Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)

Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen zur physiologischen Funktion von Gonaden zu beantworten, einschließlich der Rolle von Sexualsteroiden bei der Plastizität und Regulation des neuroendokrinen Systems bei Teleosten und in größerem Maße bei Wirbeltieren. Dieses Protokoll ermöglicht es, eine Gonadektomie mit hoher Erfolgsrate in kleinen Modell-Teleost-Medeka durchzuführen, die in der Forschungsgemeinschaft weit verbreitet ist. Um erfolgreich zu sein und eine hohe Überlebensrate zu erreichen, erfordert diese Technik ein angemessenes Training, insbesondere bei der Beurteilung der Gonaden und dem Nähen der Fische.

Beginnen Sie damit, den Fisch aus der Narkoselösung zu nehmen und ihn waagerecht auf die Seite unter ein Seziermikroskop zu legen. Um die Ovariektomie bei Frauen durchzuführen, kratzen Sie die Schuppen im Schnittbereich ab. Machen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig einen zwei bis 2,5 Millimeter großen Schnitt zwischen den Rippen und der Becken- und Analflosse.

Kneifen Sie den Bauch des Fisches vorsichtig ein, während Sie die Eierstöcke mit einer feinen Pinzette mit breiter Spitze herausnehmen. Es ist wichtig, einen Bruch der Rippen zu vermeiden, der zum Tod führen kann. Mit der feinen Zange das Ende der Eierstöcke abschneiden und beiseite legen.

Um die Orchidektomie bei Männern durchzuführen, machen Sie einen Schnitt zwischen den Rippen oberhalb des Anus und öffnen Sie den Schnitt langsam mit einer feinen Pinzette. Fassen Sie die Hoden vorsichtig mit der Pinzette und nehmen Sie sie langsam heraus. Schneiden Sie dann das Ende der Hoden ab, um sie vollständig zu entfernen.

Nachdem Sie den Eingriff durchgeführt haben, nähen Sie den Schnitt bei Männern und Frauen auf ähnliche Weise. Legen Sie den Nylonfaden neben den Schnittbereich und stechen Sie die Haut von der rechten Seite des Schnitts durch die innere Körperhöhle, wobei Sie den Faden mit einer ultrafeinen Pinzette aufnehmen. Durchstechen Sie dann die Haut von der linken Seite des Schnitts durch die äußere Körperhöhle, um den Faden herauszunehmen.

Schließen Sie die Schnittöffnung, machen Sie zwei Knoten und schneiden Sie den überschüssigen Faden ab. Legen Sie die Fische in das isotonische Auffangwasser und lassen Sie sie dort mindestens 24 Stunden, bevor Sie sie in das Aquarium umsetzen. Bauen Sie die Blutschublade zusammen, indem Sie eine Glasnadel an der Silikonkapillare befestigen.

Brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette mit breiter Spitze und beschichten Sie die Innenseite der Nadel durch Saugen und Blasen mit einer gerinnungshemmenden Lösung. Richten Sie die Nadel auf den Stielbereich des Fisches, zielen Sie auf die kaudale Stielvene, und entnehmen Sie das Blut mit dem Mund, bis mindestens 1/4 des Gesamtvolumens der Nadel gefüllt ist. Lassen Sie die Nadel los und legen Sie ein Stück Klebeband in die Nähe der scharfen Seite.

Setzen Sie einen Deckel mit einem Loch auf ein Auffangröhrchen und stecken Sie die Nadel in das Röhrchen durch das Loch mit der Nadelspitze nach außen. Legen Sie die Fische in das Auffangwasser und lassen Sie sie dort mindestens 24 Stunden, bevor Sie sie in das Aquarium umsetzen. Schleudern Sie das Blut ein bis zwei Sekunden lang mit dem 1.000-fachen G, um das Blut im Röhrchen zu sammeln.

Die Überlebensrate nach einer Ovariektomie (OVX) bei Frauen betrug 100 % und bei Männern nach einer Orchidektomie 94 %. Alle Fische überlebten die Blutentnahme. Scheinoperierte Weibchen zeigten die OV-Position.

Alle Eizellen wurden befruchtet und gingen in die Embryonalentwicklung. Wenn die Gonadektomie korrekt durchgeführt wurde, veränderte sich die Körperform des Fisches leicht und es blieben keine Stücke der Gonaden zurück. Der Schnitt und die Naht verschwanden vier Wochen nach der Gonadektomie vollständig.

Nach vier Monaten zeigten alle Fische immer noch einen gesunden Phänotyp und es wurde kein Gonadengewebe mehr gefunden. Die Blutanalyse bei Weibchen zeigte, dass der E2-Spiegel bei OVX-Fischen 24 Stunden nach der Operation signifikant niedriger war als bei scheinoperierten Fischen. Nach vier Monaten war der E2-Gehalt in OVX-Fischen immer noch deutlich niedriger als in scheinbetriebenen Fischen.

Teilweise OVX-Fische, bei denen nur 1/3 bis 1/2 der Gonade entfernt wurde, wiesen signifikant niedrigere E2-Spiegel auf als scheinbetriebene Fische und signifikant höhere E2-Spiegel als vollständig OVX-Fische. Die 11-KT-Konzentration bei orchidektomierten Männchen war 24 Stunden nach der Operation signifikant niedriger als bei scheinoperierten Fischen. Nach vier Monaten war der 11-KT-Gehalt immer noch niedriger als bei scheinbetriebenen Fischen.

Teilweise orchidektomierte Fische wiesen niedrigere 11-KT-Spiegel auf als scheinoperierte Fische und höhere Spiegel als vollständig orchidektomierte Fische. Um sicherzustellen, dass der Eingriff erfolgreich ist, ist es wichtig, die Gonade so vorsichtig und vollständig wie möglich zu entfernen, ohne andere Organe im Inneren des Fisches zu beschädigen. Da bekannt ist, dass Sexualsteroide eine wichtige Rolle bei der Plastizität von Gehirn- und Hypophysenzellen spielen, bietet diese Technik ein leistungsfähiges Werkzeug, um die zugrunde liegenden Mechanismen in kleinen Teleostmodellen zu untersuchen.