Name: Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Lernen Sie die Laser-Doppler-Perfusion-Imaging-Technik zur Messung der Blutflusswiederherstellung in der Mäusehinterpfote. Diese nicht-invasive Methode unterstützt Forscher bei der Untersuchung von Mikrozirkulation und Wundheilung.

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Diese Arbeiten wurden mit dem Einsatz von Einrichtungen und Ressourcen im VA Puget Sound Health Care Center durchgeführt. Das Werk ist das des Autors und spiegelt nicht unbedingt die Position oder Politik des Department of Veterans Affairs oder der Regierung der Vereinigten Staaten wider. Dr. Tang wird derzeit über die VA (Merit 5 I01 BX004975-02) finanziert.

Tierversuche wurden nach einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigt wurde.
1. Scanner-Vorbereitung
<ol><li>Passen Sie die Scannerhöhe so an, dass der Abstand zum gescannten Motiv ca. 30 cm beträgt.</li>
	<li>Schalten Sie den Imager ein und starten Sie die zugehörige Software.</li>
	<li>Öffnen Sie das Messprogramm. Wenn die Software korrekt mit dem Scanner kommuniziert, wird die Warnung zum Einschalten des Infrarotlasers angezeigt.</li>
	<li>Kalibrieren Sie die Maschine mit vom Hersteller bereitgestellten Standards (nicht im Video dargestellt und hängen vom spezifischen Modell der verwendeten Maschine ab).</li>
	<li>Passen Sie die Scannereinstellungen so an, dass sie für das Hintergrundmaterial und die Beleuchtungseinrichtung im Raum geeignet sind.<ol>
<li>Stellen Sie die Verstärkungsstufen DC FLUX und CONCgemäß den Anweisungen des Herstellers ein (nicht im Video gezeigt).</li>
		<li>Legen Sie den Hintergrundschwellenwert fest, indem Sie den Laserstrahl auf das schwarze Hintergrundmaterial zeigen, und drücken Sie Auto BK Set.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Maus-Vor-Scan-Vorbereitung
<ol><li>Richten Sie die isoflurane Induktionskammer mit entsprechender Aufräumarbeiten des Abgases ein. HINWEIS: Das Platzieren der Induktionskammer auf einem Wärmepolster hilft, den Temperaturverlust der Maus während der Anästhesieinduktion zu verhindern.</li>
	<li>Schalten Sie die homöotherme Decke ein, die im Scanbereich unter einer nicht reflektierenden Oberfläche (in diesem Fall einem schwarzen Neoprengewebe) platziert wird. Stellen Sie die homeothermische Decke ein, um eine Körpertemperatur von 37 °C beizubehalten.</li>
	<li>Positionieren Sie den Temperaturfühler für die hausotherme Decke und das Schmiermittel so, dass sie zum Einführen bereit sind.</li>
	<li>Legen Sie die Anästhesiemaske und das Aufräumsystem im Scanbereich.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie die Maus mit einem Isofluran-Verdampfer. Stellen Sie die Sauerstoffrate auf 1 L/min des Durchflusses ein und stellen Sie das Isofluran e.V. auf 4% für die Anästhesieinduktion ein. Schalten Sie den Fluss in die Anästhesie-Induktionskammer ein, und die Atemfrequenz der Maus verlangsamt sich. Eine angemessene Anästhesie wird erreicht, wenn die Maus ihren Rechtenreflex verliert.</li>
	<li>Die Maus mit angeschlossenem Abgasfänger auf eine Anästhesiemaske/Nasenkegel geben und das Isofluran auf 1,5% einstellen. HINWEIS: Dieser Anästhesiespiegel ist in der Regel ausreichend, um die Maus während des Scannens relativ still liegen zu halten, ist aber nicht dazu gedacht, chirurgische Anästhesieniveaus zu bieten, so dass die Tiefe der Anästhesie nicht überprüft wird. Die Änderung des Isofluranspiegels bewirkt Veränderungen des Herzschlags, der Atmung und dermaler Perfusion, so dass ein konsistenter Prozentsatz während jedes Zeitverlaufsexperiments und für alle Versuchspersonen verwendet werden sollte. Alternative Anästhesie-Techniken wie IP-Injektion von Ketamin Xylazin kann auch verwendet werden, aber die gleiche Anästhesie-Technik sollte während jeder Zeit-Kurs-Studie verwendet werden, da verschiedene Anästhetika dermal perfusion unterschiedlich beeinflussen.</li>
	<li>(Optional je nach Scanbereich) Wenn die geplante Region von Interesse gescannt werden, durch Pelz bedeckt ist, verwenden Sie einen kleinen elektrischen Trimmer oder Enthaarungscreme, um das Haar aus dem Bereich des Interesses zu entfernen. HINWEIS: Die Enthaarungscreme sollte vollständig entfernt und die Maushaut vor dem Scannen getrocknet werden.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus in der entsprechenden Scanposition auf der schwarzen, nicht reflektierenden Oberfläche, die die homöitome Decke bedeckt, und bestätigen Sie, dass beide Hinterbeine während des Ausgleichs und des Scannens auf der Wärmequelle verbleiben (Abbildung 1). HINWEIS: Es ist wichtig, beide Füße auf der homöothermen Decke zu halten, um regionale Temperaturschwankungen zu verhindern.</li>
	<li>Setzen Sie den geschmierten rektalen Temperaturfühler ein, der mit der homeothermischen Decke verbunden ist.</li>
	<li>Die Maustemperatur auf die gewünschte Scantemperatur (37 °C) ausdemieren; ca. 5-10 Minuten.</li>
	<li>Wählen Sie Scanner-Setup aus,auf das über das obere Menü oder über das Scanner-Setup-Symbol zugegriffen werden kann. Passen Sie den Scanbereich an, indem Sie die X-Y-Koordinaten ändern, um den Interessenbereich zu berücksichtigen. Die Scangeschwindigkeit hängt von der Scanauflösung ab. Eine höhere Auflösung führt zu längeren Scanzeiten. Für wiederholtes Scannen mit Fokus auf globale Perfusion, im Gegensatz zu einer höheren Auflösung, die sich auf anatomische Perfusion konzentriert, ist eine Scangeschwindigkeit von 4 ms/Pixel ausreichend. HINWEIS: Höhere Auflösung und Einzelscan sollten in Betracht gezogen werden, wenn der Forscher versucht, die sich entwickelnde Kollateralzirkulation direkt zu untersuchen (am besten im ventralen Oberschenkel und Kalb abgebildet, wo es näher an der Haut ist). Wiederholter Scan mit niedrigerer Auflösung/Geschwindigkeit (z. B. 4 ms/Pixel) ist ausreichend, wenn die globale Perfusion bis zum Endorgan des Mausfußpads bewertet wird. Die im Video gezeigte Software lädt automatisch die zuvor verwendete Vorlage für Scanbereich, Geschwindigkeit und Auflösung beim Neustart, oder sie kann aus einer gespeicherten Datei abgerufen werden, wenn verschiedene Bereiche von Interesse für verschiedene Experimente verwendet werden.</li>
	<li>Wenn Sie Wiederholungsscans durchführen, wählen Sie die Registerkarte Wiederholen und Zeilenscannen aus. Die Anzahl der Scans kann geändert werden (in diesem Fall 3 Scans) sowie das Wiederholungsintervall. Die Mindestzeit für das Wiederholungsintervall wäre die geschätzte Scanzeit, die im abgeblendeten Bereich auf der rechten Seite des Feldes angezeigt wird, der durch Scanbereich und Scanauflösung bestimmt wird. Wenn Sie einige Sekunden hinzufügen, kann der Benutzer die Maus zwischen den Scans anhalten und ggf. neu positionieren.</li>
</ol>3. Scannen
<ol><li>Wählen Sie die Registerkarte Bildscan und die Schaltfläche Markieren aus. Der Laser wird bewegt, um den Scanbereich zu skizzieren. Passen Sie die Mausposition so an, dass sich das zu scannende Ziel innerhalb des markierten Bereichs befindet. HINWEIS: Beim Fußpolster- oder Fußpolster- und Wadenscannen bietet die anfällige Positionierung mit verlängerten Hinterbeinen einen konsistenteren Bereich von Interesse als die Supine-Positionierung. Die Femoralarterie und die halsbrecherische Arterie und die Kollateralen sind sehr nahe an der ventralen Oberfläche des Oberschenkels und des Kalbs, so dass die Supine-Positionierung bevorzugt wird, wenn diese Bereiche von Interesse verwendet werden.</li>
	<li>Starten Sie die wiederholte Messung, indem Sie das Symbol Scannen wiederholen auswählen und die Wiedergabetaste drücken, um den Scan zu starten.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Scanabstand im Popup-Fenster, und klicken Sie auf OK, um mit dem Scannen zu beginnen.</li>
	<li>Überwachen Sie die Maus beim Scannen auf Mausbewegung; Wenn sich die Maus so weit bewegt, dass sich die Hintermaus nicht mehr im Scanbereich in der Mitte eines Scans befindet, starten Sie den Scan neu. Kleine Variationen in der Maus-Hinterdpa-Position können in der Analysesoftware untergebracht werden.</li>
	<li>Überwachen Sie die Maustemperatur während des Scanvorgangs, da sie auch bei Verwendung der homeothermischen Decke schwanken kann. Wenn die Maustemperatur zu stark variieren, kann dies zu erheblichen Abweichungen zwischen den Scans führen. Im Allgemeinen führt ein Temperaturbereich von 36,8-37,2 °C zu akzeptablen Daten.</li>
	<li>Speichern Sie den erfassten Scan unter dem Fenster Speichern als mit einem Dateinamen, der Mausbezeichner und Zeitpunkt für eine einfachere Datenanalyse enthält. Geben Sie maus- und Zeitpunktdetails ein, falls gewünscht, im Fenster mit den Betreffdetails.</li>
	<li>Schalten Sie das Isofluran aus und entfernen Sie die rektale Temperatursonde.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die rektale Temperatursonde mit 70% Ethanol, so dass sie für den Einsatz in der nächsten Maus bereit ist.</li>
	<li>Lassen Sie die Maus von der Anästhesie bis zu dem Punkt erholen, an dem sie einen Rechtenreflex anzeigt, indem Sie von der Supine-Position in die anfällige Position kippen, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen. HINWEIS: Die Erholung kann entweder auf einer Wärmedecke für Isofluran durchgeführt werden, da die Erholung sehr schnell erfolgt, oder in einem erwärmten Rückgewinnungskäfig für Ketamin/Xylazin.</li>
</ol>4. Erfassen von LDPI-Daten (Abbildung 3)
<ol><li>Öffnen Sie das Imaging Review-Softwareprogramm.</li>
	<li>Wechseln Sie zum Dateimenü, öffnen Sie die gespeicherte Datei, und suchen Sie sie.</li>
	<li>Wählen Sie das ROI-Symbol in der Symbolleiste aus.</li>
	<li>Wählen Sie die Schaltfläche Polygon hinzufügen aus.</li>
	<li>Verfolgen Sie den Bereich von Interesse (ROI) für die Steuerung hinterder Glied mit der Maus. Die Polygonablaufverfolgung muss nicht genau sein, da der graue Hintergrund nicht in die berechneten Durchschnittswerte einbezogen wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.5 für das chirurgische Hinterglied.</li>
	<li>Wählen Sie das Symbol Statistik aus, um das Bild-ROIs-Statistikergebnisfenster (PU) zu öffnen.</li>
	<li>Exportieren Sie die Ergebnisse für Polygon 1 (Control hindlimb) und Polygon 2 (chirurgisches Hinterglied) in ein Datenerfassungsarbeitsblatt per Kopie/Einfügen.</li>
</ol>5. Analyse
<ol><li>Erfassen Sie die Daten als Chirurgisches/Kontrollverhältnis für jeden Scan.</li>
	<li>Verwenden Sie die gemittelte Operation/Steuerung für alle drei Scans für den Datenpunkt für diese bestimmte Maus zu diesem Zeitpunkt. Aufgrund der biologischen Variabilität in der Reaktion auf Hinterlimb-Ischämie werden im Allgemeinen 8-10 Mäuse pro Zeitpunkt benötigt, um reproduzierbare Ergebnisse mit einem Standardfehler von 10 % zu erzielen. HINWEIS: Bevor die Maus von der Anästhesie erholt werden kann, lohnt es sich, eine schnelle Analyse der wiederholten Scans durchzuführen, um zu überprüfen, ob die Daten zu variabel sind (z. B. mehr als 100-150 Perfusionseinheiten zwischen den Scans 1-3). Eine hohe Streuung zwischen wiederholten Scans deutet darauf hin, dass die Maus während des Scans nicht vollständig ausgeglichen wurde (Abbildung 2), und ein Wiederholungsscan kann durchgeführt werden, ohne einen Datenpunkt zu verlieren, was auftreten würde, wenn die Bilder erst zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden. Das Ändern der Farbpalette zur Optimierung des dynamischen Bereichs der angezeigten Flusswerte kann erforderlich sein, um die Scanvariation besser anzuzeigen (Abbildung 2).</li>
</ol>

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</ol>

Dr. Tang hat keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Konsistente Technik ist entscheidend für die Erzielung zuverlässiger Ergebnisse mit LDPI. Die gleiche Anästhesie, Temperatureinstellungen, Mausposition und Interessenbereich sollten während des gesamten Zeitverlaufs verwendet werden. Verschiedene Anästhetika führen zu höheren oder niedrigeren Perfusionswerten9. Isoflurane Anästhesie ist bequem wegen seiner schnellen Beginn und Entstehung sowie allgemeine Sicherheit. Ein konsistenter Prozentsatz von Isofluran sollte als Tiefe der Anästhesie mit die...

Hautgeschwüre mit unzureichender Wundheilung ist eine der Hauptursachen für Amputationen bei menschlichen Patienten1. Eine adäquate Wundheilung erfordert ein höheres Maß an arterieller Perfusion, als erforderlich ist, um intakte Haut zu erhalten, die bei Patienten mit peripherer arterieller Erkrankung2,3,4beeinträchtigt wird. Mehrere andere rheumatologische Erkrankungen und Diabetes können auch zu einer gestörten und unzureichenden Mikrozirkulation der Haut führen, um Wunden zu heilen5,6. Viele Diabetiker haben eine begleite periphere arterielle Erkrankung, wodurch sie einem besonders hohen Risiko für eine Amputation ausgesetzt sind. Laser Doppler Perfusionsbildgebung (LDPI) wird in klinischen Situationen verwendet, um die Mikrozirkulation der Haut zu bewerten, sowie in Forschungssituationen, um den Blutfluss und die Blutflussrückgewinnung nach experimenteller Hindlimb Ischämie, Ischämie-Reperfusion und mikrochirurgischen Klappen7zu bewerten.
Das LDPI-System projiziert einen Low-Power-Laserstrahl, der von einem Scanspiegel abgelenkt wird, um sich über einen Bereich von Interesse zu bewegen. Dies unterscheidet sich von der Laser-Doppler-Flowmetrie, die eine Perfusionsmessung für den kleinen Gewebebereich in direktem Kontakt mit der Fließsonde8ermöglicht. Wenn der Laserstrahl mit bewegtem Blut in der Mikrovaskulatur interagiert, durchläuft er eine Doppler-Frequenzverschiebung, die vom Scanner fotografiert und in beliebige Perfusionseinheiten umgewandelt wird. Da LDPI eine lichtbasierte Technik ist, ist sie in Bezug auf die Penetrationstiefe auf 0,3-1 mm begrenzt, was bedeutet, dass die dermale Perfusion zum größten Teil7bewertet wird. Dermaler Durchfluss kann durch die Hauttemperatur und das sympathische Nervensystem verändert werden, das durch verschiedene Anästhetika beeinflusst werden kann9. Messungen des optischen Lasers werden auch durch Umgebungslichtbedingungen, Hautpigmentierung beeinflusst und können durch überlagerndes Fell oder Haar blockiert werden7.
LDPI ist die am häufigsten verwendete Forschungstechnik zur Überwachung der Perfusionsrückgewinnung nach Ischämie, da sie nicht invasiv ist, keine Kontrastverabreichung erfordert und schnelle Scanzeiten hat, die die Datenerfassung bei mehreren Tieren ermöglichen. Dies macht es ideal zu bestimmen, ob Behandlungen auf therapeutische Arteriogenese oder Angiogenese sind wirksam in kleinen Tiermodellen. Die Durchblutungsrückgewinnung nach Hinterlimbischämie, gemessen mit LDPI, korreliert gut mit der Entwicklung der Kollateralarterie, wenn sie mit anderen Mitteln wie Microfil-Guss oder Mikro-CT10,11bewertet wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Beurteilung der Hinterbeinerperfusion mit LDPI zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>Schwarzes nicht reflektierendes Material</td><td></td><td></td><td>Stoffgeschäft, schwarzes Neopren, empfohlen von der Firma</td></tr><tr><td>F/Luftkanister</td><td>A.M. Bickford Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Homöotherme Decke mit starrer Metallsonde</td><td>Harvard-Gerät</td><td></td><td>Kommt auch mit flexibler Sonde, aber diese ist weniger haltbar</td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhesiegerät</td><td>Dräger</td><td></td><td>Mehrere Hersteller</td></tr><tr><td>Isofluran-Induktionskammer</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td>2-Liter-Kammer</td></tr><tr><td>Moorlaser-Doppler-Perfusions-Imager</td><td>Moor</td><td>Instruments MoorLDI2-IR</td><td>Imager mit höherer Auflösung (MoorLDI2-HIR)</td></tr><tr><td>Maus Anästhesie-Nasenkonus</td><td></td><td></td><td>Mehrere Hersteller</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sauerstofftank</td><td></td><td></td><td>Mehrere Hersteller</td></tr><tr><td>Surgilube</td><td>Mehrere Verteiler</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laser doppler perfusion imaging in der maus hindlimb

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Die Blutflussrückgewinnung ist eine kritische Ergebnismaßnahme nach experimenteller Hindlimb Ischämie oder Ischämie-Reperfusion. Laser Doppler Perfusionsbildgebung (LDPI) ist eine häufige, nichtinvasive, wiederholbare Methode zur Beurteilung der Blutflussrückgewinnung. Die Technik berechnet den gesamten Blutfluss im entnommenen Gewebe aus der Doppler-Frequenzverschiebung, die verursacht wird, wenn ein Laser auf bewegte rote Blutkörperchen trifft. Die Messungen werden in beliebigen Perfusionseinheiten ausgedrückt, so dass die kontralateralen nicht eingegriffenen am Bein in der Regel zur Kontrolle von Messungen verwendet werden. Die Messtiefe liegt im Bereich von 0,3-1 mm; für Hinterlimbischämie bedeutet dies, dass die dermale Perfusion bewertet wird. Die Dermale Perfusion ist von mehreren Faktoren abhängig – vor allem von der Hauttemperatur und dem Anästhetikum, die sorgfältig kontrolliert werden müssen, um zu zuverlässigen Messwerten zu führen. Darüber hinaus kann die Haar- und Hautpigmentierung die Fähigkeit des Lasers verändern, die Dermis entweder zu erreichen oder zu durchdringen. Dieser Artikel zeigt die Technik von LDPI im Maus-Hinterglied.

Erfolgreiche LDPI sollte zu konsistenten Wiederholungsmessungen führen, wobei nicht mehr als 100-150 Perfusionseinheiten variation (entsprechend etwa 10% der üblichen mittleren Perfusion für das Maus-Fußpad) zwischen den drei Scans(Abbildung 2) auftreten. Wie in Abbildung 2dargestellt, helfen Wiederholungsscans festzustellen, dass die Maus angemessen ausgeglichen wurde, so dass das ischämische/kontrollische Verhältnis den zugrunde liegenden Blutfluss am besten w...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Technik und die notwendigen Kontrollen für die Laser Doppler-Perfusionsbildgebung demonstriert, um den Blutfluss im Maushinterglied zu messen.

Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

Hautgeschwüre mit unzureichender Wundheilung sind eine der Hauptursachen für Amputationbeifall bei menschlichen Patienten. Eine adäquate Wundheilung erfordert ein höheres Maß an arterieller Profusion, die erforderlich sind, um intakte Haut zu erhalten, die bei Patienten mit peripheren arteriellen Erkrankungen beeinträchtigt wird. Mehrere andere rheumatologische Erkrankungen und Diabetes können auch zu einer gestörten und unzureichenden Mikrozirkulation der Haut führen, um Wunden zu heilen.Viele Diabetiker haben eine begleite periphere arterielle Erkrankung, wodurch sie einem besonders hohen Risiko für eine Amputation ausgesetzt sind. Laser Doppler Perfusionsbildgebung oder LDPI wird in klinischen Situationen verwendet, um die Mikrozirkulation der Haut sowie in Forschungssituationen zu bewerten, um den Blutfluss und die Blutflussrückgewinnung nach experimenteller Hindlimb Ischämie, Ischämie-Reperfusion und mikrochirurgischen Klappen zu bewerten. Das LDPI-System projiziert einen Low-Power-Laserstrahl, der von einem Scanspiegel abgelenkt wird, um sich über einen Bereich von Interesse zu bewegen.Dies unterscheidet sich von der Laser-Doppler-Flowmetrie, die eine Perfusionsmessung für den kleinen Gewebebereich in direktem Kontakt mit der Fließsonde ermöglicht. Wenn der Laserstrahl mit bewegtem Blut in der Mikrovaskulatur interagiert, durchläuft er eine Doppler-Frequenzverschiebung, die vom Scanner fotografiert und in beliebige Perfusionseinheiten umgewandelt wird. Da LDPI eine lichtbasierte Technik ist, ist sie in Bezug auf die Penetrationstiefe auf 0,3 bis 1 Millimeter begrenzt, was bedeutet, dass die dermale Perfusion zum größten Teil bewertet wird.Dermaler Fluss kann durch die Hauttemperatur und das sympathische Nervensystem verändert werden, die durch verschiedene Anästhetika beeinflusst werden können. Messungen des optischen Lasers werden auch durch Umgebungslichtverhältnisse, Hautpigmentierung beeinflusst und können durch überlagerndes Fell oder Haare blockiert werden. LDPI ist die am häufigsten verwendete Forschungstechnik zur Überwachung der Profusionserholung nach Ischämie, da es nicht-invasiv ist, keine Kontrastverabreichung erfordert und schnelle Scanzeiten hat, die die Datenerfassung bei mehreren Tieren ermöglichen.Dies macht es ideal zu bestimmen, ob Behandlungen auf therapeutische Arteriogenese oder Angiogenese sind wirksam in kleinen Tiermodellen. Die Durchblutungsrückgewinnung nach Hinter-Limb-Ischämie, gemessen von LDPI, korreliert gut mit der Entwicklung der Kollateralarterie, wenn sie mit anderen Mitteln wie Mikrofill-Guss oder Mikro-CT bewertet wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Beurteilung der Hinterbeinerperfusion mit LDPI zu demonstrieren. Passen Sie die Scannerhöhe so an, dass der Abstand zum Scan-Motiv etwa 30 Zentimeter beträgt.Schalten Sie den Imager ein und starten Sie die zugehörige Software. Öffnen Sie das Messprogramm. Wenn die Software korrekt mit dem Scanner kommuniziert, wird die Infrarot-Laser-Warnung angezeigt.Passen Sie die Scannereinstellungen so an, dass sie für das Hintergrundmaterial und die Beleuchtungseinrichtung im Raum geeignet sind. Legen Sie den Hintergrundschwellenwert fest, indem Sie den Laserstrahl auf das schwarze Hintergrundmaterial zeigen und Auto BK Set drücken. Richten Sie die isoflurane Induktionskammer mit entsprechender Aufräumgasableitung ein.Das Platzieren der Induktionskammer auf einem Wärmepolster wird dazu beitragen, den Temperaturverlust der Maus während der Anästhesieinduktion zu verhindern. Schalten Sie die homeothermische Decke ein, die im Scanbereich unter einer nicht reflektierenden Oberfläche platziert wird. In diesem Fall ein schwarzer Neoprenstoff.Die homeothermische Decke soll eine Körpertemperatur von 37 Grad Celsius beibehalten. Positionieren Sie den Temperaturfühler und die Schmierstoffe so, dass sie einschubbereit sind. Legen Sie die Anästhesie-Gesichtsmaske und das Aufräumsystem ebenfalls in den Scanbereich.Anästhetisieren Sie die Maus mit einem Isofluran-Verdampfer. Die Sauerstoffrate wird auf einen Liter pro Minute Durchfluss eingestellt. Und das Isofluran wird für die Anästhesieinduktion auf 4% angepasst.Der Fluss wird in die Anästhesie-Induktionskammer eingeschaltet und die Atemfrequenz der Maus verlangsamt sich. Eine angemessene Anästhesie wird erreicht, wenn die Maus ihren Rechtenreflex verliert. Übertragen Sie die Maus auf eine Anästhesiemaske Nasenkegel mit angeschlossenem Abgasfänger und stellen Sie die Isoflurane auf 1,5%Dieser Anästhesiespiegel ist in der Regel ausreichend, um die Maus während des Scannens relativ still liegen zu halten, aber nicht beabsichtigt, chirurgische Niveaus der Anästhesie zu bieten.Die Tiefe der Anästhesie wird also nicht überprüft. Die Änderung des Isofluranspiegels führt zu Veränderungen der Herzfrequenz, der Atmung und dermalen Profusion. Daher sollte ein konsistenter Prozentsatz während jedes Zeitverlaufsversuchs und für alle Versuchspersonen verwendet werden.Alternative Anästhesie-Techniken, wie IP-Injektion von Ketamin Xylazin kann auch verwendet werden, aber die gleiche Anästhesie-Technik sollte während jeder Zeit-Kurs-Studie verwendet werden, da verschiedene Anästhetika dermalprofusion unterschiedlich beeinflussen. Wenn der zu scannende Planbereich mit Pelz bedeckt ist, verwenden Sie einen kleinen elektrischen Trimmer und/oder eine Enthaarungscreme, um das Haar aus dem Interessenbereich zu entfernen. Die Enthaarungscremes sollten vollständig entfernt und die Maushaut vor dem Scannen als nasse Haut getrocknet werden können Reflexionen vom Laser Führen Sie die geschmierte rektale Temperatursonde, die mit der homeothermischen Decke verbunden ist, in das Mausrektum ein.Equilibrate die Maustemperatur, um Scan-Temperatur zu wünschen, 37 Grad Celsius. Dies kann bis zu fünf bis zehn Minuten dauern. Wählen Sie Scanner-Setup aus, auf das über das obere Menü oder über das Scanner-Setup-Symbol zugegriffen werden kann.Der Scanbereich sollte durch Ändern der X-, Y-Koordinaten angepasst werden, um dem Interessenbereich gerecht zu werden. Die Scangeschwindigkeit hängt von der Scanauflösung ab. Eine höhere Auflösung führt zu längeren Scanzeiten.Für wiederholtes Scannen, das sich auf die globale Überfluss konzentriert, im Gegensatz zu einer höheren Auflösung, die sich auf die anatomische Perfusion konzentriert, ist die höchste Scangeschwindigkeit von vier Millisekunden pro Pixel ausreichend. Wenn Sie Wiederholungsscans durchführen, wählen Sie die Registerkarte Wiederholen und Zeilenscannen aus. Die Anzahl der Scans kann geändert werden.In diesem Fall drei Scans sowie das Wiederholungsintervall. Die Mindestzeit für das Wiederholungsintervall sind die geschätzten Scanzeiten, die im abgeblendeten Bereich auf der rechten Seite des Feldes angezeigt werden, der durch Scanbereich und Scanauflösung bestimmt wird. Wenn Sie einige Sekunden hinzufügen, kann der Benutzer die Maus zwischen den Scans anhalten und ggf. neu positionieren.Die Gesamtscanzeit beträgt in diesem Fall drei Minuten und 21 Sekunden. Wählen Sie die Registerkarte Bildscan und die Schaltfläche Markieren aus. Dadurch wird der Scanbereich vom Laser umrissen.Passen Sie die Mausposition so an, dass sich das zu scannende Ziel innerhalb des markierten Bereichs befindet. Starten Sie die wiederholte Messung, indem Sie das Symbol Scannen wiederholen auswählen und die Play-Taste drücken, um den Scan zu starten. Es wird ein Popupfenster angezeigt, das den Scanabstand bestätigt.Klicken Sie auf OK, um mit dem Scannen zu beginnen. Der erste Scan einer Maus vor der Induktion der Hinterbleibsischämie wird in Echtzeit gezeigt. Der zweite und dritte Wiederholungs-Scan werden auf 16-fache Geschwindigkeit beschleunigt.Das Hauptfenster zeigt die Ergebnisse des Scans, wie er von der Software generiert wird. Der Einset bereichrechts zeigt den Laser, der die Mausfußpads scannt. Für Fußpolster oder Fußpolster und dorsale Skalenscanning, anfällige Positionierung mit den Hinterbleibs zum Schwanz verlängert bietet eine konsistentere Bereich des Interesses an Supine Positionierung.Die Oberschenkelarterie, die halsbrecherische Arterie und die Kollateralen liegen sehr nahe an der ventralen Oberfläche von Oberschenkel und Kalb. Daher wird die Supine-Positionierung bevorzugt, wenn sie diese Interessensgebiete verwendet. Überwachen Sie die Maus beim Scannen auf Mausbewegung.Wenn sich die Maus so weit bewegt, dass sich die Fußpolster nicht mehr im Scanbereich in der Mitte eines Scans befinden, starten Sie den Scan neu. Kleine Variationen in der Position des Maus-Footpad können in der Analysesoftware untergebracht werden. Überwachen Sie auch die Maustemperatur während des Scanvorgangs, da sie auch bei Verwendung der homeothermischen Decke schwanken kann.Wenn die Maustemperatur zu stark variieren, kann dies zu erheblichen Abweichungen zwischen den Scans führen. Im Allgemeinen führt ein Temperaturbereich von 36,8 bis 37,2 zu akzeptablen Daten. Speichern Sie den erfassten Scan im Fenster Speichern unter mit einem Dateinamen, der Mausbezeichner und Zeitpunkt für eine einfachere Datenanalyse enthält.Geben Sie maus- und Zeitpunktdetails ein, falls gewünscht, im Fenster Betreffdetails. Das Ventrale Hintergliedscannen mit der Maus in der Supine-Position wird hier nach dem Anpassen des Scanbereichs angezeigt. Beachten Sie, dass der Satz mit der Maus-Supine dazu führt, dass ein variabler Teil der Seite des Fußes gescannt wird.Entfernen Sie den rektalen Temperaturfühler und desinfizieren Sie ihn mit 70% Ethanol, damit er für die nächste Maus bereit ist. Verringern Isofluran e.V. 0%Die Maus erholt sich schneller, wenn sie weiterhin Sauerstoff erhält, aber sie kann auch ohne zusätzlichen Sauerstoff zurückgewonnen werden. Lassen Sie die Maus von der Anästhesie bis zu dem Punkt erholen, an dem sie einen Rechtenreflex anzeigt, indem Sie von der Supine-Position in die anfällige Position kippen, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen.Die Erholung kann entweder auf einer wärmenden Decke für Isofluran durchgeführt werden, da die Erholung sehr schnell ist oder in einem warmen Rückgewinnungskäfig für Ketaminxylazin. Öffnen Sie das Imaging Review-Softwareprogramm. Ein neues Fenster zum Überprüfen von Scans wird geöffnet.Gehen Sie zum Menü Datei, öffnen und suchen Sie die gespeicherte Datei. Wählen Sie das ROI-Symbol in der Symbolleiste aus. Wählen Sie das Symbol Polygon hinzufügen aus.Verfolgen Sie einen Bereich um den Interessenbereich mit der Maus. Wenn Sie fertig sind, kehren Sie zur Symbolleiste zurück, und wählen Sie das Symbol Statistik aus. Dadurch wird ein Fenster mit Statistiken aus der Region von Interesse angezeigt.Bei der Datenüberprüfung, der mittleren Profusionseinheit oder PU, variieren die Werte nicht mehr als 100 bis 150 PUs über die wiederholten Scans für jedes Fußpad. Dies ist ein akzeptabler Scan und zeigt an, dass die Maus während des Scans gut ausgeglichen wurde. Mittlere PU-Werte mit einer Streuung von mehr als 100 bis 150 PUs, was mehr als 10 % der mittleren Perfusion für ein nicht betriebenes Mausfußpad über die wiederholten Scans entspricht, würden darauf hindeuten, dass die Maus nicht gut ausdemaiert war und ein Wiederholungscan stark empfohlen wird.Wenn Sie unmittelbar nach Abschluss des Scans eine schnelle Analyse durchführen, kann ein Wiederholungsscan durchgeführt werden, während die Maus noch beästhetisiert ist, und vermeiden Sie den Verlust eines Datenpunkts, der auftreten könnte, wenn die Scans zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden und ein Scan aufgrund erheblicher Abweichungen zwischen den wiederholten Scans als inakzeptabel angesehen wird. Die Ergebnisse werden als ein Verhältnis von chirurgischer Hinterkieferprofusion über Kontrolle Hinterkieferperfusion ausgedrückt, wie Mäuse zunächst Vasodilat und dann entwickeln ihre intrinsischen Kollateralen, Blutfluss-Recovery durch LDPI sollte über einen postoperativen Zeitverlauf gesehen werden. Der Grad der Erholung hängt von der Mausdehnung und der Schwere des Hinterbleibs Ischämie-Modells ab.Diese Abbildung zeigt ein abgeschlossenes Zeitkursexperiment über 28 Tage, bei dem LDPI verwendet wurde, um die Rückgewinnung des Fußpolsters im Laufe der Zeit nach der Femoralarterienligation und P27 Knockout und wilden Typ C57Bl/6 Mäusen zu messen. Beide P27 Knockout bei Wildtyp-Mäuse hatten eine gestörte Blutfluss-Erholung, wenn mit oralem Doxycyclin behandelt, eine generalisierte Matrix-Metalloproteinasen-Hemmer, was darauf hindeutet, dass MMP-Aktivität arteriogenese erleichtert. Die Verstärkungseinstellung und der Hintergrundschwellenwert sollten während des gesamten Zeitverlaufsexperiments konstant gehalten werden.Wenn der Hintergrundschwellenwert zu niedrig eingestellt ist, führt das Scannen des Hintergrundmaterials zu niedrigen Überflusswerten. Dies führt dazu, dass die Hintergrund-Überflusswerte während der Polygonauswahl in den Interessenbereich gemittelt werden. Um dieses Problem zu beheben, kann der Hintergrundschwellenwert im Fenster Scanner-Setup unter der Registerkarte Allgemein angepasst werden.In diesem Fall führt die Erhöhung des Hintergrundschwellenwerts auf 118 Profusionseinheiten zu dem grauen Hintergrund, der in keiner Analyse enthalten ist. Die Palette oder Farbskala für das Flussbild kann sowohl in der Messsoftware als auch in der Bildüberprüfungssoftware angepasst werden. Alle Überflusswerte, die größer als der Maximalwert auf der Skala sind, werden als höchste Überflussfarbe angezeigt.In diesem Fall rot. Wenn Sie beispielsweise den Dynamikbereich erhöhen und die Skala auf einen Bereich von Null bis 1500 ändern, wird die Wiederholungsscanvariation für das Auge deutlicher, da Bereiche mit einer Größe zwischen 1000 und 1500 Profusionseinheiten nun mit dem Farbverlauf angezeigt werden, anstatt alle als rot angezeigt zu werden. Der hier gezeigte Scan wurde in einer Maus durchgeführt, deren Körperkerntemperatur zu Beginn des wiederholten Scans zunächst unter 36,8 lag und dann im Laufe der wiederholten Scans zunahm.Beachten Sie, dass die durchschnittliche Fülle des Steuerfußpads stärker von der kälteren Körperkörpertemperatur als vom ischämischen Fußpolster beeinzicht war. Ein einziger Scan der kühleren Körpertemperatur hätte dazu geführt, dass für diesen Datenpunkt ein höheres Überflussverhältnis aufgezeichnet worden wäre. Variationen in der Pigmentierung der Maushaut, wie sie bei C57Bl/6-Mäusen zu beobachten sind, können dazu führen, dass der Scanbereich unter dem Hintergrundschwellenwert liegt, was die Analyse von Interessengebieten mit pigmentierten Bereichen erschwert.Die Maus-Fußpads im Allgemeinen haben keine Hyperpigmentierung, so dass dies der bequemste Bereich für diese Maus Dehnung zu scannen. Wenn der Forscher das ventrale Hinterglied untersuchen möchte, sollte eine weiße Mausdehnung ausgewählt werden. LDPI ist eine effektive, leicht durchzuführende und wiederholbare Methode zur Messung der hinteren dermalen Profusion als Reflektion der gesamten arteriellen Perfusion.Konsistente Technik ist erforderlich, wenn LDPI verwendet wird, um zuverlässige Daten zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.

Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie

Wir beschreiben die Methode der Programmierung Stammzellen zu therapeutischen Angiogenese-Faktoren für Überexpression mit biologisch abbaubaren polymeren Nanopartikel. Beschriebenen Verfahren umfassen die Polymersynthese, die Transfektion von Fettgewebe abgeleitete Stammzellen in vitro, und die Validierung der Wirksamkeit der programmierten Stammzellen Angiogenese in einem Maushinterlauf-Ischämie-Modell zu fördern.

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Die chirurgische Induktion der Ischämie der Hintergliedmaßen bei der Maus ist nützlich, um die Angiogenese zu untersuchen, jedoch ist dies bei bestimmten Inzucht-Mausstämmen, die eine ausgeprägte Ischämie-induzierte Gewebenekrose aufweisen, beeinträchtigt. Es werden Methoden zur Induktion einer subakuten Ischämie der Gliedmaßen unter Verwendung von Ameroid-Konstriktoren beschrieben, um dieses Problem durch die Induktion eines allmählichen arteriellen Verschlusses zu umgehen.

Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Insulin-induzierte Vasodilatation regelt die Durchblutung der Muskeln und erhöht die mikrovaskuläre Fläche (mikrovaskuläre Rekrutierung) verfügbar für gelöste Austausch zwischen Blut und Gewebe Interstitium. Kombinierte intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie wird präsentiert, um gleichzeitig Insulinwirkung auf größere Schiffe und die Mikrozirkulation bewerten in-vivo.

Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen

Pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion regelt Inselchen Blut Verteilung und behält die physiologische Funktion der Inselzellen β. Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung eines Laser-Doppler-Monitors, funktionalen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo zu bestimmen und zu beurteilen, die Beiträge der pankreatischen Inselchen Mikrozirkulation, Bauchspeicheldrüsen-Erkrankungen.

Laser-Doppler: Ein Instrument zur Messung der Pankreas Islet mikrovaskuläre Vasomotion In Vivo

Hier präsentieren wir Ihnen eine Kombination aus Laser-Doppler-Perfusion imaging (LDPI) und Laser Doppler Perfusion Überwachung (LDPM) Wirbelsäule Messen lokale Blut fließt und der Sauerstoffsättigung (SO2), sowie ein standardisiertes Verfahren für die Einführung von Rückenmark Schnur Trauma auf Ratte.

Mittels Laser-Doppler Imaging und Überwachung, Rückenmark Mikrozirkulation in der Ratte zu analysieren

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Der ultraschnelle Dopplerultraschall (UFUS) mit hoher räumlicher Auflösung (100 μm) und Sensitivität stellt eine geeignete nichtinvasive Bildgebungsmodalität dar, um einen umfassenden qualitativen Überblick über das Lebergefäßsystem zu erhalten. UFUS erleichtert auch quantitative Messungen des Mikrovaskulatursystems und zielt darauf ab, unser Verständnis der Mechanismen von Gefäßerkrankungen zu verbessern.

Bildgebung und Quantifizierung des hepatischen Gefäßsystems von Mäusen mittels ultraschnellem Doppler-Ultraschall

Hier wird ein minimal-invasives chirurgisches Verfahren gezeigt, bei dem die Laser-Doppler-Sonde über der distalen Region der mittleren Hirnarterie (MCA), einer für Ratten und Mäuse geeigneten periorbitalen Stelle, auf den Schädel aufgesetzt wird, um den Blutfluss während eines vorübergehenden MCA-Verschlusses zu beurteilen.

Periorbitale Platzierung einer Laser-Doppler-Sonde zur Überwachung des zerebralen Blutflusses vor einem Verschluss der mittleren Hirnarterie in Nagetiermodellen

Ein Laser-Speckle-Kontrastbildgebungssystem wurde verwendet, um die Veränderungen im renalen mikrovaskulären Blutfluss während einer einseitigen Nierischämie-Reperfusion nach der Resektion der rechten Niere bei Mäusen zu überwachen.

Mikrovaskuläre Perfusion überwacht durch Laser-Speckle-Kontrastbildgebung während der Nierenischämie-Reperfusionsverletzung bei Mäusen

Lernen Sie die Laser-Doppler-Perfusion-Imaging-Technik zur Messung der Blutflusswiederherstellung in der Mäusehinterpfote. Diese nicht-invasive Methode unterstützt Forscher bei der Untersuchung von Mikrozirkulation und Wundheilung.

Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

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