Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

Hautgeschwüre mit unzureichender Wundheilung sind eine der Hauptursachen für Amputationbeifall bei menschlichen Patienten. Eine adäquate Wundheilung erfordert ein höheres Maß an arterieller Profusion, die erforderlich sind, um intakte Haut zu erhalten, die bei Patienten mit peripheren arteriellen Erkrankungen beeinträchtigt wird. Mehrere andere rheumatologische Erkrankungen und Diabetes können auch zu einer gestörten und unzureichenden Mikrozirkulation der Haut führen, um Wunden zu heilen.

Viele Diabetiker haben eine begleite periphere arterielle Erkrankung, wodurch sie einem besonders hohen Risiko für eine Amputation ausgesetzt sind. Laser Doppler Perfusionsbildgebung oder LDPI wird in klinischen Situationen verwendet, um die Mikrozirkulation der Haut sowie in Forschungssituationen zu bewerten, um den Blutfluss und die Blutflussrückgewinnung nach experimenteller Hindlimb Ischämie, Ischämie-Reperfusion und mikrochirurgischen Klappen zu bewerten. Das LDPI-System projiziert einen Low-Power-Laserstrahl, der von einem Scanspiegel abgelenkt wird, um sich über einen Bereich von Interesse zu bewegen.

Dies unterscheidet sich von der Laser-Doppler-Flowmetrie, die eine Perfusionsmessung für den kleinen Gewebebereich in direktem Kontakt mit der Fließsonde ermöglicht. Wenn der Laserstrahl mit bewegtem Blut in der Mikrovaskulatur interagiert, durchläuft er eine Doppler-Frequenzverschiebung, die vom Scanner fotografiert und in beliebige Perfusionseinheiten umgewandelt wird. Da LDPI eine lichtbasierte Technik ist, ist sie in Bezug auf die Penetrationstiefe auf 0,3 bis 1 Millimeter begrenzt, was bedeutet, dass die dermale Perfusion zum größten Teil bewertet wird.

Dermaler Fluss kann durch die Hauttemperatur und das sympathische Nervensystem verändert werden, die durch verschiedene Anästhetika beeinflusst werden können. Messungen des optischen Lasers werden auch durch Umgebungslichtverhältnisse, Hautpigmentierung beeinflusst und können durch überlagerndes Fell oder Haare blockiert werden. LDPI ist die am häufigsten verwendete Forschungstechnik zur Überwachung der Profusionserholung nach Ischämie, da es nicht-invasiv ist, keine Kontrastverabreichung erfordert und schnelle Scanzeiten hat, die die Datenerfassung bei mehreren Tieren ermöglichen.

Dies macht es ideal zu bestimmen, ob Behandlungen auf therapeutische Arteriogenese oder Angiogenese sind wirksam in kleinen Tiermodellen. Die Durchblutungsrückgewinnung nach Hinter-Limb-Ischämie, gemessen von LDPI, korreliert gut mit der Entwicklung der Kollateralarterie, wenn sie mit anderen Mitteln wie Mikrofill-Guss oder Mikro-CT bewertet wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Beurteilung der Hinterbeinerperfusion mit LDPI zu demonstrieren. Passen Sie die Scannerhöhe so an, dass der Abstand zum Scan-Motiv etwa 30 Zentimeter beträgt.

Schalten Sie den Imager ein und starten Sie die zugehörige Software. Öffnen Sie das Messprogramm. Wenn die Software korrekt mit dem Scanner kommuniziert, wird die Infrarot-Laser-Warnung angezeigt.

Passen Sie die Scannereinstellungen so an, dass sie für das Hintergrundmaterial und die Beleuchtungseinrichtung im Raum geeignet sind. Legen Sie den Hintergrundschwellenwert fest, indem Sie den Laserstrahl auf das schwarze Hintergrundmaterial zeigen und Auto BK Set drücken. Richten Sie die isoflurane Induktionskammer mit entsprechender Aufräumgasableitung ein.

Das Platzieren der Induktionskammer auf einem Wärmepolster wird dazu beitragen, den Temperaturverlust der Maus während der Anästhesieinduktion zu verhindern. Schalten Sie die homeothermische Decke ein, die im Scanbereich unter einer nicht reflektierenden Oberfläche platziert wird. In diesem Fall ein schwarzer Neoprenstoff.

Die homeothermische Decke soll eine Körpertemperatur von 37 Grad Celsius beibehalten. Positionieren Sie den Temperaturfühler und die Schmierstoffe so, dass sie einschubbereit sind. Legen Sie die Anästhesie-Gesichtsmaske und das Aufräumsystem ebenfalls in den Scanbereich.

Anästhetisieren Sie die Maus mit einem Isofluran-Verdampfer. Die Sauerstoffrate wird auf einen Liter pro Minute Durchfluss eingestellt. Und das Isofluran wird für die Anästhesieinduktion auf 4% angepasst.

Der Fluss wird in die Anästhesie-Induktionskammer eingeschaltet und die Atemfrequenz der Maus verlangsamt sich. Eine angemessene Anästhesie wird erreicht, wenn die Maus ihren Rechtenreflex verliert. Übertragen Sie die Maus auf eine Anästhesiemaske Nasenkegel mit angeschlossenem Abgasfänger und stellen Sie die Isoflurane auf 1,5%Dieser Anästhesiespiegel ist in der Regel ausreichend, um die Maus während des Scannens relativ still liegen zu halten, aber nicht beabsichtigt, chirurgische Niveaus der Anästhesie zu bieten.

Die Tiefe der Anästhesie wird also nicht überprüft. Die Änderung des Isofluranspiegels führt zu Veränderungen der Herzfrequenz, der Atmung und dermalen Profusion. Daher sollte ein konsistenter Prozentsatz während jedes Zeitverlaufsversuchs und für alle Versuchspersonen verwendet werden.

Alternative Anästhesie-Techniken, wie IP-Injektion von Ketamin Xylazin kann auch verwendet werden, aber die gleiche Anästhesie-Technik sollte während jeder Zeit-Kurs-Studie verwendet werden, da verschiedene Anästhetika dermalprofusion unterschiedlich beeinflussen. Wenn der zu scannende Planbereich mit Pelz bedeckt ist, verwenden Sie einen kleinen elektrischen Trimmer und/oder eine Enthaarungscreme, um das Haar aus dem Interessenbereich zu entfernen. Die Enthaarungscremes sollten vollständig entfernt und die Maushaut vor dem Scannen als nasse Haut getrocknet werden können Reflexionen vom Laser Führen Sie die geschmierte rektale Temperatursonde, die mit der homeothermischen Decke verbunden ist, in das Mausrektum ein.

Equilibrate die Maustemperatur, um Scan-Temperatur zu wünschen, 37 Grad Celsius. Dies kann bis zu fünf bis zehn Minuten dauern. Wählen Sie Scanner-Setup aus, auf das über das obere Menü oder über das Scanner-Setup-Symbol zugegriffen werden kann.

Der Scanbereich sollte durch Ändern der X-, Y-Koordinaten angepasst werden, um dem Interessenbereich gerecht zu werden. Die Scangeschwindigkeit hängt von der Scanauflösung ab. Eine höhere Auflösung führt zu längeren Scanzeiten.

Für wiederholtes Scannen, das sich auf die globale Überfluss konzentriert, im Gegensatz zu einer höheren Auflösung, die sich auf die anatomische Perfusion konzentriert, ist die höchste Scangeschwindigkeit von vier Millisekunden pro Pixel ausreichend. Wenn Sie Wiederholungsscans durchführen, wählen Sie die Registerkarte Wiederholen und Zeilenscannen aus. Die Anzahl der Scans kann geändert werden.

In diesem Fall drei Scans sowie das Wiederholungsintervall. Die Mindestzeit für das Wiederholungsintervall sind die geschätzten Scanzeiten, die im abgeblendeten Bereich auf der rechten Seite des Feldes angezeigt werden, der durch Scanbereich und Scanauflösung bestimmt wird. Wenn Sie einige Sekunden hinzufügen, kann der Benutzer die Maus zwischen den Scans anhalten und ggf. neu positionieren.

Die Gesamtscanzeit beträgt in diesem Fall drei Minuten und 21 Sekunden. Wählen Sie die Registerkarte Bildscan und die Schaltfläche Markieren aus. Dadurch wird der Scanbereich vom Laser umrissen.

Passen Sie die Mausposition so an, dass sich das zu scannende Ziel innerhalb des markierten Bereichs befindet. Starten Sie die wiederholte Messung, indem Sie das Symbol Scannen wiederholen auswählen und die Play-Taste drücken, um den Scan zu starten. Es wird ein Popupfenster angezeigt, das den Scanabstand bestätigt.

Klicken Sie auf OK, um mit dem Scannen zu beginnen. Der erste Scan einer Maus vor der Induktion der Hinterbleibsischämie wird in Echtzeit gezeigt. Der zweite und dritte Wiederholungs-Scan werden auf 16-fache Geschwindigkeit beschleunigt.

Das Hauptfenster zeigt die Ergebnisse des Scans, wie er von der Software generiert wird. Der Einset bereichrechts zeigt den Laser, der die Mausfußpads scannt. Für Fußpolster oder Fußpolster und dorsale Skalenscanning, anfällige Positionierung mit den Hinterbleibs zum Schwanz verlängert bietet eine konsistentere Bereich des Interesses an Supine Positionierung.

Die Oberschenkelarterie, die halsbrecherische Arterie und die Kollateralen liegen sehr nahe an der ventralen Oberfläche von Oberschenkel und Kalb. Daher wird die Supine-Positionierung bevorzugt, wenn sie diese Interessensgebiete verwendet. Überwachen Sie die Maus beim Scannen auf Mausbewegung.

Wenn sich die Maus so weit bewegt, dass sich die Fußpolster nicht mehr im Scanbereich in der Mitte eines Scans befinden, starten Sie den Scan neu. Kleine Variationen in der Position des Maus-Footpad können in der Analysesoftware untergebracht werden. Überwachen Sie auch die Maustemperatur während des Scanvorgangs, da sie auch bei Verwendung der homeothermischen Decke schwanken kann.

Wenn die Maustemperatur zu stark variieren, kann dies zu erheblichen Abweichungen zwischen den Scans führen. Im Allgemeinen führt ein Temperaturbereich von 36,8 bis 37,2 zu akzeptablen Daten. Speichern Sie den erfassten Scan im Fenster Speichern unter mit einem Dateinamen, der Mausbezeichner und Zeitpunkt für eine einfachere Datenanalyse enthält.

Geben Sie maus- und Zeitpunktdetails ein, falls gewünscht, im Fenster Betreffdetails. Das Ventrale Hintergliedscannen mit der Maus in der Supine-Position wird hier nach dem Anpassen des Scanbereichs angezeigt. Beachten Sie, dass der Satz mit der Maus-Supine dazu führt, dass ein variabler Teil der Seite des Fußes gescannt wird.

Entfernen Sie den rektalen Temperaturfühler und desinfizieren Sie ihn mit 70% Ethanol, damit er für die nächste Maus bereit ist. Verringern Isofluran e.V. 0%Die Maus erholt sich schneller, wenn sie weiterhin Sauerstoff erhält, aber sie kann auch ohne zusätzlichen Sauerstoff zurückgewonnen werden. Lassen Sie die Maus von der Anästhesie bis zu dem Punkt erholen, an dem sie einen Rechtenreflex anzeigt, indem Sie von der Supine-Position in die anfällige Position kippen, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen.

Die Erholung kann entweder auf einer wärmenden Decke für Isofluran durchgeführt werden, da die Erholung sehr schnell ist oder in einem warmen Rückgewinnungskäfig für Ketaminxylazin. Öffnen Sie das Imaging Review-Softwareprogramm. Ein neues Fenster zum Überprüfen von Scans wird geöffnet.

Gehen Sie zum Menü Datei, öffnen und suchen Sie die gespeicherte Datei. Wählen Sie das ROI-Symbol in der Symbolleiste aus. Wählen Sie das Symbol Polygon hinzufügen aus.

Verfolgen Sie einen Bereich um den Interessenbereich mit der Maus. Wenn Sie fertig sind, kehren Sie zur Symbolleiste zurück, und wählen Sie das Symbol Statistik aus. Dadurch wird ein Fenster mit Statistiken aus der Region von Interesse angezeigt.

Bei der Datenüberprüfung, der mittleren Profusionseinheit oder PU, variieren die Werte nicht mehr als 100 bis 150 PUs über die wiederholten Scans für jedes Fußpad. Dies ist ein akzeptabler Scan und zeigt an, dass die Maus während des Scans gut ausgeglichen wurde. Mittlere PU-Werte mit einer Streuung von mehr als 100 bis 150 PUs, was mehr als 10 % der mittleren Perfusion für ein nicht betriebenes Mausfußpad über die wiederholten Scans entspricht, würden darauf hindeuten, dass die Maus nicht gut ausdemaiert war und ein Wiederholungscan stark empfohlen wird.

Wenn Sie unmittelbar nach Abschluss des Scans eine schnelle Analyse durchführen, kann ein Wiederholungsscan durchgeführt werden, während die Maus noch beästhetisiert ist, und vermeiden Sie den Verlust eines Datenpunkts, der auftreten könnte, wenn die Scans zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden und ein Scan aufgrund erheblicher Abweichungen zwischen den wiederholten Scans als inakzeptabel angesehen wird. Die Ergebnisse werden als ein Verhältnis von chirurgischer Hinterkieferprofusion über Kontrolle Hinterkieferperfusion ausgedrückt, wie Mäuse zunächst Vasodilat und dann entwickeln ihre intrinsischen Kollateralen, Blutfluss-Recovery durch LDPI sollte über einen postoperativen Zeitverlauf gesehen werden. Der Grad der Erholung hängt von der Mausdehnung und der Schwere des Hinterbleibs Ischämie-Modells ab.

Diese Abbildung zeigt ein abgeschlossenes Zeitkursexperiment über 28 Tage, bei dem LDPI verwendet wurde, um die Rückgewinnung des Fußpolsters im Laufe der Zeit nach der Femoralarterienligation und P27 Knockout und wilden Typ C57Bl/6 Mäusen zu messen. Beide P27 Knockout bei Wildtyp-Mäuse hatten eine gestörte Blutfluss-Erholung, wenn mit oralem Doxycyclin behandelt, eine generalisierte Matrix-Metalloproteinasen-Hemmer, was darauf hindeutet, dass MMP-Aktivität arteriogenese erleichtert. Die Verstärkungseinstellung und der Hintergrundschwellenwert sollten während des gesamten Zeitverlaufsexperiments konstant gehalten werden.

Wenn der Hintergrundschwellenwert zu niedrig eingestellt ist, führt das Scannen des Hintergrundmaterials zu niedrigen Überflusswerten. Dies führt dazu, dass die Hintergrund-Überflusswerte während der Polygonauswahl in den Interessenbereich gemittelt werden. Um dieses Problem zu beheben, kann der Hintergrundschwellenwert im Fenster Scanner-Setup unter der Registerkarte Allgemein angepasst werden.

In diesem Fall führt die Erhöhung des Hintergrundschwellenwerts auf 118 Profusionseinheiten zu dem grauen Hintergrund, der in keiner Analyse enthalten ist. Die Palette oder Farbskala für das Flussbild kann sowohl in der Messsoftware als auch in der Bildüberprüfungssoftware angepasst werden. Alle Überflusswerte, die größer als der Maximalwert auf der Skala sind, werden als höchste Überflussfarbe angezeigt.

In diesem Fall rot. Wenn Sie beispielsweise den Dynamikbereich erhöhen und die Skala auf einen Bereich von Null bis 1500 ändern, wird die Wiederholungsscanvariation für das Auge deutlicher, da Bereiche mit einer Größe zwischen 1000 und 1500 Profusionseinheiten nun mit dem Farbverlauf angezeigt werden, anstatt alle als rot angezeigt zu werden. Der hier gezeigte Scan wurde in einer Maus durchgeführt, deren Körperkerntemperatur zu Beginn des wiederholten Scans zunächst unter 36,8 lag und dann im Laufe der wiederholten Scans zunahm.

Beachten Sie, dass die durchschnittliche Fülle des Steuerfußpads stärker von der kälteren Körperkörpertemperatur als vom ischämischen Fußpolster beeinzicht war. Ein einziger Scan der kühleren Körpertemperatur hätte dazu geführt, dass für diesen Datenpunkt ein höheres Überflussverhältnis aufgezeichnet worden wäre. Variationen in der Pigmentierung der Maushaut, wie sie bei C57Bl/6-Mäusen zu beobachten sind, können dazu führen, dass der Scanbereich unter dem Hintergrundschwellenwert liegt, was die Analyse von Interessengebieten mit pigmentierten Bereichen erschwert.

Die Maus-Fußpads im Allgemeinen haben keine Hyperpigmentierung, so dass dies der bequemste Bereich für diese Maus Dehnung zu scannen. Wenn der Forscher das ventrale Hinterglied untersuchen möchte, sollte eine weiße Mausdehnung ausgewählt werden. LDPI ist eine effektive, leicht durchzuführende und wiederholbare Methode zur Messung der hinteren dermalen Profusion als Reflektion der gesamten arteriellen Perfusion.

Konsistente Technik ist erforderlich, wenn LDPI verwendet wird, um zuverlässige Daten zu erhalten.