Name: High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie High-Content-Screening zur Analyse von Oligodendrozyten-Differenzierung aus neuronalen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzises Drug Screening und Untersuchung von Myelinisierungsprozessen.

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Besonderer Dank geht an die IRET Foundation für die Durchführung der experimentellen Arbeit.

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<li>Baldassarro, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nuclear+receptors+in+the+differentiation+of+Oligodendrocyte+Precursor+Cells+derived+from+fetal+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells.</a> Stem Cell Research. 37, 101443(2019).</li>
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<li>Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+severely+alters+thyroid+hormone+signaling+in+the+central+nervous+system+during+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+rat%3A+direct+impact+on+OPCs+differentiation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure.</a> Glia. 64, 1573-1589 (2016).</li>
<li>Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+glucose+deprivation+on+the+survival+of+fetal+versus+adult+neural+stem+cells-derived+Oligodendrocyte+Precursor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells.</a> Glia. , 23750(2019).</li>
<li>Merrill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+pharmacological+models+to+assess+demyelination+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).</li>
<li>Lariosa-Willingham, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+drug+screening+assay+to+identify+compounds+that+promote+oligodendrocyte+differentiation+using+acutely+dissociated+and+purified+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells.</a> BMC Research Notes. 9, 419(2016).</li>
<li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+regeneration%3A+a+recapitulation+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin regeneration: a recapitulation of development.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).</li>
<li>Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+CNS+Myelin+-+from+mechanisms+to+experimental+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).</li>
<li>Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+activity+and+inhibition+in+fetal+and+adult+Oligodendrocyte+Precursor+Cells%3A+effect+on+cell+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation.</a> Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).</li>
<li>Leong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+%28OPCs%29+from+adult+human+brain+expressed+distinct+microRNAs+compared+to+OPCs+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development.</a> Neurology. 82, (2014).</li>
<li>Bribián, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mouse+and+human+brain+OPCs%3A+relevance+for+preclinical+studies+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis.</a> Journal of Clinical Medicine. 9, 1681(2020).</li>
<li>Jäkel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Human+Oligodendrocyte+Heterogeneity+In+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis.</a> Nature. 566, 543-547 (2019).</li>
<li>Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+isolate+a+large+amount+of+functional+oligodendrocyte+precursor+cells+from+the+cerebral+cortex+of+adult+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans.</a> PloS One. 8, 81620(2013).</li>
<li>Baldassarro, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+pure-neuronal+and+neuron-astrocyte+mixed+primary+culture+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation%3A+the+contribution+of+poly%28ADP-Ribose%29+polymerases+and+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Microchemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases.</a> Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).</li>
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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Komplexität von Myelinisierungs-/Remyelinisierungsprozessen und demyelinisierenden Ereignissen macht die Entwicklung prädiktiver In-vitro-Systeme extrem herausfordernd. Die am weitesten verbreiteten In-vitro-Wirkstoff-Screening-Systeme sind meist menschliche Zelllinien oder primäre reine OL-Kulturen, wobei zunehmend komplexere Cokulturen oder organotypische Systeme verwendet werden15. Auch wenn solche Systeme mit High-Content-Technologien gekoppelt sind, bleiben reine OL-Kulturen die Methode d...

Im zentralen Nervensystem (ZNS) sind myelinbildende Zellen (Oligodendrozyten, OLs) und ihre Vorläufer (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, OPCs) für die Entwicklungsmyelinisierung, ein Prozess, der während der peri- und postnatalen Periode auftritt, sowie für den Myelinumsatz und die Myelinreparatur (Remyelinisierung) im Erwachsenenalter verantwortlich1. Diese Zellen sind hochspezialisiert und interagieren anatomisch und funktionell mit allen anderen glialen und neuronalen Komponenten, was sie zu einem grundlegenden Bestandteil der Struktur und Funktion des ZNS macht.
Demyelinisierende Ereignisse sind an verschiedenen ZNS-Verletzungen und-Erkrankungen 2beteiligt und wirken hauptsächlich über multifaktorielle Mechanismen sowohl während der Entwicklung als auch im Erwachsenenalter auf OPCs und OLs. Die undifferenzierten Vorläufer werden durch differenzierende Faktoren, hauptsächlich Schilddrüsenhormon (TH), in einem synchronisierten Prozess3 angetrieben, der den OPC dazu bringt, spezifische Reize zu erkennen und darauf zu reagieren, die Proliferation, Migration zum nicht myelinisierten Axon und Differenzierung in reife OLs induzieren, die wiederum die Myelinscheide entwickeln4. All diese Prozesse werden fein gesteuert und laufen in einem komplexen Umfeld ab.
Aufgrund der komplexen Natur von Myelinisierungs-, Remyelinisierungs- und Demyelinisierungsereignissen besteht ein großer Bedarf an einer vereinfachten und zuverlässigen In-vitro-Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf dem zellulären Hauptakteurliegt:dem OPC 5 .
Damit ein In-vitro-System zuverlässig ist, müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden: die Komplexität der zellulären Umgebung, altersbedingte zellintrinsische Unterschiede, physiologische TH-vermittelte Differenzierung, pathologische Mechanismen und die Robustheit der Daten6. Tatsächlich ist der unerfüllte Bedarf auf diesem Gebiet ein Modell, das die Komplexität des In-vivo-Zustands nachahmt, der durch die Verwendung isolierter reiner OPC-Kulturen nicht erfolgreich erreicht wird. Darüber hinaus betreffen die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Ereignisse, Entzündung und Hypoxie/Ischämie (HI), direkt andere Zellkomponenten, die indirekt die physiologische Differenzierung und Reifung von OPCs beeinflussen können, ein Aspekt, der in zu vereinfachten In-vitro-Modellen nicht untersucht werden kann.
Ausgehend von einem hochprädiktiven Kultursystem besteht die nachfolgende und allgemeinere Herausforderung darin, robuste und zuverlässige Daten zu erzeugen. In diesem Zusammenhang ist das zellbasierte High-Content-Screening (HCS) die am besten geeignete Technik 7 , da es unser Ziel ist, erstens die gesamte Kultur ineinemautomatischen Workflow zu analysieren, die Verzerrung der Auswahl repräsentativer Felder zu vermeiden, und zweitens die automatische und gleichzeitige Generierung von bildgebenden High-Content-Daten zu erhalten8.
Da die Hauptanforderung darin besteht, das beste Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und in vivo-nachahmender Komplexität zu erreichen, stellen wir hier eine hochreproduzierbare Methode zur Gewinnung von OPCs aus neuralen Stammzellen (NSCs) vor, die aus dem fetalen Vorderhirn und der adulten subventrikulären Zone (SVZ) isoliert wurden. Dieses in vitro Modell umfasst den gesamten OPC-Differenzierungsprozess, vom multipotenten NSC bis zur reifen/myelinisierenden OL, physiologisch TH-abhängig. Die resultierende Kultur ist ein dynamisch differenzierendes / reifendes System, das zu einer spontanen Kokultur führt, die hauptsächlich aus differenzierenden OPCs und Astrozyten besteht, mit einem geringen Prozentsatz an Neuronen. Diese Primärkultur ahmt die komplexe In-vivo-Umgebung besser nach, während ihre Stammzellableitung einfache Manipulationen ermöglicht, um die gewünschte Zelllinienanreicherung zu erhalten.
Im Gegensatz zu anderen Drug-Screening-Strategien unter Verwendung von Zelllinien oder Reinkulturen primärer OPCs ermöglicht die hier beschriebene Methode die Untersuchung der Wirkung pathologischer Interferenzen oder therapeutischer Moleküle in einer komplexen Umgebung, ohne den Fokus auf den gewünschten Zelltyp zu verlieren. Der beschriebene HCS-Workflow erlaubt eine Analyse der Zelllebensfähigkeit und Abstammungsspezifikation sowie des linienspezifischen Zelltods und morphologischer Parameter.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platten - unbehandelter</td><td>NUNC</td><td>267313</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (100x)</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>GIBCO</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ziliärer Neurotroper Faktor (CNTF)</td><td>GIBCO</td><td>PHC7015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ohne Glukose</td><td>GIBCO</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>GIBCO</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>GIBCO</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>IFN-& gamma</td><td>Origene</td><td>TP721239</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Origene</td><td>TP723199</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Origene</td><td>TP723210</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Origene</td><td>TP723240</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>GIBCO</td><td>23017-051</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (50x)</td><td>GIBCO</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-enzymatischer Dissoziationspuffer</td><td>GIBCO</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF-AA)</td><td>GIBCO</td><td>PHG0035</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D,L-Ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Origene</td><td>TP720760</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Origene</td><td>TP723451</td><td></td></tr><tr><td>Trijodthyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr></tbody></table>

high-content-screening-differenzierungs- und reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen stammzellen-abgeleiteten oligodendrozyten-vorläuferzellkulturen

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

Die Haupthürde bei der Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Techniken zur Beurteilung der Wirksamkeit therapeutischer Strategien bei komplexen Krankheiten besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und der Wiederherstellung der komplexen In-vivo-Umgebung zu finden, zusammen mit dem Hauptziel, das von allen Screening-Strategien geteilt wird, robuste und zuverlässige Daten zu erhalten, die für die In-vivo-Translation hochprädiktiv sind.
Im Bereich der demyelinisierenden Erkrankungen basiert die Mehrheit der Arzneimittel-Screening-Strategien auf immortalisierten Zelllinien oder reinen Kulturen isolierter primärer Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) von neugeborenen Tieren, was zu starken Verzerrungen aufgrund des Fehlens altersbedingter Unterschiede und eines realen pathologischen Zustands oder einer realen pathologischen Komplexität führt.
Hier zeigen wir den Aufbau eines In-vitro-Systems, das darauf abzielt, die physiologische Differenzierung / Reifung von aus neuronalen Stammzellen (NSC) abgeleiteten OPCs zu modellieren, die leicht manipuliert werden können, um pathologische Zustände nachzuahmen, die für demyelinisierende Krankheiten typisch sind. Darüber hinaus beinhaltet die Methode die Isolierung von fetalen und erwachsenen Gehirnen, wodurch ein System entsteht, das sich dynamisch von OPCs zu reifen Oligodendrozyten (OLs) in einer spontanen Kokultur unterscheidet, die auch Astrozyten umfasst. Dieses Modell ähnelt physiologisch dem Schilddrüsenhormon-vermittelten Myelinisierungs- und Myelinreparaturprozess, was die Zugabe von pathologischen Interferenzen ermöglicht, die Krankheitsmechanismen modellieren. Wir zeigen, wie man die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Erkrankungen (d.h. Hypoxie/Ischämie und Entzündung) nachahmen kann, indem man ihre Wirkung auf die Entwicklungsmyelinisierung und die adulte Myelinreparatur nachbildet und alle Zellkomponenten des Systems durchgehend berücksichtigt, während wir uns auf die Differenzierung von OPCs konzentrieren.
Dieses spontane Mischmodell, gekoppelt mit zellbasierten High-Content-Screening-Technologien, ermöglicht die Entwicklung eines robusten und zuverlässigen Wirkstoff-Screening-Systems für therapeutische Strategien, die darauf abzielen, die pathologischen Prozesse der Demyelinisierung zu bekämpfen und die Remyelinisierung zu induzieren.

Die erste Phase der Kultur kann in der Dauer variieren, abhängig von der Aussaatdichte und davon, ob die Kugeln fetalen oder erwachsenen Ursprungs sind. Darüber hinaus zeigen Oligosphären eine reduzierte Populationsverdopplung im Vergleich zu Neurosphären (Abbildung 1B). Darüber hinaus ist die Produktion von Kugeln aus erwachsenem Gewebe langsamer und es kann 2-3 Wochen dauern, bis Oligosphären erzeugt werden, verglichen mit fötalen, die je nach Aussaatdichte 1-2 Wochen dauern können.
<p...

Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.

High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...

Das Protokoll kombiniert die altersspezifische Isolierung von aus neuronalen Stammzellen gewonnenen spontanen Mischkulturen, die differenzierende Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten, Assays, die pathologische Zustände nachahmen, und robuste, inhaltsreiche Auslesungen enthalten. Diese Eigenschaften ermöglichen es, die Entwicklungsmyelinisierung und die Remyelinisierung bei Erwachsenen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen und in einer Mikroumgebung, die den Beitrag von Astrozyten berücksichtigt, unterschiedlich zu untersuchen. Für die neurale Stammzellisolierung vom embryonalen Tag 13,5 bis 14,5 der fetalen Vorderhirne legen Sie die Köpfe der Embryonen in eine saubere Petrischale mit eiskaltem PBS und entfernen Sie mit einer Pinzette die Haut unter Vergrößerung vom Schädel.Sobald das Gehirn sichtbar und von der Haut befreit ist, drücken Sie das Gehirn mit einer Pinzette aus dem Schädel und entfernen Sie das Kleinhirn. Verwenden Sie die Pinzette, um die Hirnhäute zu entfernen und das isolierte Gewebe in den nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer zu legen. Wenn das gesamte Hirngewebe isoliert ist, ziehen Sie zwei bis drei Proben in 150 Mikroliter nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer pro 1,5 Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln.Am Ende der Inkubation werden 850 Mikroliter Standardmedium in jedes Röhrchen gegeben und zum Mischen pipettiert, bis die Suspension frei von Klumpen ist. Wenn nicht dissoziiertes Gewebe noch sichtbar ist, lassen Sie die Proben zwei Minuten ruhen, damit sich das Gewebe auf dem Boden der Röhrchen absetzen kann. Wenn die Dissoziation abgeschlossen ist, platten Sie Zellen mit einer Dichte von 10 bis 50 Zellen pro Mikroliter in 10 bis 30 Millilitern Neurosphärenmittelkonzentration in einem T25- oder T45-Kolben und legen Sie den Kolben in den Zellkulturinkubator in eine vertikale Position, um die Zellanheftung zu verhindern.Von 2,5 Monate alten erwachsenen Mäusen legen Sie Gehirne von vier bis fünf erwachsenen Mäusen in eine 50-Milliliter-Röhre aus eiskaltem HBSS und legen Sie ein Gehirn mit der ventralen Seite nach unten in rostral-kaudaler Richtung auf einen sterilen, mit Aluminiumfolie bedeckten Kolben, der mit minus 20 Grad Celsius über Nacht kaltem Wasser gefüllt ist. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Riechkolben zu entfernen und zwei bis drei ein Millimeter dicke koronale Scheiben vom Kortex zum optischen Chiasma zu schneiden. Legen Sie die Scheiben in einer ventro-dorsalen Position auf die kalte Oberfläche und identifizieren Sie den Corpus callosum und die beiden lateralen Ventrikel.Isolieren Sie mitHilfe der Vergrößerung die Wände der lateralen Ventrikel, achten Sie darauf, keine Stücke des Corpus callosum aufzunehmen, und legen Sie das isolierte Gewebe in fünf bis 10 Milliliter enzymatischen Dissoziationspuffer für eine 15-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation pipettieren Sie die Gewebe mindestens 50 Mal, bevor Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für weitere 10 Minuten inkubieren. Am Ende der Inkubation neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern Standardkulturmedium und filtern die Gewebesuspension durch einen 70-Mikron-Filter.Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung fünf Minuten lang bei 400 g und suspendieren Sie das Pellet in Saccharoselösung für eine zweite Zentrifugation erneut. Am Ende der Zentrifugation wird das Pellet in einer Rinderserumalbumin-Waschlösung für eine weitere Zentrifugation erneut suspendiert, dann das Pellet in einem Standardkulturmedium zum Zählen erneut suspendiert und die Zellen in einem aufrechten T-25- oder T-45-Kolben plattiert. Für die primäre Neurosphärendifferenzierung fügen Sie der neuralen Stammzellkultur alle zwei Tage grundlegende Fibroblasten- und endotheliale Wachstumsfaktoren hinzu.Wenn die Neurosphären einen Durchmesser von 100 bis 500 Mikrometern erreichen, passieren die Zellen durch mechanische Dissoziation gemäß Standardprotokollen. Behandeln Sie zur Oligosphärendifferenzierung die Zellen alle zwei Tage mit einem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor in Thrombozyten-abgeleitetem Faktor-AA. Wenn die Oligosphären einen Durchmesser von 100 bis 150 Mikrometern erreichen, dissoziieren Sie die Kugeln durch mechanische Dissoziation gemäß Standardprotokollen und säen Sie die Zellsuspension mit einer Dichte von 3000 Zellen pro Quadratzentimeter auf Poly-DL-Ornithin-Laminin-beschichtete Platten.Ersetzen Sie nach drei Tagen den Überstand jeder Kultur durch das gleiche Volumen des Oligodendrozyten-Differenzierungsmediums. Um eine entzündungsvermittelte Differenzierungsblockinduktion durchzuführen, wird nach der Dissoziation der Neurosphären und während der Oligosphärenproduktion die interessierende Zytokinmischung dem Kulturmedium hinzugefügt. Um den Sauerstoff-Glukose-Deprivationszelltod zu induzieren, wird zwei Tage nach der Aussaat in die Multi-Well-Platten der Überstand aus jeder Kultur in einzelne Vertiefungen einer Multi-Well-Platte übertragen.Fügen Sie die Hälfte des Volumens des OGD-Mediums zu den Vertiefungen hinzu und übertragen Sie die Kulturen in eine luftdichte Hypoxiekammer, die mit 95% Stickstoff und 5% Kohlendioxid gesättigt ist. Legen Sie die Kammer in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie nach drei Stunden das Medium in den Kammern durch das Medium, das von der Multi-Well-Kulturplatte abgesehen ist.Nachdem Sie die Qualität der Zellfärbung überprüft haben, wählen Sie im Menü Erfassung der High-Content-Screening-Software feste Belichtungszeit und Mini-Scan und wählen Sie 10 Felder pro Vertiefung und zwei Vertiefungen pro experimenteller Bedingung aus, damit die Analyseparameter in der Teilmenge der Felder für die gesamte Platte eingestellt werden können. Folgen Sie dem Workflow Schritt für Schritt, um den gesamten Algorithmus zu entwickeln. Wählen Sie Bild für jeden Kanal verarbeiten und klicken Sie auf Hintergrundentfernung, um den gewünschten Signalpegel auszuwählen.Um die Kerne durch Kernfärbung zu identifizieren und auszuwählen, klicken Sie auf Primäres Objekt identifizieren, passen Sie den Schwellenwert an, um einzelne Kerne zu identifizieren, und klicken Sie auf Primäre Objekte validieren, um die Schwellenwerte basierend auf Objektbereichen und Position festzulegen. Klicken Sie auf Flecken identifizieren für jeden Kanal, der den spezifischen Linienmarkern entspricht, und legen Sie die Ringwertbreite auf drei und den Abstand auf Null fest, um die Identifizierung der zytoplasmatischen Fluoreszenz zu ermöglichen. Wählen Sie Referenzwerte im Workflow aus, um die Analyse zu erstellen und die automatische Zählung der kondensierten Kerne basierend auf der Kerngröße und der Kernfärbungsintensität sowie der spezifischen markerpositiven Zellen basierend auf der vom Ring identifizierten zytoplasmatischen Fluoreszenz zu ermöglichen, und klicken Sie dann auf Wiedergabe.Während der ersten Phase der Kultur behalten die neuralen Stammzellen ihre Nestinexpression bei. Die Mehrheit der Zellen ist auch NG2-positiv. CNPase-positive Zellen, die dem präolimonaddrozytenstadium entsprechen, sind drei bis sechs Tage nach T3-vermittelter Differenzierungsinduktion nachweisbar, während reife MBP-positive Oligodendrozyten in einem signifikanten Prozentsatz nach sechs bis 12 Tagen in vitro auftreten.Die High-Content-Screening-Analyse ermöglicht den Nachweis einzelner Zellen innerhalb der Kultur durch Kernfärbung und Fluoreszenzintensitätsanalyse. Die Zusammensetzung der Kultur am Ende der Differenzierungsphase unterscheidet sich je nachdem, ob die Kulturen fetalen oder erwachsenen Ursprungs sind, wobei fetale Kulturen eher auf T3-vermittelte Differenzierung ansprechen und einen höheren Prozentsatz reifer Oligodendrozyten erreichen. Beachten Sie, dass, wenn aus neuralen Stammzellen gewonnene Oligodendrozyten-Vorläuferzellen mit einer hohen Dichte ausgesät werden, sie sich aggregieren und replizierende Astrozyten schnell eine konfluente Zellschicht erzeugen, die die Beobachtung der charakteristischen Spinnennetzform reifer Oligodendrozyten verhindert.Entzündungsvermittelte Differenzierungsblockierung induziert eine starke Abnahme der prä- und reifen Oligodendrozyten, wie durch CNPase- und MBP-Färbung sowohl in fetalen als auch in erwachsenen Kulturen nachgewiesen. Eine Zunahme der Anzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen tritt auch in zytokinbehandelten erwachsenen Kulturen auf. Während fetale und adulte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen die gleiche exposition gegenüber entzündlichen Zytokinen aufweisen, reagieren nur fetale Kulturen empfindlich auf Sauerstoff-Glukose-Deprivationstoxizität.Die Methode kann mit jeder Art von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, Differenzierungs- und Reifestörungsprozess, implementiert werden, um neue Strategien zur Bekämpfung von Krankheiten zu testen, die die Myelinisierung oder Remyelinisierung beeinflussen

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Forschung

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Neurowissenschaften

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente...

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Dieses Video zeigt den Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus menschlichen embryonalen Stammzellen, gefolgt von der Reifung von OPCs zu Oligodendrozyten. Dieser Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten eröffnet zahlreiche Möglichkeiten, die Erforschung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer, zu verbessern.

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in Oligodendrozyten

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Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des Zentralnervensystems. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung ihrer Vorläufer, der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, aus der Rattenrinde sowie eine schnelle und zuverlässige quantitative Methode zur Bewertung der Oligodendrogenese in vitro als Reaktion auf experimentelle Faktoren.

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Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

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High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen (Video) | JoVE Journal

High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

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