Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

Dieses Protokoll datiert die Modifikation der genomischen Prägung in haploiden embryonalen Stammzellen der Maus fälschlicherweise als die unseres Probanden aufgrund falscher Spermien, was die Erzeugung von selbst gezüchteten Embryonen bei Mäusen ermöglicht. Die genetische Veränderung einer Gamete erfordert in der Regel schwierige Techniken. Mit dieser Methode können elterliche Gameten in hybriden embryonalen Stammzellen manipuliert werden, um sie anschließend als Spermienersatzoption in Mäuse einzuführen.

Da diese Methode die künstliche spezifische Modifikation einer väterlichen Gamete in Embryonen ermöglicht, ist sie besonders für die Untersuchung der genomischen Prägung und Kauterisation geeignet. Dieses Verfahren wird von Charles Etienne Dumeau, einem Mausembryologen aus meinem Labor, demonstriert. Um Halte- und Mikroinjektionspipetten für das Experiment vorzubereiten, ziehen Sie zunächst mit einem Mikropipettenabzieher Kapillaren aus Borosilikatglas mit einer länglichen Form und einer allmählichen Verjüngung.

Zur Vorbereitung von Haltepipetten wird eine gezogene Kapillare mit einem Außendurchmesser von 60 bis 100 Mikrometern in einer Mikroschmiede über die Glasperle auf dem Filament gelegt. Schalten Sie das Filament ein und senken Sie die Kapillare ab, bis sie die Perle berührt. Wenn die Kapillare an der Perle befestigt ist, schalte das Filament aus und ziehe die Kapillare zurück, wodurch die Kapillare mit einem geraden Ende bricht.

Positionieren Sie als Nächstes die gebrochene Kapillarspitze horizontal neben der Glasperle auf dem Filament und erhitzen Sie das Filament, um das Ende zu schmelzen, bis der Innendurchmesser der Kapillarspitze einen Durchmesser von 10 bis 20 Mikrometern erreicht. Positionieren Sie dann die Kapillare etwa einen Millimeter von der Spitze entfernt über der Glasperle und erhitzen Sie das Filament, damit die Kapillare in einem Winkel von 20 Grad gebogen werden kann. Um eine Mikroinjektionspipette vorzubereiten, positionieren Sie eine gezogene Kapillare mit einem Außendurchmesser von etwa sechs Mikrometern über der Glaskugel auf dem erhitzten Filament und senken Sie die Kapillare ab, bis sie die Perle berührt.

Sobald die Kapillare befestigt ist, schalte das Filament aus und ziehe die Kapillare zurück. Die Kapillare bricht mit einem geraden Ende. Bewegen Sie dann die Kapillare etwa einen Millimeter von der Kapillarspitze entfernt über die Glasperle und erhitzen Sie das Filament, damit die Kapillare in einem Winkel von 20 Grad gebogen werden kann.

Um eine intrazytoplasmatische Injektion durchzuführen, geben Sie fünf Mikroliter PVP-Lösung und 20 Mikroliter M2 Medium auf den umgedrehten Deckel einer 10 Zentimeter großen Schale und bedecken Sie die Tropfen mit Mineralöl. Stellen Sie die Schale auf den Tisch und setzen Sie eine Haltepipette auf den Mikromanipulator. Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Mikroinjektionspipette mit Fluorkohlenwasserstofföl zu füllen, und montieren Sie die Pipette auf den Piezoaktuator.

Betrachten Sie durch das Mikroskop und senken Sie die Mikroinjektionspipette in einen Tropfen PVP-Lösung. Wenn die Pipette eingetaucht ist, pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Glas mit dem PVP zu beschichten. Laden Sie eine kleine Menge PVP-Lösung in die Mikroinjektionspipette.

Tauchen Sie die Mikroinjektions- und Haltepipetten in das M2-Medium und konzentrieren Sie sich auf die Pipette am Boden des Tropfens. Übertragen Sie etwa zwei Mikroliter der parthogenen ES-Zellsuspension mit doppeltem Knockout in den M2-Medium-Tropfen und verwenden Sie eine Mundpipette, um 10 M2-Eizellen in denselben Tropfen zu übertragen. Drehen Sie eine Eizelle und üben Sie Unterdruck durch die Haltepipette aus, um die Eizelle so zu halten, dass der perivitelline Raum der Mikroinjektionspipette zugewandt ist, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Metaphase-Zwei-Platte nicht im Weg der Mikroinjektionspipette positioniert ist.

Ziehen Sie eine parthogene ES-Zelle mit doppeltem Knockout in die Spitze der Mikroinjektionspipette und bestätigen Sie den Bruch der Zellmembran. Üben Sie einen leichten Unterdruck auf die Mikroinjektionspipette aus und geben Sie vier Piezoimpulse ab, während Sie die Spitze der Mikroinjektionspipette in Richtung des perivitellinen Raums drücken, um die Zona pellucida zu durchbrechen. Dringen Sie mit einer Mikroinjektionspipette in die Eizelle ein, so dass sich das Oolemma zur gegenüberliegenden Seite dehnt, und legen Sie einen Piezoimpuls an, um das Oolemma zu durchstechen, wobei Sie darauf achten, dass sich das Oolemma entlang des Schafts der Mikroinjektionspipette entspannt.

Injizieren Sie die parthogene ES-Zelle mit doppeltem Knockout mit einem minimalen Volumen an Medium in das Ooplasma und ziehen Sie die Mikroinjektionspipette sanft aus der Eizelle heraus. Lassen Sie die injizierte Eizelle aus der Haltepipette und schieben Sie sie zur späteren Entnahme an die Seite des Mikrotropfens. Wenn alle Eizellen injiziert wurden, geben Sie die Eizellen in eine vorgewärmte Schale in der Mitte, die KSOM-Medium enthält, und inkubieren Sie die Schale eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie aktiviert werden.

Die DNA-Inhaltsanalyse dieser repräsentativen parthogenen ES-Zelllinie mit doppeltem Knockout, die das CAG/EGFP-Transgen trägt, mittels Durchflusszytometrie veranschaulicht die Verteilung von haploiden und diploiden Zellen in den Phasen G0, G1, S und G2 M. Eine Genotypisierung kann durchgeführt werden, um das Fehlen von Wildtyp-Allelen in den H19- und intergenen differentiell methylierten Regionen zu bestätigen. Ein CAG/EGFP-Transgen kann in pathogene ES-Zellen mit doppeltem Knockout eingeführt werden, um ihren Beitrag zu halbklonierten Embryonen durch die Visualisierung der grünen Fluoreszenz unter einem Mikroskop zu untersuchen.

Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass zwei Populationen, die der G2-M-Phase entsprechen, haploide und diploide Zellen nach demukulzäner Behandlung fixiert haben. Das Fehlen eines haploiden 1N-Peaks deutet darauf hin, dass der Ruhezyklus der Zelle weitgehend abgeschlossen war. Nach der Injektion wird die EGFP-Expression in den konstruierten halbklonierten Embryonen nur selten nachgewiesen.

da sich das Zytoplasma von parthogenen ES-Zellen mit doppeltem Knockout in das große Zytoplasma der Eizelle verteilt. Sechs Stunden nach der Aktivierung können bis zu drei Polkörper unter dem Mikroskop beobachtet werden. Der erste und zweite Polkörper der Eizelle und ein pseudopolarer Körper aus dem haploiden ESC.

Um ihre Entwicklungskompetenz zu demonstrieren, können halbklonierte Embryonen bis zum Blastozytenstadium kultiviert werden. Darüber hinaus können reif geborene weibliche Mäuse aus halbklonierten Embryonen im Zweizellstadium gewonnen werden, die in die Eileiter der Empfängerweibchen übertragen werden. Während der Mikroinjektion ist es wichtig, die Plasmamembran haploider embryonaler Stammzellen zu durchbrechen, da dies eine Rolle spielt, um eine Chromosomensegregation zu verhindern, wenn die Eizelle aktiviert wird.

Anstelle von parthenogenetischen haploiden ES-Zellen können auch androgene haploide ES-Zellen verwendet werden, wobei je nach Studienzweck entweder die mütterliche oder die väterliche Gamete als Spermienersatz ausgewählt werden kann.