Name: Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Verwendung parthenogenetischer haploider embryonaler Stammzellen als Spermienersatz zur Erzeugung semi-klonaler Mausembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genomischer Prägung.

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Wir danken Dr. Giulio Di Minin für die Ableitung von phaESC-Linien und Dr. Remo Freimann für den Durchflusszytometriebetrieb. Wir würdigen auch Frau Michéle Schaffner und Herrn Thomas M. Hennek für die technische Unterstützung bei der Embryoübertragung. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Stipendium 31003A_152814/1).

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Klonen von Säugetieren durch somatische Zellkernübertragung (SCNT) wurde in den 1990er Jahren19,20,21entwickelt. Diese Entwicklungen folgten Klonstudien, die 30 Jahre zuvor bei Amphibien durchgeführt wurden22. Die erhebliche Verzögerung spiegelt die Schwierigkeit der Embryologie und der genomischen Prägung bei Säugetieren wider. Die Entwicklung von Säugetier SCNT ist die Grundlage für die Anwendung von haESC für die Substitution von Spermien, die in diesem Protokoll detailliert ist.
Die Zellzyklussynchronisierung ist ein wichtiger Erfolgsfaktor von SCNT23. Dies gilt auch für die Injektion von haESC in diesem Protokoll. Die Einführung eines Spendergenoms in einen Empfänger erfordert, dass die Zellzyklusphasen angepasst werden, um Chromosomenbrüche oder Aneuploidien zu vermeiden, die die Embryoentwicklung abbrechen würden. Semi-Klonen hat die zusätzliche Komplexität, dass zwei Genome und ein Zytoplast kompatibel sein müssen. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass die Injektion von M-Phasen-verhafteten androgenetischen HaESCs bessere Entwicklungsraten von halbgeklonten Embryonen ergab als die Injektion von G1-Phasen-HaESCs in Eizellen7. Dieser Bericht schlägt M-Phase als geeigneten Synchronisationspunkt für das Halbklonen vor. Dementsprechend wurden PhaESCs in Metaphase mit Demekolumcin mit zitotisch verhaftet und in das Ooplasma von MII-Oozyten injiziert, die natürlicherweise in Metaphase II der Meiose verhaftet wurden. Wichtig ist, dass die M-Phasen-Absicherung in Maus-ESCs mit hoher Effizienz erreicht werden kann, was eine hervorragende Synchronisation zwischen Spender- und Empfängerzellzyklen ermöglicht.
Während der Mitose bricht die Kernmembran zusammen und eine Spindel bildet sich, an der sich die replizierten Chromosomen anheften. Nach Der Injektion von M-Phase DKO-phaESCs werden Schwesterchromatide in einen pseudopolaren Körper und die Zygote7 (Abbildung 3E) getrennt. Folglich trägt ein einziger Chromosomensatz aus einem DKO-phaESC zum halbgeklonten Embryo bei. Es ist wichtig, dass die Schwesterchromatiden der DKO-phaESC-Chromosomen nach der Injektion korrekt segregiert werden können. Die Plasmamembran eines intakten DKO-phaESC verhindert die Segregation in einen pseudopolaren Körper. Wir beobachteten in der Tat seltene Fälle, in denen die Plasmamembran von DKO-PhaESCs nicht gebrochen wurde und Embryonen intakte DKO-PhaESCs im Ooplasma nach der Injektion zeigten (Abbildung 3D). Daher ist darauf zu achten, dass die Plasmamembran von DKO-phaESCs durch Pipettieren entfernt wird. Während der Injektion ist es ebenso wichtig, die Störung der meiotischen Spindel der Oozyte zu vermeiden, die zu Chromosomensegregationsdefekten führen und auch Aneuploidie auslösen könnte.
Bei Säugetieren schränkt die genomische Prägung die Anwendung von PhaESCs als Spermienersatz ein. Parthenogenetische HaESCs besitzen eine mütterliche Konfiguration genomischer Abdrücke, während Spermien eine väterliche Konfiguration besitzen. Daher ist die Erzeugung von Vollzeitwelpen nach der Injektion von Wildtyp-PhaESCs als Spermienersatz nicht aufgetreten. Um diese Einschränkung zu überwinden, werden Löschungen der IG-und H19-DMRsin phaESCs entwickelt. Die Modifikation der eingeprägten Expression an den mütterlichen LocI Igf2-H19 und Gtl2-Dlk1 ist ausreichend, um die Konfiguration genomischer Abdrücke zu ändern, um die Erzeugung von halbgeklonten Mäusen mit einer Häufigkeit von über 5,1% auf der Grundlage übertragener 2-Zellen-Embryonen zu ermöglichen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Ausrichtung auf zwei aufgedruckte Gene das Genom von PhaESCs in eine funktionelle väterliche Konfiguration verwandelt, die Spermien in Mäusen ersetzen kann. Dennoch ist für diese Strategie eine permanente genetische Veränderung der PhaESCs erforderlich. Als alternative Strategie kann androgenetischehaESC in Betracht gezogen werden. Androgenetische HaESCs stammen aus dem Spermagenom und besitzen väterliche Abdrücke. Es gab Berichte, dass Wildtyp androgenetische HaESCs als Spermienersatz dazu beitrugen, Vollzeitwelpen in einer Häufigkeit zwischen 1,3% und 1,9% der übertragenen Embryonen4,7,24zu erzeugen. Vollzeit-Welpen wurden auch durch Injektion androgenetische haESCs mit Deletionen der IG- und H19-DMRs in einer Häufigkeit von 20,2% der übertragenen 2-Zell-Embryonen24erhalten. Die erhöhte Effizienz des Semiklonens mit modifizierten androgenetischen HaESCs ist wahrscheinlich, weil Abdrücke in der Kultur instabil werden können. Aufdruckfehler werden durch die genetischen Löschungen kritischer DMRs korrigiert.
Angesichts der Schwierigkeit, genetische Veränderungen direkt in die Eizellen- oder Spermiengenome einzuführen, sind haESCs ein wertvolles Werkzeug, um die elterlichen Genome getrennt zu manipulieren. Die Verwendung von haESCs als Spermaersatz bietet einen bemerkenswerten Vorteil für die Genombearbeitung in der Mauskeimbahn. Eine aktuelle Studie hat CRISPR/Cas9-basierte Genombearbeitung mit der Anwendung von haESCs zur Charakterisierung von Prägungsregionen kombiniert, die für die embryonale Entwicklung entscheidend sind12. Diese Studie analysierte die Rolle der Rasgrf1-DMR in Kombination mit den H19-und IG-DMRsbei der Entwicklung von bimaternalen Mäusen und die Funktion von 7 verschiedenen DMRs bei der Entwicklung von bipaternalen Mäusen. Die Methode zur Substitution von HaESCs für Spermien bildete die Grundlage für genetische Screening-Ansätze zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren innerhalb des DND1-Proteins in der Entwicklung von Urkeimzellen und zur Identifizierung von Genen in der Knochenentwicklung24,25,26. Studien über genomische Prägungen und genetisches Screening zur Identifizierung von Schlüsselfaktoren in der embryonalen Entwicklung sind beträchtliche Ansätze für die Anwendung von haESCs als gametische Genome.

Bei Säugetieren sind Gameten die einzigen Zellen, die genetische Informationen an die nächste Generation übertragen. Die Fusion einer Eizelle und eines Spermatozoons bildet eine diploide Zygote, die sich zu einem erwachsenen Tier entwickelt. Mutationen in gametischen Genomen werden dabei von den Nachkommen vererbt und treiben die genetische Variation in Art1voran. Die Einführung von Mutationen in der Keimbahn wurde angewendet, um genetisch veränderte Tiere für verschiedene biologische Studien zu produzieren, einschließlich der Charakterisierung der Genfunktion und der Krankheitsmodellierung. Sowohl Eizellen als auch Spermatozoen sind endlos differenzierte und hochspezialisierte Zellen, die ihre Proliferation eingestellt haben. Daher ist die direkte Modifikation von Gameten technisch schwierig, und es wurden spezielle Ansätze entwickelt. Genetische Veränderungen können durch Injektion genetisch veränderter ESCs in Blastozysten in die Mauskeimbahn eingeführt werden, wo sie sich in den sich entwickelnden Embryo integrieren und die Keimbahn besiedeln. Darüber hinaus hat sich die genetische Veränderung von Zygoten mit Genom-Editing-Ansätzen, einschließlich des CRISPR/Cas9-Systems, weit verbreitet2.
Kürzlich wurde ein hervorragender Ansatz berichtet, der haESCs als Ersatz für ein gametisches Genom3,4,5,6,7,8anwendet. HaESCs sind Stammzelllinien, die aus der inneren Zellmasse parthenogenetischer oder androgenetischer haploider Blastozysten abgeleitet sind und einen einzigen Satz chromosomen4,7,9,10besitzen. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl parthenogenetische als auch androgenetische HäSchen zum Genom von halbgeklonten Mäusen nach intrazytoplasmatischer Injektion in Eizellen beitragen können. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen können die Genome von haESCs aufgrund ihrer Selbsterneuerungskapazität direkt in der Kultur verändert werden. Die Einführung genetischer Veränderungen in die Keimbahn durch den Ersatz von Spermien durch haESCs ist eine wichtige Methode für biologische Studien. Es sieht die Möglichkeit vor, das mütterliche oder väterliche Genom, das aus parthenogenetischen bzw. androgenetischen HaESCs abgeleitet ist, getrennt zu kulturieren und zu manipulieren. HaESCs können dann als gametischer Genomersatz verwendet werden, was besonders für Studien zu genomischen Prägungen, allelespezifischer Expression und elterlichen spezifischen Prozessen von Vorteil ist.
Bei Mäusen sind sowohl mütterliche als auch väterliche genomische Informationen für die normale Embryoentwicklung erforderlich11. Daher konnten keine Vollzeitwelpen gewonnen werden, wenn wildtypparthenogenetische HaESCs (PhaESCs) injiziert wurden, um das Spermagenom5,8zu ersetzen. Um den Entwicklungsblock zu überwinden, muss die genomische Prägung des mütterlichen Genoms von parthenogenetischen HaESCs zu einer väterlichen Konfiguration korrigiert werden. Dies kann durch Manipulation der differenziell methylierten Regionen (DR) erreicht werden. Bis heute wurden gezielte Löschungen der H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR und Rasgrf1-DMR untersucht, um mütterlich exprimierte Gene in phaESCs3,5,8,12zu unterdrücken. Diese Studien zeigten, dass Deletionen sowohl der H19-DMR als auch der IG-DMRausreichen, um eine mütterliche in eine väterliche Abdruckkonfiguration umzuwandeln, die Spermienchromosomen ersetzen kann. Die intrazytoplasmatische Injektion von PhaESCs, die die beiden DMR-Deletionen in Eizellen tragen, ergab halbklonierte Welpen mit einer Häufigkeit zwischen 5,1% und 15,5% der übertragenen 2-Zellen-Embryonen.
Dieses Protokoll basiert auf der Anwendung von phaESCs mit Löschungen von H19-DMR und IG-DMR, die wir Double-Knockout-PhaESCs (DKO-phaESCs) bezeichnen. Wir geben detaillierte Anweisungen für die Modifikation der genomischen Prägung in phaESCs zur Etablierung von DKO-phaESC-Linien, zur Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen als Ersatz für ein Spermagenom, für die Kultur von halbgeklonten Embryonen in Blastozysten und für die Gewinnung von halbgeklonten Mäusen. Dieses Protokoll ist eine Referenz für Forscher, die eine präzise und direkte Manipulation des väterlichen Genoms und die Erzeugung von halbgeklonten Embryonen und Mäusen erfordern.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>BSA-Fraktion</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>Demecolcin-Lösung</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>DR4 Maus</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>Gefriermedium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC Kultur</td></tr><tr><td></td><td>Gelatine Merck</td><td>G1890</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>Hepes-Lösung</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>Bestrahltes</td><td>MEF Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>LIF (Leukämie-inhibitorischer Faktor)</td>(<td>hausgemacht)</td>-<td>haESC-Kultur</td><td></td></tr> <tr><td>Lipofektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>piggyBac Plasmid mit einem CAG-EGFP-Transgen</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>piggyBac Transposase Plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC</td></tr> <tr>Kultur<td>pX330 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>pX458 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC-Kultur</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotypisierung Proteinase</td></tr><tr><td>K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen mit Zellsiebkappe</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-Gauge 1/2 Zoll Nadel</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 Maus</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD Tiergesundheit</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 I.E</td>. <td>Superovulation</td></tr><tr><td>10 cm Schale</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>4-Well-Platte</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>6 cm Schale</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>Schale in der Mitte</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryonenmanipulation</td></tr><tr><td>Digitale Wippe</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryonenmanipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryonenmanipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>M16 mittel</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>Strontiumchlorid</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryomanipulation</td></tr><tr><td>5ml Spritze</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Borosilikatglas kappilär</td><td>Wissenschaftliches Produkt</td><td>GB100T-8P</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>CellTram 4r Öl</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Haltepipette</td><td>BioMedical</td><td></td> <td>Instruments-Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Mikroinjektion Pipette</td><td>BioMedical</td> <td>Instruments-Mikroinjektion</td><td></td></tr> <tr><td>Microlaoder Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Mikromanipulaor Arme</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidin)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Mikroinjektion</td></tr></tbody></table>

anwendung von maus parthenogenetischen haploid embryonalen stammzellen als ersatz für sperma

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In Organismen mit sexueller Fortpflanzung sind Keimzellen die Quelle totipotenter Zellen, die sich zu neuen Individuen entwickeln. Bei Mäusen erzeugt die Befruchtung einer Eizelle durch ein Spermatozoon eine totipotente Zygote. Kürzlich haben mehrere Veröffentlichungen berichtet, dass haploide embryonale Stammzellen (haESCs) ein Ersatz für gametische Genome sein und zu Embryonen beitragen können, die sich zu Mäusen entwickeln. Hier stellen wir ein Protokoll zur Anwendung parthenogenetischer HaESCs als Ersatz für Spermien vor, um Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion in Eizellen zu konstruieren. Dieses Protokoll besteht aus Schritten zur Vorbereitung von haESCs als Spermienersatz, zur Injektion von haESC-Chromosomen in Eizellen und zur Kultur halbgeklonter Embryonen. Die Embryonen können nach dem Embryotransfer fruchtbare halbgeklonte Mäuse hervorbringen. Die Verwendung von haESCs als Spermienersatz erleichtert die Genombearbeitung in der Keimbahn, Studien zur embryonalen Entwicklung und die Untersuchung genomischer Prägung.

Ziel dieses Protokolls ist es, haESCs als Ersatz für Spermien anzuwenden, um halbgeklonte Embryonen und Mäuse zu erhalten. Zu diesem Zweck wurde eine DKO-phaESC-Leitung mit dem CAG-EGFP-Transgen erzeugt und zur intrazytoplasmatischen Injektion in MII-Oozyten verwendet. Um eine geeignete phaESC-Linie mit einer väterlichen Abdruckkonfiguration zu erhalten, haben wir Gentechnik mit Cas9-Nukleasen durchgeführt. Eine haploide ESC-Linie enthält haploide und diploide Zellen, die aufgrund einer inhärenten Tendenz von haploiden ESCs zur Diploidisierung10entstehen. Ein haploides Chromosom-Set ist eine Voraussetzung für einen erfolgreichen Ersatz des Spermagenoms. Die DNA-Gehaltsanalyse mittels Durchflusszytometrie zeigt die Verteilung von haploiden und diploiden Zellen in G0/G1-, S- und G2/M-Phasen (Abbildung 2A).
Zur Festlegung der DKO-phaESC-Linien wurden Wildtyp-PhaESC-Linien mit piggyBac-Transposonkonstrukten für stabile transgene EGFP-Expression und mit CRISPR/Cas9-Plasmiden zur Erlangung von Deletionen der H19-und IG-DMRs transfiziert. Um diploide ESCs auszuschließen und nur haploide ESCs zu isolieren, die EGFP exdrücken, wurde ein spezifisches Sortiergate definiert (Abbildung 2A). Einzelne haploide EGFP-positive Zellen wurden dann in einzelne Brunnen von 96-Well-Platten einbeschichtet, um Subklone zu erhalten. MEF-Feeder wurden verwendet, um die Beschichtungseffizienz und das Überleben der transfäften PhaESCs zu erhöhen. Nach der Erweiterung der Kulturen wurde eine erste Runde der Genotypisierung von PCR durchgeführt, um Unterklone zu identifizieren, die Löschungen beider DMRs tragen. Nachdem MEF-Feeder aus den Kulturen entfernt worden waren, wurde eine zweite Genotypisierung durchgeführt, um das Fehlen von Wildtyp-Allelen an den H19-und IG-DMRs zu bestätigen (Abbildung 2B). Von insgesamt 135 Subklonen erhielten wir 5 haploide DKO-phESC-Linien, die die gelöschten Allele trugen und frei von Wildtyp-Allelen sowohl der H19-DMRals auch der IG-DMR waren.
Ein CAG-EGFP-Transgen wurde in DKO-phaESCs eingeführt, um ihren Beitrag zu halbgeklonten Embryonen durch Visualisierung grüner Fluoreszenz unter dem Mikroskop zu untersuchen (Abbildung 3A). Für die intrazytoplasmatische Injektion wurden DKO-PhaESCs mit Demekolumcin behandelt, um sie in der M-Phase zu verhaften. So wurde der Zellzyklus von DKO-phaESCs mit dem von MII-Oozyten synchronisiert. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte 2 Populationen, die g2/M-Phase entsprechen, haploid (2n) und diploide Zellen (4n) nach der Behandlung mit Demekolumin (Abbildung 3B). Das Fehlen des 1n haploiden Peaks deutete darauf hin, dass der Zellzyklusstillstand weitgehend abgeschlossen war. M-Phase haploid ESCs wurden dann sortiert und in Eizellen injiziert. Dazu wurde ein einziger DKO-PhaESC in die Mikroinjektionspipette geladen und in das Zytoplasma einer MII-Oozyte injiziert (Abbildung 3C). Die Plasmamembran des DKO-phaESC wurde durch Pipettieren in die Spitze der Mikroinjektionspipette gebrochen.
Nach der Injektion wurde die EGFP-Expression selten in den konstruierten halbgeklonten Embryonen nachgewiesen, da sich das Zytoplasma von DKO-PhaESCs im großen Zytoplasma der Oozyte dispergiert hatte (Abbildung 3D). In seltenen Fällen konnte ein runder Punkt intensiver EGFP-Expression innerhalb des Ooplasmas beobachtet werden. Diese Beobachtung wurde wahrscheinlich durch die unbeabsichtigte Injektion intakter DKO-PhaESCs verursacht. Ein Versagen, die DKO-phaESC-Zellmembran zu brechen, ist wahrscheinlich nicht mit der weiteren Embryoentwicklung vereinbar und sollte vermieden werden. Eine Stunde nach der Injektion wurden Embryonen durch Behandlung mit Strontiumchlorid18aktiviert. Sechs Stunden nach Beginn der Aktivierung wurden bis zu 3 Polarkörper unter dem Mikroskop beobachtet (Abbildung 3E). Diese Polarkörper entsprechen dem ersten und zweiten Polarkörper der Oozyte und einem pseudopolaren Körper aus dem DKO-phaESC7. Darüber hinaus wurden zwei Vorkerne unter einem Differentialinterferenzkontrastmikroskop beobachtet, das dem pronuklearen Stadium von Zygoten nach normaler Befruchtung mit Spermien ähnelte.
Um entwicklungsfähig zu demonstrieren, wurden halbgeklonte Embryonen in das Blastozystenstadium kultiviert (Abbildung 5A). Darüber hinaus wurde eine Vollzeitmaus erhalten, nachdem halbklonierte 2-Zell-Stadium-Embryonen in die Eileiter eines Empfängerweibchens übertragen wurden (Abbildung 5B). Wie erwartet, war die Maus, die von einem halbgeklonten Embryo abgeleitet wurde, ein Weibchen, da weder Eizellen noch eizellenabgeleitete PhaESCs ein Y-Chromosom tragen. Die halb geklonte Maus war völlig normal und produzierte gesunde Nachkommen, wenn sie mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen gepaart wurde. Bislang ist die halbgeklonte Maus seit über 600 Tagen ohne erkennbare gesundheitliche Probleme am Leben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die Anwendung von DKO-phaESCs als Spermienersatz. (A) Ein Zeitrahmen für die Verfahren des Protokolls. (B) Das Schema zeigt die Schritte zum Einrichten von DKO-phaESC-Linien (Schritte 1–6). (C) Das Schema zeigt die Schritte zum Konstruieren halbklonierter Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion eines DKO-PhaESC in eine MII-Oozyte (Schritte 7–14). Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; MEF = Maus embryonaler Fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Einrichtung von DKO-phaESC-Zeilen durch CRISPR/Cas9-vermittelte Löschungen von H19- und IG-DMRs. (A) Flow-Zytometrie-Analyse von PhaESCs nach Transfektion mit PiggyBac-Plasmiden für stabile EGFP-Expression und mit 4 CRISPR/Cas9-Plasmiden. Nicht transfizierte PhaESCs werden als Kontrolle angezeigt. Das DNA-Profil (oben) zeigt die Zellzyklusverteilung von haploiden und diploiden Zellen. G1/S-Phase haploide Zellen, die EGFP exdrücken, werden durch das grüne Tor (unten, rechts) angezeigt. (B) Genotypisierung von PhaESC-Unterklonen, die auf MEFs (erste Genotypisierung) und nach Entfernung von MEFs (zweite Genotypisierung) angebaut wurden. Unterklonierte PhaESC-Zeilen 1, 2, 3 und 4 stellen Wildtypzellen dar, Zellen mit h19-DMR-Deletion, mit einer IG-DMR-Löschungund mit kombinierten H19-bzw. IG-DMR-Deletionen. Die DKO-phaESC-Zeilen 5–8 besitzen sowohl H19-DMR-als auch IG-DMR-Deletionen und sind frei von Wildtyp-Allelen. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; DMR = differenziell methylierter Bereich; MEF = Maus embryonaler Fibroblast; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; WT = Wildtyp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Abbildung 3: Injektion von mitotisch verhafteten DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. (A) Morphologie einer DKO-phaESC-Kultur, die ein CAG-EGFP-Transgen und Streichungen der H19- und IG-DMRträgt; Skala bar = 50 m . (B) Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse von DKO-phaESCs nach Festnahme mit Demecolin für 8 h. DKO-phaESCs ohne Demekoluminbehandlung werden als Kontrolle dargestellt. (C) Morphologie von DKO-phaESCs in der Mikroinjektionspipette. Es wird ein einziges intaktes DKO-phaESC vor (links) und nach (rechts) Das Brechen der Plasmamembran durch Pipettieren gezeigt; Skala bar = 20 m . (D) Konstruierte Embryonen bei 1 h nach Injektion von DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. Ein zusammengeführtes Bild von EGFP-Fluoreszenz und hellem Feld wird gezeigt. Schwarze Pfeilspitzen zeigen runde Flecken intensiver EGFP-Expression nach Injektion intakter DKO-PhaESCs an, die vermieden werden sollten; Skala bar = 50 m. (E) Ein Differentialinterferenzkontrastbild von halbgeklonten Embryonen 6 h nach Beginn der Aktivierung mit Strontiumchlorid wird gezeigt. Weiße Pfeilspitzen zeigen Embryonen mit 3 polaren Körpern an, darunter einen pseudopolaren Körper aus dem injizierten DKO-phaESC; Skalenbalken = 50 m. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Abbildung 4: Schema des Aufbaus für die intrazytoplasmatische Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen. (A) Die Anordnung einer Injektionspipette, einer Haltepipette und einer Oozyte in der Injektionskammer wird angezeigt. α, Biegewinkel der Mikroinjektionspipette. (B) Layout der Tropfen in der Mikromanipulationsschale für intrazytoplasmatische Injektion. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Abbildung 5: Entwicklung von halbgeklonten Embryonen. (A) Präimplantationsentwicklung von halbgeklonten Embryonen in vitro. Die EGFP-Expression wird zunächst an Tag 2 nach intrazytoplasmatischer Injektion bei vierzelligen Embryonen beobachtet. An Tag 4 kann eine intensive EGFP-Expression in Blastozysten beobachtet werden; Skala bar = 100 m . (B) Eine halbgeklonte Maus, die nach dem 2-Zell-Embryotransfer zu einem Empfängerweibchen erhalten wurde. Mit 74 dpp lieferte die halbgeklonte Maus (Pfeilspitze) ihre ersten Welpen (Sternchen) durch natürliche Geburt nach der Paarung mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen. Halbgeklonte Embryonen und die in dieser Abbildung gezeigte halbgeklonte Maus sind identisch mit denen, die in Aizawa et al.3berichtet werden. Abkürzungen: EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; .dpp, Tage nach der Partum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Gelatinelösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Gelatine</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embryonale Stammzelle (HaESC) medium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 l</td>
			<td>18.00 UHR</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 L</td>
			<td>1 M</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 I.E./ml</td>
			<td>10 l</td>
			<td>1.000 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 l</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC-Wartungspuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>HaESC Mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Lösung</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 l</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Waschpuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA-Fraktion</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 ml</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF mittel</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 ml</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 l</td>
			<td>100 m</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lysis-Puffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 l</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS-Lösung</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 l</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 l</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinase K</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>100 g/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Aktivierungsmedium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Strontiumchlorid</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 l</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 l</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>M2 mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 I.E./ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>50 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 I.E./ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>50 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidase medium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>M2 mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>380 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidase</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>20 l</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abkürzungen: LIF = Leukämie-Hemmfaktor; MEF = Maus embryonaler Fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetales Rinderserum; DMEM = Dulbeccos modifizierter Adler Medium; BSA = Rinderserumalbumin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; SDS = Natriumdodecylsulfat; EGTA = Ethylen-Bis(Oxyethylenenitrilo)Tetraessigsäure;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = phosphatgepufferte Saline; PVP = Polyvinylpyrrolidon; hCG = humanes Choriongonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = schwangere Stute Serum Gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Rezept von Medium, Puffer und Lösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namen</td>
			<td colspan="2">Sequenz (5' bis 3')</td>
			<td>Anwendung</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Liste der Oligonukleotide.

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Dieses Protokoll datiert die Modifikation der genomischen Prägung in haploiden embryonalen Stammzellen der Maus fälschlicherweise als die unseres Probanden aufgrund falscher Spermien, was die Erzeugung von selbst gezüchteten Embryonen bei Mäusen ermöglicht. Die genetische Veränderung einer Gamete erfordert in der Regel schwierige Techniken. Mit dieser Methode können elterliche Gameten in hybriden embryonalen Stammzellen manipuliert werden, um sie anschließend als Spermienersatzoption in Mäuse einzuführen.Da diese Methode die künstliche spezifische Modifikation einer väterlichen Gamete in Embryonen ermöglicht, ist sie besonders für die Untersuchung der genomischen Prägung und Kauterisation geeignet. Dieses Verfahren wird von Charles Etienne Dumeau, einem Mausembryologen aus meinem Labor, demonstriert. Um Halte- und Mikroinjektionspipetten für das Experiment vorzubereiten, ziehen Sie zunächst mit einem Mikropipettenabzieher Kapillaren aus Borosilikatglas mit einer länglichen Form und einer allmählichen Verjüngung.Zur Vorbereitung von Haltepipetten wird eine gezogene Kapillare mit einem Außendurchmesser von 60 bis 100 Mikrometern in einer Mikroschmiede über die Glasperle auf dem Filament gelegt. Schalten Sie das Filament ein und senken Sie die Kapillare ab, bis sie die Perle berührt. Wenn die Kapillare an der Perle befestigt ist, schalte das Filament aus und ziehe die Kapillare zurück, wodurch die Kapillare mit einem geraden Ende bricht.Positionieren Sie als Nächstes die gebrochene Kapillarspitze horizontal neben der Glasperle auf dem Filament und erhitzen Sie das Filament, um das Ende zu schmelzen, bis der Innendurchmesser der Kapillarspitze einen Durchmesser von 10 bis 20 Mikrometern erreicht. Positionieren Sie dann die Kapillare etwa einen Millimeter von der Spitze entfernt über der Glasperle und erhitzen Sie das Filament, damit die Kapillare in einem Winkel von 20 Grad gebogen werden kann. Um eine Mikroinjektionspipette vorzubereiten, positionieren Sie eine gezogene Kapillare mit einem Außendurchmesser von etwa sechs Mikrometern über der Glaskugel auf dem erhitzten Filament und senken Sie die Kapillare ab, bis sie die Perle berührt.Sobald die Kapillare befestigt ist, schalte das Filament aus und ziehe die Kapillare zurück. Die Kapillare bricht mit einem geraden Ende. Bewegen Sie dann die Kapillare etwa einen Millimeter von der Kapillarspitze entfernt über die Glasperle und erhitzen Sie das Filament, damit die Kapillare in einem Winkel von 20 Grad gebogen werden kann.Um eine intrazytoplasmatische Injektion durchzuführen, geben Sie fünf Mikroliter PVP-Lösung und 20 Mikroliter M2 Medium auf den umgedrehten Deckel einer 10 Zentimeter großen Schale und bedecken Sie die Tropfen mit Mineralöl. Stellen Sie die Schale auf den Tisch und setzen Sie eine Haltepipette auf den Mikromanipulator. Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Mikroinjektionspipette mit Fluorkohlenwasserstofföl zu füllen, und montieren Sie die Pipette auf den Piezoaktuator.Betrachten Sie durch das Mikroskop und senken Sie die Mikroinjektionspipette in einen Tropfen PVP-Lösung. Wenn die Pipette eingetaucht ist, pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Glas mit dem PVP zu beschichten. Laden Sie eine kleine Menge PVP-Lösung in die Mikroinjektionspipette.Tauchen Sie die Mikroinjektions- und Haltepipetten in das M2-Medium und konzentrieren Sie sich auf die Pipette am Boden des Tropfens. Übertragen Sie etwa zwei Mikroliter der parthogenen ES-Zellsuspension mit doppeltem Knockout in den M2-Medium-Tropfen und verwenden Sie eine Mundpipette, um 10 M2-Eizellen in denselben Tropfen zu übertragen. Drehen Sie eine Eizelle und üben Sie Unterdruck durch die Haltepipette aus, um die Eizelle so zu halten, dass der perivitelline Raum der Mikroinjektionspipette zugewandt ist, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Metaphase-Zwei-Platte nicht im Weg der Mikroinjektionspipette positioniert ist.Ziehen Sie eine parthogene ES-Zelle mit doppeltem Knockout in die Spitze der Mikroinjektionspipette und bestätigen Sie den Bruch der Zellmembran. Üben Sie einen leichten Unterdruck auf die Mikroinjektionspipette aus und geben Sie vier Piezoimpulse ab, während Sie die Spitze der Mikroinjektionspipette in Richtung des perivitellinen Raums drücken, um die Zona pellucida zu durchbrechen. Dringen Sie mit einer Mikroinjektionspipette in die Eizelle ein, so dass sich das Oolemma zur gegenüberliegenden Seite dehnt, und legen Sie einen Piezoimpuls an, um das Oolemma zu durchstechen, wobei Sie darauf achten, dass sich das Oolemma entlang des Schafts der Mikroinjektionspipette entspannt.Injizieren Sie die parthogene ES-Zelle mit doppeltem Knockout mit einem minimalen Volumen an Medium in das Ooplasma und ziehen Sie die Mikroinjektionspipette sanft aus der Eizelle heraus. Lassen Sie die injizierte Eizelle aus der Haltepipette und schieben Sie sie zur späteren Entnahme an die Seite des Mikrotropfens. Wenn alle Eizellen injiziert wurden, geben Sie die Eizellen in eine vorgewärmte Schale in der Mitte, die KSOM-Medium enthält, und inkubieren Sie die Schale eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie aktiviert werden.Die DNA-Inhaltsanalyse dieser repräsentativen parthogenen ES-Zelllinie mit doppeltem Knockout, die das CAG/EGFP-Transgen trägt, mittels Durchflusszytometrie veranschaulicht die Verteilung von haploiden und diploiden Zellen in den Phasen G0, G1, S und G2 M. Eine Genotypisierung kann durchgeführt werden, um das Fehlen von Wildtyp-Allelen in den H19- und intergenen differentiell methylierten Regionen zu bestätigen. Ein CAG/EGFP-Transgen kann in pathogene ES-Zellen mit doppeltem Knockout eingeführt werden, um ihren Beitrag zu halbklonierten Embryonen durch die Visualisierung der grünen Fluoreszenz unter einem Mikroskop zu untersuchen.Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass zwei Populationen, die der G2-M-Phase entsprechen, haploide und diploide Zellen nach demukulzäner Behandlung fixiert haben. Das Fehlen eines haploiden 1N-Peaks deutet darauf hin, dass der Ruhezyklus der Zelle weitgehend abgeschlossen war. Nach der Injektion wird die EGFP-Expression in den konstruierten halbklonierten Embryonen nur selten nachgewiesen.da sich das Zytoplasma von parthogenen ES-Zellen mit doppeltem Knockout in das große Zytoplasma der Eizelle verteilt. Sechs Stunden nach der Aktivierung können bis zu drei Polkörper unter dem Mikroskop beobachtet werden. Der erste und zweite Polkörper der Eizelle und ein pseudopolarer Körper aus dem haploiden ESC.Um ihre Entwicklungskompetenz zu demonstrieren, können halbklonierte Embryonen bis zum Blastozytenstadium kultiviert werden. Darüber hinaus können reif geborene weibliche Mäuse aus halbklonierten Embryonen im Zweizellstadium gewonnen werden, die in die Eileiter der Empfängerweibchen übertragen werden. Während der Mikroinjektion ist es wichtig, die Plasmamembran haploider embryonaler Stammzellen zu durchbrechen, da dies eine Rolle spielt, um eine Chromosomensegregation zu verhindern, wenn die Eizelle aktiviert wird.Anstelle von parthenogenetischen haploiden ES-Zellen können auch androgene haploide ES-Zellen verwendet werden, wobei je nach Studienzweck entweder die mütterliche oder die väterliche Gamete als Spermienersatz ausgewählt werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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