CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Diese Technik ist vorteilhaft, um präzise Mutationen in C.elegans durch CRISPR/Cas9-Genom-Editierung innerhalb eines kurzen Zeitrahmens einzuführen. Diese Technik bietet eine effiziente, optimierte Methode zur Bearbeitung des C.elegans-Genoms, da die Verwendung eines Co-CRISPR-Markers die Wahrscheinlichkeit, positiv editierte Würmer zu identifizieren, erheblich verbessert. Achten Sie darauf, die Durchführung der Mikroinjektionen zu üben und so viele Würmer wie möglich in beide Gonadenarme zu injizieren, um die Chancen auf die gewünschten Bearbeitungen zu erhöhen.

Das Verfahren wird von Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith und Carter Dierlam demonstriert, die alle Studenten meines Labors sind. Um junge adulte Würmer für die Injektion vorzubereiten, pflücken Sie L2, L3 Stadium C.elegans auf einen frischen Bakterienrasen auf einer MYOB-Platte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 20 Grad Celsius. Am nächsten Morgen die Injektionsmischung wie in der Tabelle beschrieben in sterilen nukleasefreien Röhrchen zubereiten und durch Pipettieren mischen.

Inkubieren Sie die Injektionsmischung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Ribonukleoproteinkomplexe zusammenzusetzen, bevor Sie die Mischung durch Zentrifugation herunterschleudern. Verwenden Sie als Nächstes ein Präpariermikroskop, um etwa 30 junge erwachsene Würmer mit weniger als 10 Embryonen in der Gebärmutter zu entnehmen, und injizieren Sie beide Keimdrüsenarme jedes Wurms mit ein paar Pikolitern Injektionsmischung pro Arm. Verwenden Sie nach der Mikroinjektion ein Rückgewinnungsgerät, um injizierte Würmer vorsichtig aus dem Injektionspad auf eine 60-Millimeter-MYOB-Platte zu pipettieren, die mit OP50 E.coli besiedelt ist.

Lassen Sie die injizierten Würmer eine Stunde lang bei Raumtemperatur genesen. Am Ende der Erholungsphase übertragen Sie jeden injizierten Wurm mit einem Platindrahtpickel auf eine 35-Millimeter-MYOB-Agarplatte mit einzelnen Samen und lassen Sie die Würmer bei 20 Grad Celsius Eier legen. Nach 24 Stunden werden die injizierten Würmer auf neue individuelle 35-Millimeter-Platten übertragen.

Verwenden Sie drei bis vier Tage nach der Injektion ein Präpariermikroskop, um Platten zu identifizieren, die F1-Nachkommen aufweisen, die Rollphänotypen aufweisen, was dadurch angezeigt wird, dass sich der Körper des Tieres um seine Längsachse dreht, während sich die Tiere in einem kreisförmigen Muster bewegen, und dumpige Phänotypen, die sich durch eine kürzere und kräftigere Physiologie im Vergleich zu Kontrolltieren im gleichen Entwicklungsstadium zeigen. Übertragen Sie 50 bis 100 F1-Walzenwürmer auf ihre eigenen Platten und lassen Sie die Würmer ein bis zwei Tage lang Eier legen. Nach ein bis zwei Tagen der F2-Wurmproduktion wird jede einzelne F1-Walzenmutter von einer nummerierten Platte in das entsprechende nummerierte PCR-Röhrchen mit 2,5 Mikrolitern Lysepuffer überführt, ergänzt durch eine 1:100-Verdünnung von 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K. Frieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang bei minus 30 Grad Celsius ein, bevor Sie die Würmer in einem Thermocycler lysieren. wie angegeben.

Am Ende des Zyklus fügen Sie 12,5 Mikroliter 2X PCR-Mischung hinzu, die Desoxynukleosidtriphosphate, DNA-Polymerase, Magnesiumchlorid und Ladefarbstoff, einen Mikroliter 10 mikromolare Forward-Primer, einen Mikroliter 10-mikromolaren Reverse-Primer und genug steriles Wasser enthält, um das Reaktionsgemisch auf 25 Mikroliter pro lysierter Wurmprobe zu bringen. Führen Sie dann die Proben wie angegeben auf dem Thermocycler aus. Um nach Bearbeitungen mit einer Länge von weniger als 50 Basenpaaren zu suchen, übertragen Sie 10 Mikroliter jeder PCR-Reaktion in ein neues Röhrchen und fügen Sie jedem Röhrchen fünf Mikroliter des Restriktionsaufschluss-Mastermixes hinzu.

Inkubieren Sie die Verdauungsreaktionen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation erhitzen und aktivieren Sie die Verdauung mit einer 10- bis 15-minütigen Inkubation bei 65 Grad Celsius. Laden Sie dann die gesamte Reaktion aus jedem Röhrchen in eine einzelne Vertiefung eines 1%igen bis 2%igen Agarosegels und lassen Sie das Gel bei 110 Milliampere laufen, bis eine ordnungsgemäße Bandentrennung erreicht ist.

Visualisieren Sie am Ende des Laufs Agarosegele unter UV-Licht, um die DNA-Bandengrößen zu ermitteln. Positiv editierte Würmer weisen aufgrund der Editierung mit der Reparaturschablone eine zusätzliche DNA-Bande in der erwarteten Größe auf, die die Restriktionsstelle an der gewünschten Stelle innerhalb des Wurmgenoms trägt. Entnehmen Sie acht bis 12 Wildtyp-aussehenden, nicht rollenden F2-Würmern aus den jeweils positiv editierten F1-Walzenwurmplatten und lassen Sie die Würmer ein bis zwei Tage lang Eier legen und Nachkommen zeugen.

Identifizieren Sie dann die homozygoten Wurmlinien, wie sie bei positiv editierten Würmern nachgewiesen wurden, und analysieren Sie die Sequenzierungsergebnisse mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware, um das Vorhandensein der Bearbeitung gemäß den Standardprotokollen zu bestätigen. Hier können die genomische DNA und das designte CRISPR-RNA- und Reparatur-Template für das C.elegans rbm-3.2-Gen betrachtet werden. In dieser repräsentativen Analyse erwiesen sich sieben von 73 F1-Würmern als positiv für die Bearbeitung.

Uneditierte Würmer wiesen bei der EcoRI-Verdauung ein einzelnes DNA-Fragment von 445 Basenpaaren auf, während Würmer, die ein vorzeitiges Stopp-Codon im rbm-3.2-Gen trugen, bei der EcoRI-Verdauung zwei Fragmente bei 265 und 166 Basenpaaren aufwiesen. Heterozygote editierte Würmer wiesen bei der EcoRI-Verdauung drei Fragmente auf. Sechs von 12 F2-Würmern aus den identifizierten positiven F1-Heterozygoten erwiesen sich als homozygot für den interessierenden Edit.

Die genomische DNA einer identifizierten homozygoten editierten Wurmlinie konnte dann verwendet werden, um eine DNA-Sequenzierungsreaktion in Gang zu setzen, die das Vorhandensein der Bearbeitung in ihrem homozygoten Zustand bestätigte. Achten Sie darauf, dass die Editierreagenzien und Screening-Primer korrekt ausgelegt sind und dass die Injektionsmischung richtig vorbereitet ist. Eine genaue Mikroinjektion ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung.

Im Anschluss an dieses Verfahren können gegebenenfalls eine phänotypische Validierung des Editiers und eine Gen- und Proteinexpressionsanalyse durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Genomeditierung zu überprüfen.