Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Hallo an alle. Mein Name ist Nicolas Wein. Ich bin leitender Ermittler am Nationwide Children es Hospital in Columbus, Ohio.

Und heute zeigen wir Ihnen ein Video darüber, wie Man eine Hautbiopsie nimmt und in Myoblasten und Myotube umwandelt. Dies ist ein sehr nützliches Werkzeug, um neuromuskuläre Störung zu studieren. Darüber hinaus ist es eine viel schnellere Technologie im Vergleich zu IPSC, weil wir zwei verschiedene Arten von Viren verwenden, um diese Art von Zelle direkt zu bekämpfen.

Dieses Video zeigt das Protokoll zur Etablierung von aus der menschlichen Haut abgeleiteten Fibroblastenkulturen, die Umwandlung in Myoblasten und dann differenzierte Myotubes. Eine Hautbiopsie wird auf die Zellkultur übertragen, um dermale Fibroblasten abzuleiten. Lentiviren, die hTERT- und MYOD-Gene tragen, werden verwendet, um diese Fibroblasten zu transduzieren.

Nach Zugabe von Myoblast Wachstumsmedium mit Doxycyclin ergänzt, wird das MYOD-Gen exprimiert, was die Umwandlung von Fibroblasten in Myoblasten induzieren. Als nächstes wird das Medium auf ein Differenzierungsmedium umgestellt, das auch durch Doxycyclin ergänzt wird. Dann verschmelzen die Myoblasten miteinander und bilden multinukleierte Myotubes.

Die Medien aus der Röhre ansaugen und die Biopsie mit 10 Millilitern, einem x PBS bei Raumtemperatur, dreimal abspülen. Nach der dritten Wäsche die PBS in der Röhre lassen. Gießen Sie die PBS und die Hautbiopsie auf eine 10 Zentimeter quadratische Schale.

Schneiden Sie die Biopsie mit sterilen Skalpellen in möglichst kleine Stücke. Mit einer Pipette ein einzelnes Hautstück auf eine sterile 10 Zentimeter quadratische Schale übertragen. Aspirieren Sie den Überschuss an PBS aus um jedes Stück herum.

Achten Sie darauf, das Stück selbst nicht zu aspirieren. Die Teller teilweise mit dem Deckel bedecken und die Hautbiopsiestücke fünf bis 20 Minuten trocknen lassen. Lassen Sie die Stücke nicht zu lange trocknen.

Sobald die Stücke trocken sind, kippen Sie die Schale in einem 45-Grad-Winkel und fügen Sie langsam 12 Milliliter Fibroblastenmedium in die Ecke der Schale. Senken Sie die Schale, sorgfältig verteilen die Medien, so dass die Stücke nicht von den Medien angehoben werden. Legen Sie das Geschirr in den Brutkasten.

Ersetzen Sie die Medien in fünf bis sieben Tagen und einmal pro Woche danach. Samen primäre Fibroblasten bei 30% der Konfluenz und zwei Brunnen einer 12 Brunnenplatte, etwa 20.000 Zellen pro Brunnen, um am nächsten Tag etwa 50% der Konfluency zu haben. Für die lentivirale Transduktion fügen Sie zwei bis 5 Milliarden virale Genome des hTERP Puromycin Lentivirus und 400 Mikroliter Fibroblastenmedium hinzu.

Fügen Sie die Lentivirus-Mischung zu einem Brunnen hinzu. Zum zweiten Brunnen, fügen Sie nur 400 Mikroliter Fibroblastenmedium. Fügen Sie am nächsten Tag einen Milliliter Medien hinzu.

Ein oder zwei Tage später übertragen Sie die Zellen in eine sechs Brunnenplatte und wachsen sie bis zu 60 bis 70% Konfluenz. Ergänzen Sie das Fibroblastenmedium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin und fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter hinzu. Halten Sie die Zellen unter Auswahl, bis alle Zellen im Kontrollbrunnen mindestens 12 Tage tot sind, wodurch alle zwei bis drei Tage die Medien gewechselt werden.

Samen-H-Diagramm, das Fibroblasten bei 30% Zusammenfluss in drei Brunnen der 12 Brunnenplatte ausdrückt, um am nächsten Tag etwa 50% Zusammenfluss zu haben. Für die lentivirale Transduktion zwei bis fünf Milliarden virale Genome des MYOD Hygromycin B Lentivirus und 400 Mikroliter Fibroblastenmischen mischen und zu zwei Brunnen hinzufügen. Fügen Sie am nächsten Tag einen Milliliter Medium hinzu.

Ein oder zwei Tage später übertragen Sie die Zellen in eine sechs Brunnenplatte und wachsen bis zu 60 bis 70%konfluent. Ergänzen Sie Wachstumsmedien mit 400 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin B.Add zwei Milliliter zu jedem Brunnen. Halten Sie die Zellen unter Auswahl, bis alle Zellen in den Kontrollbrunnen gestorben sind, in der Regel mindestens 12 Tage dauern, die Medien alle zwei bis drei Tage wechseln.

Zur Induktion von Myoblasten, wachsen Fibroblasten, bis sie 70% konfluent sind. Fügen Sie dem Myoblast-Wachstumsmedium acht Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hinzu. Verwenden Sie immer frische Aliquots von Doxycyclin und Medium.

Das Medium sollte direkt vor einem Medienwechsel vorbereitet werden. Darüber hinaus sollte das Doxycyclin nicht eingefroren werden. Das Fibroblastenmedium ansaugen und die Zellen mit PBS abspülen.

Fügen Sie 10 Milliliter ergänzte myoblast Medien. Zwei bis drei Tage später sind die Zellen zu 90 bis 95 % konfluent und ihre Morphologie wird sich geändert haben. Aspirieren Sie die myoblast Wachstumsmedien und spülen Sie die Zelloberfläche mit PBS.

Fügen Sie 10 Milliliter Differenzierungsmedien hinzu, die mit acht Mikrogramm pro Milliliter frisches Doxycyclin ergänzt wurden. Wechseln Sie alle zwei bis drei Tage die Medien, bis Myotubes gebildet werden. Sieben bis zehn Tage nach Beginn der Myotube-Differenzierung sollten die Zellen vollständig differenziert sein, aber dies variiert von einer Zelllinie zur anderen.

Die ersten Fibroblasten können fünf Tage nach der Kultur der Hautstücke entstehen. In Bild B sind Fibroblasten konfluent und bereit, für die weitere Verbreitung auf 75 Zentimeter große Quadratische flaschen verstärkt zu werden. Es ist wichtig, mehrere Durchstechflaschen von Fibroblasten bei niedrigen Durchgangszahlen einzufrieren, wenn Primärzellen in die repromittive Seneszenz eindringen.

Sobald die FM-Zelllinien für die Umwandlung von Fibroblasten in Myoröhren etabliert sind, müssen sich die Fibroblasten bis zu 70% konfluent vermehren, wie in Bild A dargestellt. Es ist wichtig, 80% Konfluenz nicht zu überschreiten, da eine hohe Dichte die Differenzierung beeinträchtigen kann. Nach Zugabe von Doxycyclin zum Medium werden die Zellen innerhalb von zwei bis vier Tagen zu Myoblasten, die sich durch eine längliche Morphologie und parallele Ausrichtung auszeichnen, wie in Bild B zu sehen ist. Differenzierte Myotuben sind in Bild C dargestellt. Die Zeit für Fusion und Differenzierung von Myotuben kann je nach Zellgenotyp zwischen sieben und 21 Tagen variieren. Die Zellen müssen gesammelt oder fixiert werden, bevor sie sich lösen.

Der Beginn der Ablösung kann durch Farbe und Helligkeit der Kanten der Myotube beobachtet werden, wie die Pfeile in diesem Bild zeigen. Durch Immunfluoreszenz bestätigt die Expression reifer muskelspezifischer Proteine die erfolgreiche Umwandlung von Fibroblasten in Myotuben. In diesen Bildern werden drei verschiedene Zellen gezeigt.

Der Grad der Differenzierung variiert von Zelle zu Zelle und kann durch die primäre Mutation bewirkt werden, da dies der Fall von Zellen in den Abbildungen B und C ist. Die weitere Validierung des Modells wurde von RNAseq bestätigt. Wie in dieser Abbildung gezeigt, gibt es mehr als 12.000 differenziell exprimierte Gene, die in FM-Myoröhren im Vergleich zu denen von Skelettmuskeln nachgewiesen wurden. Die signifikante Korrelation zwischen beiden Transkriptomen unterstützt, dass FM-Zellen ein muskelspezifisches Expressionsprofil haben, das zeigt, dass sie ein nützliches und zuverlässiges Ersatzbild für muskelabgeleitete Zelllinien sind.

Um die Nützlichkeit dieses In-vitro-Modells zu veranschaulichen, haben wir eine der häufigsten exonischen Duplizierungen im DMD-Gen verwendet. Die Duplizierung von Exon zwei führt zur Störung des DMD-Leserahmens, und sein Überspringen kann entweder zur Wiederherstellung dieses Leserahmens oder zur Nutzung der internen Ribosom-Einstiegsstelle führen. Diese Therapie wurde bereits mit in vivo-Studien validiert Abbildung A, wir demonstrierten den Proof of Concept durch RTPCR-Analyse dieser speziellen mutierten Zelllinie, mit und ohne Behandlung durch Exon-Skipping.

Der westliche Fleck in Abbildung B zeigt, dass funktionelles Dystrophin-Protein in behandelten Zellen exprimiert wird. Beim Vergleich der Effizienz dieser Therapie mit In-vivo-Modellen unterstützen die Ergebnisse die Zuverlässigkeit der Zelldifferenzierungstechnik und unterstützen deren Einsatz für die Prüfung verschiedener mutationsspezifischer Gentherapien. Vor klinischen Studien erforderlich, um die Wirksamkeit der offiziellen Therapie Unterstützung auf neuromuskuläre Störungen zu testen, abhängig von der Fähigkeit der tierlichen und zellulären Modelle.

Die Entwicklung von Tiermodellen, obwohl sie heutzutage einfacher ist, ist für jede spezifische Mutation keine praktikable Option. Die Erzeugung von Myoblasten durch IPS-Zellen, die von dermalen Fibroblasten abgeleitet werden, ist eine Alternative, aber es ist eine zeitaufwändige Technik. Somit ist dieses Verfahren eine einfache Alternative zur IPS-Generierung, die die direkte Umwandlung von Fibroblasten in Myoblasten ermöglicht.

Es erleichtert den Zugang zu menschlichen Zellmodellen durch die Vermeidung der invasiveren Anwendung von Muskelbiopsien Abschließend ist diese direkte Umwandlung von Fibroblasten in Myoblasten ein leistungsfähiges Werkzeug, um Therapien für neuromuskuläre Störungen im begrenzungsspezifischen Kontext zu testen.