. Bereiten Sie in einem neuen Mikroröhrchen die Lösung eines molaren Imidazols in HPLC-Wasser vor.

Mischen Sie in einer neuen Mikroröhre den MOPS-Puffer und die Proteinlösung. Fügen Sie dem Protein und dem Puffer ein Aliquot der DEPC-Stammlösung hinzu, um sicherzustellen, dass es richtig gemischt wird, bevor Sie das Reaktionsgemisch für eine Minute in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad geben. Das Volumen der verwendeten DEPC-Stammlösung sollte basierend auf dem gewünschten ENDGÜLTIGEN DEPC-Proteinkonzentrationsverhältnis ausgewählt werden.

Es gibt keinen einzigen Satz von DEPC- und Proteinkonzentrationen, die mit jedem Protein funktionieren, obwohl die optimale DEPC-Konzentration basierend auf der Anzahl der lösungsmittelzugänglichen Histidin- und Lysinreste im Protein geschätzt werden kann. Es sollte beachtet werden, dass das Volumen des zugesetzten Acetonitrils, das effektiv das Volumen der zugesetzten DEPC-Lösung ist, 1% des gesamten Reaktionsvolumens nicht überschreiten sollte, um eine Störung der Proteinstruktur während der Reaktion zu vermeiden. Die Reaktionszeit liegt letztlich beim Anwender, obwohl eine einminütige Reaktion unter der Beispielbedingung eine Übermarkierung des Proteins und Hydrolyse des DEPC minimiert.

Nach einer Minute löschen Sie die Reaktion ab, indem Sie das Imidazol hinzufügen, um den Rest des auf reagierten DEPC zu fressen. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von Imidazol das 50-fache der DEPC-Konzentration beträgt. Um die durch DEPC modifizierten Rückstände zu identifizieren, muss das Protein proteolytisch zu Peptidfragmenten verdaut werden.

Wählen Sie für die Verdauung Bedingungen, die für interessantes Protein geeignet sind. Häufige Schritte, die hier beschrieben werden, beinhalten das Entfalten von Protein und das anschließende Reduzieren und Alkylieren von Disulfidbindungen, so dass die Verdauungseffizienz verbessert werden kann. Unserer Erfahrung nach verbessert die Entfaltung des Proteins mit einem Denaturierungsmittel und Wärme vor der Verdauung die Effizienz der Verdauung.

Während das Protein entfaltet wird, vergleichen Sie Lösungen von TCEP und Jodacetamid in einem geeigneten Verdauungspuffer. TCEP sollte als Reduktionsmittel anstelle von Dithiothreitol oder DTT verwendet werden, da DTT mit DEPC-modifizierten Rückständen reagieren kann. Die Alkylierung der resultierenden Feilen nach der Reduktion ist unerlässlich, um Ein Verkleinern der Markierung zu vermeiden, bei dem freie Dateien und das Protein mit modifizierten Aminosäuren reagieren.

Sobald der Entfaltungsschritt abgeschlossen ist, reduzieren Sie die Disulfidbindungen, indem Sie dem Reaktionsgemisch TCEP hinzufügen und es drei Minuten bei Raumtemperatur reagieren lassen. Nach der Reduktion Iodoacetamid in das Reaktionsgemisch geben, 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln reagieren lassen. Erreicht hierdurch, dass das Reaktionsgemisch in eine Box gelegt wird.

Die Endkonzentration von Jodacetamid sollte doppelt so hoch sein wie die für TCEP verwendete Konzentration oder das 80-fache der Proteinkonzentration oder Disulfidbindung. Bereiten Sie das interessierende Enzym vor, normalerweise Trypsin oder Chymotrypsin gemäß den Spezifikationen des Herstellers. Nachdem Sie das Enzym Ihrer Wahl vorbereitet haben, beginnen Sie mit der Verdauung und inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 Grad Celsius.

Ein Protein-Enzym-Verhältnis von 10:1 mit einer dreistündigen Verdauung unter Verwendung immobilisierter Enzyme ist typischerweise eine gute Wahl für DEPC-markierte Proteine. Nach dem Aufschluss sollte die Probe entweder sofort mit LC-MS/MS analysiert oder mit flüssigem Stickstoff eingefroren werden, um den Abbau der Probe und den Etikettenverlust zu minimieren. Standard-LC-MS/MS-Parameter für die Bottom-up-Proteomik können verwendet werden, um markierte Stellen auf den proteolytischen Peptidfragmenten zu identifizieren.

Die stationäre Phase der Umkehrphase C18 sollte verwendet werden, um die beste Trennung der Peptide zu erreichen. Unserer Erfahrung nach liefert Kapillar-LC aufgrund der höheren Probenmengen zuverlässigere quantitative Informationen über Modifikationsgrade als Nano-LC. Eine typische mobile LC-Phase, die zur Trennung von DEPC-markierten Peptiden verwendet wird, besteht aus zwei Lösungsmitteln.

Lösungsmittel A ist Wasser mit 0,1% Ameisensäure und Lösungsmittel B ist ein Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure. Es wird eine Gradientenelution verwendet und die Trennzeit kann basierend auf der Probenkomplexität optimiert werden. Ein Massenspektrometer, das in der Lage ist, Online-LC-MS und MS / MS zu machen, ist erforderlich, um DEPC-Modifikationsstellen auf den Peptiden zu identifizieren.

In unseren Experimenten haben wir erfolgreich verschiedene Arten von Massenspektrometern eingesetzt. Wir haben festgestellt, dass eine Thermo Orbitrap Fusion hervorragende Ergebnisse liefert, obwohl jedes Massenspektrometer, das in der Lage ist, MS/ MS vieler Peptide im Verlauf einer LC-MS-Analyse automatisch durchzuführen, geeignet sein sollte. HPLC-Bedingungen und massenspektrometrische Parameter sollten vor der Messung richtig eingestellt werden.

Wenn die Probe eingefroren wurde, sollte sie direkt vor der Analyse aufgetaut werden. Versuchen Sie Ihr Bestes, um die Zeit zwischen Probenvorbereitung und HPLC-Injektion zu minimieren. Laden und injizieren Sie die verdaute markierte Proteinprobe in das LC-System und starten Sie die LC-MS / MS-Erfassung oder DEPC-Markierungsstellenidentifikation und Peak-Area-Quantifizierung, es gibt mehrere Methoden.

Auf Thermo Fisher Instrumenten kann Excalibur oder Proteometdecker verwendet werden. Legen Sie geeignete Parameter für die Peptididentifikation in einem Programm fest. DEPC-Addition und Carbamidomethylierung werden als variable Modifikationen, die Rückstände unterstützen, eingeschlossen oder zugeordnet.

Chromatographische Peakbereiche modifizierter und unmodifizierter Versionen der Peptide werden verwendet, um die Prozentsätze der Rückstandsmodifikation zu bestimmen. Die DEPC-Markierung mit MS-Nachweis ist auch ein wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung struktureller Veränderungen höherer Ordnung an Proteinen. Aus unserer Studie kann die kovalente DEPC-Markierung spezifische Proteinregionen identifizieren, die strukturelle Veränderungen durch thermischen und oxidativen Stress erfahren.

In der Abbildung sind signifikante Veränderungen der Modifikationsprozentsätze für die Abnahme der Kennzeichnung blau und für die Zunahme der Kennzeichnung rot dargestellt, während Rückstände ohne signifikante Kennzeichnungsänderungen hellgrün dargestellt werden. Zum Beispiel, nachdem Beta-2-Mikroglobulin Hitzestress ausgesetzt ist, sind viele Rückstände, die eine signifikante Abnahme der Markierungsausdehnungen erfahren, N-Terminus, Serin 28, Histidin 31, Serin 33, Serin 55, Serin 57 und Lysin 58 näher als eine Seite des Proteins, was darauf hindeutet, dass diese Region des Proteins eine Bestätigungsänderung erfährt oder möglicherweise eine Aggregation vermittelt. Nachdem das Protein oxidativem Stress ausgesetzt wurde, verschiedene Rückstände mit einer Abnahme der Markierung, Serin 11, Histidin 13, Lysin 19, Lysin 41 und Lysin 94 aus einem Cluster auf einer anderen Phase des Proteins, was darauf hindeutet, dass die oxidationsinduzierte Bestätigungsänderung an anderer Stelle auftritt.

Diese Studie hat wichtige Implikationen für Proteintherapeutika, die derzeit das am schnellsten wachsende Segment des Pharmamarktes sind. Andere Arbeiten aus unserer Gruppe haben auch gezeigt, dass die DEPC-Massenspezifikation für die kovalente Markierung Von Stellen mit bestätigungshaften Veränderungen in gestressten monoklonalen Antikörpertherapeutika erkennen und identifizieren kann. Wie Sie sehen, ist die kovalente Markierung mit DEPC experimentell einfach umzusetzen, kann aber wertvolle Strukturinformationen für Proteine liefern.

Die strukturelle Auflösung, die die DEPC-Markierungsmassenspezifikation bietet, ist im Vergleich zu Techniken wie Röntgenkristallographie und NMR bescheiden, aber sie ist für fast jedes Protein unabhängig von seiner Größe oder Kristallisationsfähigkeit erhältlich. Die dePC-kovalente Markierungsmassenspezifikation funktioniert auch mit Proteinmischungen und kann mit sehr komplizierten Probentypen wie Zelllysat und haCat-Zellen arbeiten. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sind wir zuversichtlich, dass Sie die DEPC-Markierung als nützliches Werkzeug zur Charakterisierung der Proteinstruktur empfinden werden.