Name: Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Lernen Sie die radioaktive Markierung und Visualisierung mitochondrialer Proteine in Saccharomyces cerevisiae durch Gelelektrophorese. Diese Methode ermöglicht die Analyse der mitochondrialen Proteinbiosynthese.

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Diese Forschung wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung, Stipendium Nummer 18-29-07002, finanziert. P.K. wurde durch die staatliche Zuweisung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Fördernummer AAAA-A16-116021660073-5 unterstützt. M.V.P. wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Fördernummer 075-15-2019-1659 (Programm des Kurchatov Center of Genome Research) unterstützt. Die Arbeit wurde teilweise an der Ausrüstung im Rahmen des Moskauer Staatlichen Universitätsprogramms für Entwicklung gekauft getan. I.C., S.L. und M.V.B. wurden zusätzlich vom Stipendium der Staatlichen Universität Moskau "Leading Scientific School Noah es Ark" unterstützt.

1. HefekulturVorbereitung
<ol><li>Streifen Hefe aus den gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit dem entsprechenden Medium. Legen Sie die Platten in einen Kultur-Inkubator bei 30 °C für 24-48 h. HINWEIS: Lassen Sie die temperaturempfindlichen Mutanten bei der freizügigen Temperatur wachsen.</li>
	<li>Hefekulturen in 2 ml YPGal-Medium (2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Galaktose) aus dem frischen Streifen in 15 ml-Röhrchen impfen und über Nacht bei 200 U/min bei 30 °C aufregen.</li>
	<li>Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600).</li>
	<li>Nehmen Sie das Volumen von 0,2 Absorptionseinheiten in sterilen Röhren, Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen mit 0,5 ml sterilem Wasser durch Wirbeln für 5 s. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Verdünnung der Zellen in 2 ml frischem YPGal-Medium.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 200 Umdrehungen/ Min.und 30 °C, bis OD600 1,5–1,9 Werte erreicht. HINWEIS: Die Hefewachstumsraten variieren, also seien Sie bereit zu warten. Es ist vernünftig, die Schritte 1.3–1.6 am frühen Morgen zu machen. Es dauert in der Regel 4-5 h, kann aber länger dauern.</li>
</ol>2. Radioaktive Isotopen-Einarbeitung
<ol><li>Übertragen Sie das Kulturvolumen, das einer optischen Einheit in einem Mikrozentrifugenrohr entspricht. Drehen Sie die Rohre bei 3.000 x g für 1 min und entsorgen Sie den Überstand. Mit 0,5 ml sterilem Wasser durch Wirbeln für 5 s waschen.<ol>
<li>Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Hefezellen in 0,5 ml sterilem Translationspuffer resuspendieren. Legen Sie die Aufhängung in ein 15 ml Rohr. HINWEIS: Der Translationspuffer ist eine Lösung, die 2% Galaktose (w/v) und 50 mM Kaliumphosphat mit pH 6.0 enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cycloheximid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zur Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min Aufreger bei 200 Rpm und 30 °C, um die zytosolische Übersetzung zu hemmen. HINWEIS: Cycloheximidlösung (20 mg/ml, in Ethanol) sollte vor dem Experiment frisch zubereitet werden. Chloramphenicol kann erfolgreich mit Anisomycin in der gleichen Konzentration ersetzt werden7.</li>
	<li>Fügen Sie der Zellsuspension 25–30 Ci von 35S-Methionin hinzu und inkubieren Sie 30 min Aufreger bei 200 Umdrehungen bei 200 Rprossen und 30 °C. HINWEIS: Die Mischung aus 35S-Methionin und 35S-Cystein kann auch verwendet werden. Pure 35S-Methionin ergibt das stärkste Signal und das beste Signal-Rausch-Verhältnis. Im Allgemeinen ist Methionin effektiver als Cystein, weil der Gehalt dieser Aminosäure in mitochondrialen Proteinen höher ist. Die EasyTag-Mischung aus 35S-Methionin und Cystein ist jedoch kostengünstiger und liefert vergleichbare Ergebnisse7. VORSICHT: 35S-Methionin ist radioaktiv. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken für den Umgang mit radioaktiven Stoffen. HINWEIS: Es ist allgemein bekannt, dass die Einbeziehung von Radioaktivität eine Grenze erreicht, aufgrund derer sich die Gesamtsignale im Laufe der Zeit absetzen. Sobald diese Grenze erreicht ist, ist es fast unmöglich, die Raten zu bestimmen, mit denen die verschiedenen Übersetzungsprodukte synthetisiert werden. Um die Rate der mitochondrialen Übersetzung zu analysieren, ist es zwingend erforderlich, in einem Zustand zu sein, in dem die Signalintensität mit der Zeit der Inkubation mit 35S-Methionin in linearer Weise zunimmt. Bei gängigen Labor-Wildtyp-Stämmen ist das Signal bereits für Inkubationszeiten gesättigt, die weit kürzer sind als die 30 min. Translationale Mutanten können sich sehr unterschiedlich verhalten. Es sollte ein Zeitkurs durchgeführt werden, um die Kinetik der Radioaktivitätsintegration und damit die Übersetzungsrate zu ermitteln, zumindest wenn mit einer neuen Sorte gearbeitet wird. Hierfür empfehlen wir, Proben mit einem Intervall von mehreren Minuten (z. B. 2,5, 5,0, 7,5, 10 und 20 min) zu nehmen.</li>
	<li>Fügen Sie unbeschriftetes "kaltes" Methionin (Endkonzentration sollte 20 mM betragen) und Puromycin (Endkonzentration sollte 1–10 g/ml betragen) hinzu, um die Etikettierung zu stoppen. 10 min aufstellen bei 200 Umdrehungen bei 200 Umdrehungen und 30 °C inkubieren. HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um Ribosomen Zeit zu geben, um die Übersetzung der Peptide abzuschließen. Andernfalls werden alle Polypeptide, die kürzer als die volle Länge sind, in einer anderen Größe erkannt. In diesem Schritt kann ein Zeit-Kurs-Experiment (Pulse-Chase) durchgeführt werden, um die Stabilität von mitochondrialen Übersetzungsprodukten zu bestimmen. Setzen Sie dazu die Inkubationsaufnahme mit einem Intervall von 30 min (z. B. 30, 60, 90 und 120 min) fort.</li>
</ol>3. Hefezelllyse und Extraktion von Proteinen
<ol><li>Sammeln Sie Hefezellen durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 30 s. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml sterilem Wasser, indem Sie 5 s wirbeln. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand. Hinweis. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.</li>
	<li>Fügen Sie dem Pellet 75 L Lysepuffer und Wirbel für 5–10 s hinzu. HINWEIS: Lysispuffer ist eine Lösung aus 1,8 M NaOH, 1 M β-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF in Wasser. Vermeiden Sie eine übermäßige Inkubation mit Lysepuffer, der zu einer alkalischen Hydrolyse von Proteinen führt. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.3 fort.</li>
	<li>Fügen Sie 500 l von 0,5 M Tris-HCl Puffer mit pH 6.8 hinzu. Wirbel kurz.</li>
</ol>4. Niederschlag von Proteinen
VORSICHT: Methanol und Chloroform sind organische Lösungsmittel. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken für den Umgang mit organischen Stoffen.
<ol><li>Fügen Sie der Probe 600 l Methanol hinzu. Wirbel für 5 s.</li>
	<li>Fügen Sie der Probe 150 l Chloroform hinzu. Wirbel für 5 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben für 2 min bei 12.000 x g. Entsorgen Sie die obere Phase vorsichtig mit einem Sampler.</li>
	<li>Fügen Sie der Probe 600 l Methanol hinzu. Mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben für 2 min bei 12.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Pellet 2 min bei 80 °C lufttrocknen. HINWEIS: Die gesamte Flüssigkeit sollte verdampfen. Es besteht die Gefahr einer abwegigen Trennung von Proteinen im Gel, wenn das Pellet unzureichend getrocknet wurde. Es ist jedoch nicht möglich, das Pellet zu übertrocknen, so dass es sogar über Nacht bei 4 °C gelagert werden kann.</li>
	<li>Lösen Sie ausgefällte Proteine in 60 l 1x Laemmli-Probenpuffer auf.</li>
	<li>10 min bei 40 °C erhitzen. HINWEIS: Vermeiden Sie das Kochen der Proben bei 95 °C, da dies zu einer Aggregation führt. Wenn sich die Aggregate noch bilden, drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 2 min und sammeln Sie den Überstand. Proben können bei -20 °C gelagert werden. Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>5. SDS-PAGE
<ol><li>Gießen Sie das 17,5% Laemmli SDS-Polyacrylamid-Gel. HINWEIS: 6 M Harnstoff kann dem Gel hinzugefügt werden, um besser atp8 und atp9 aufzulösen. Gradient 15%–20% Gele können auch eine bessere Auflösung geben.</li>
	<li>Legen Sie 15 l (40–50 g) jeder Probe in die Taschen. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Proteinkonzentration zu messen, wenn die OD600-Werte in Schritt 1.6 nahe waren. Wenn nicht, messen Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Assay mit waschmittelkompatiblen Reagenzien.</li>
	<li>Führen Sie das Gel in einem kalten Raum, bis der blaue Farbstoff etwa 65% der Gellänge erreicht. HINWEIS: Für das verwendete System (z. B. Protean II xi Cell) verwenden wir einen der beiden Modi: 16–17 h bei 5 V/cm oder 5 h bei 15 V/cm. Keine Proteine laufen schneller als der Bromphenol-Blaufarbstoff, aber lange Läufe können zu Einer Verwischung der atp8- und atp9-Signale führen.</li>
	<li>Färben Sie das Gel mit Coomassie brillant blau und machen Sie einen Scan oder Foto, die als Ladekontrolle erforderlich ist. HINWEIS: Eine alternative Möglichkeit, eine Belastungskontrolle zu machen, ist die Immunoblotting mit einem Antikörper gegen das mitochondriale "Haushalte"-Gen, z. B. Porin 1.</li>
</ol>6. Autoradiographie
<ol><li>Trocknen Sie das Gel in einem Gel-Trockner. Bewahren Sie es 3–5 Tage lang mit einem Phosphor-Speicherbildschirm in der Kassette auf. HINWEIS: Eine Alternative zum Screening des getrockneten Gels ist die Übertragung von Proteinen auf eine Nitrocellulosemembran durch Elektro-Blotting und anschließendes Screening. Es führt zu stärkeren Signalen und schärferen Bändern.</li>
	<li>Scannen Sie den Bildschirm auf einem Phosphorimager. HINWEIS: Als Alternative zur Phosphor-Bildgebung kann auch Röntgenfilm verwendet werden, um die Signale zu offenbaren.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
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<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
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<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Untersuchungen der Genexpression spielen einen zentralen Teil der modernen Biowissenschaften ein. Es wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die Einblicke in diesen komplexen Prozess geben. Hier beschrieben wir die Methode, die den Zugang zur Proteinbiosynthese in der Bäckerhefe S. cerevisiae mitochondria ermöglicht. Es wird in der Regel angewendet, um die Übersetzungseffizienz der mRNAs in Mitochondrien des mutierten Hefestamms im Vergleich zum Wildtyp zu vergleichen, um auf die Folgen der untersuchten Mutation ...

Mitochondrien sind die Organellen, die tief in den Stoffwechsel einer eukaryotischen Zelle involviert sind. Ihre Elektronentransferkette versorgt die Zelle mit ATP, der wichtigsten energetischen Währung, die in mehreren biochemischen Bahnen verwendet wird. Außerdem sind sie an Apoptose, Fettsäure- und Hämsynthese und anderen Prozessen beteiligt. Dysfunktion der Mitochondrien ist eine bekannte Quelle der menschlichen Krankheit1. Es kann aus Mutationen in nuklearen oder mitochondrialen Genen resultieren, die strukturelle oder regulatorische Komponenten der Organellen kodieren2. Bakers Hefe Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung der mitochondrialen Genexpression. Erstens ist ihr Genom vollständig sequenziert3, gut annotiert, und eine große Summe von Daten ist bereits in der Literatur dank der langen Geschichte der Untersuchungen mit diesem Organismus durchgeführt. Zweitens sind die Manipulationen mit ihrem Kerngenom aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und ihres hocheffizienten homologen Rekombinationssystems relativ schnell und einfach. Drittens ist die Bäckerhefe S. cerevisiae einer der wenigen Organismen, für die die Manipulationen mit mitochondrialen Genomen entwickelt werden. Schließlich ist Bäckerhefe ein aerobe-anaerobe fakultativer Organismus, der die Isolierung und Untersuchung von atemmedizinischen defekten Mutanten ermöglicht, da sie in Medien wachsen können, die fermentierbare Kohlenstoffquellen enthalten.
Wir beschreiben die Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Genexpression der Bäckerhefe S. cerevisiae auf der Translationsebene4. Sein Hauptprinzip ergibt sich aus mehreren Beobachtungen. Erstens kodiert das Hefemitochondrialgenom nur acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-c-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondriales ribosomales Protein Var1p5. Diese Zahl ist klein, und alle von ihnen können durch Elektrophorese auf einem einzigen Gel unter den entsprechenden Bedingungen getrennt werden. Zweitens gehören mitochondriale Ribosomen eher zur prokaryotischen Klasse als zu eukaryotischen6, und daher ist die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bei Hefezytoplasma- und Mitochondrienribosomen unterschiedlich. Es ermöglicht die Hemmung der zytoplasmatischen Translation mit Cycloheximid, die Bedingungen, wenn die markierte Aminosäure(35S-Methionin) nur in mitochondrialen Übersetzungsprodukten enthalten ist. Als Ergebnis liefert das Experiment Informationen über die Rate der Aminosäure-Inkorporation in mitochondrialen Proteinen synthetisiert de novo, was die Gesamteffizienz der mitochondrialen Übersetzung für jedes der acht Produkte widerspiegelt

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologischer Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biowave Zelldichtemessgerät CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>MARKE Standard Einwegküvetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galaktose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>digitaler Blockheizer</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Methionin, 500&micro; Ci (18,5 MBq), stabilisierte wässrige Lösung</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Lagerung Phosphor Siebe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenbisacrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton aus Fleisch, bakteriologisch</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochlorid aus Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 Phosphor-Imager</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumbeheizter Geltrockner</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

kennzeichnung und visualisierung von mitochondrialen genomexpressionsprodukten in baker es yeast saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die aerobe Atmung können. Sie enthalten kreisförmige Genom- und Genexpressionsapparate. Ein mitochondriales Genom der Bäckerhefe kodiert acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-C-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondrialem ribosomalem Protein Var1p. Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist es, diese Proteine gezielt mit 35S Methionin zu kennzeichnen, sie durch Elektrophorese zu trennen und die Signale als diskrete Bänder auf dem Bildschirm zu visualisieren. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Zunächst werden Hefezellen in einem Galaktose-haltigen Medium kultiviert, bis sie das späte logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Als nächstes blockiert die Cycloheximid-Behandlung die zytoplasmatische Translation und erlaubt 35S-Methionin-Einarbeitung nur in mitochondriale Translationsprodukte. Anschließend werden alle Proteine aus Hefezellen extrahiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Schließlich wird das Gel getrocknet und mit dem Speicherphosphor-Bildschirm inkubiert. Der Bildschirm wird auf einem Phosphorimager gescannt, der die Bänder enthüllt. Die Methode kann angewendet werden, um die Biosyntheserate eines einzelnen Polypeptids in der Mitochondrie eines mutierten Hefestamms mit dem Wildentyp zu vergleichen, der für die Untersuchung von mitochondrialen Genexpressionsdefekten nützlich ist. Dieses Protokoll liefert wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate aller Hefe mitochondrialen mRNAs. Es erfordert jedoch mehrere Kontrollen und zusätzliche Experimente, um richtige Schlussfolgerungen zu ziehen.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei S. cerevisiae Stämmen zugewiesen: den wilden Typ (WT) und eine mutierte Lagerlöschung des AIM23-Gens (AIM23 ),die mitochondrialen Translationinitiationsfaktor 3 (Tabelle 1)8kodieren. Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden in SDS-PAAG9 radioaktiv gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle 2,5 min vor der Sättigung gesammelt, um einen Zeitkurs...

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die zur aeroben Atmung geeignet sind. Ihre Dysfunktion ist eine bekannte Quelle menschlicher Krankheiten. Bakers Hefemitochondrien enthalten kreisförmige Genome, die acht Proteine kodieren.In diesem Video beschrieben wir das Protokoll zur Assay-Proteinbiosynthese in Hefemitochondrien mittels radioaktiver Kennzeichnung von Translationalprodukten und anschließender Trennung durch Gelelektrophorese. Das Verfahren umfasst mehrere wichtige Schritte. Streifen Hefe aus gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit geeignetem Medium.Legen Sie die Platten in den Kultur-Inkubator bei 30 Grad für 24 bis 48 Stunden. Impfen Sie diese Kulturen in zwei Milliliter Medium aus dem frischen Streifen in einem 15-Milliliter-Rohr und inkubieren sie über Nacht bei 200 U/min bei 30 Grad. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern.Nehmen Sie das Volumen entsprechend 0,2 Absorptionseinheiten in sterilen Röhren Palette Hefezellen bei 9 000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie diesen Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser, indem Sie fünf Sekunden lang wirbeln.Pallette Hefezellen bei 9.000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand. Verdünnen Sie Zellen in zwei Milliliter frisches Wischagarmedium.Inkubationskante bei 200 Umdrehungen/ min und 30 Grad, bis die optische Dichte zwischen 1,5 und 1,9 von 1,5 bis 1,9 Werte reicht. Übertragen Sie das Kulturvolumen, das einer optischen Einheit in einem Mikrozentrifugenrohr entspricht. Drehen Sie die Rohre bei 3000 G für eine Minute.Entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser, indem Sie fünf Sekunden lang wirbeln. Pallette Hefezellen bei 9.000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur Entsorgen Sie den Überstand.Hefezellen in 0,5 Milliliter sterilem Translationspuffer wieder aussetzen. Legen Sie die Suspension in 15 Milliliter Rohr. Fügen Sie Cycloheximid zur Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter Inkubat für fünf Minuten Rand bei 200 RPM und 30 Grad hinzu, um die zytosolische Übersetzung zu hemmen.Fügen Sie von 25 bis 30 Hinzufügen von 25 bis 30 Mikrocurie von S35 Methionin von S35 Methionin zu Zellsuspension und inkubieren für 30 Minuten Rand bei 200 RPM und 30 Grad genommen. Fügen Sie unbeschriftetes kaltes Methionin und Borymycin hinzu, um die Etikettierung Incubate für 10 Minuten Kante bei 200 RPM und 30 Grad zu stoppen. Sammeln Sie Hefezellen durch Zentrifugation bei 9.000 G für 30 Sekunden.Waschen Sie die Zellen mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser, indem Sie fünf Sekunden lang wirbeln. Pallette Hefezellen bei 9.000 G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand.Fügen Sie der Palette 75 Mikroliter Lysepuffer und Wirbel für fünf bis zehn Sekunden hinzu. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,5 Moltris Puffer von 0,5 Molarentris Puffer mit pH 6,8 hinzu. Mit pH 6.8.Wirbel kurz. 600 Mikroliter Methanol in die Probe geben. Wirbel für fünf Sekunden.150 Mikroliter Chloroform in die Probe geben. Wirbel für fünf Sekunden. Zentrifugieren Sie die Proben für zwei Minuten bei 12.000 G. Verwerfen Sie die Opaface vorsichtig mit einem Sampler.600 Mikroliter Methanol in die Probe geben. Mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Zentrifugenproben für zwei Minuten bei 12.000 G.Discard Überstand.Die Palette trocknet die Palette zwei Minuten bei 80 Grad. Lösen Sie gefällte Proteine in 60 Mikroliter Laemmli-Probenpuffer auf. Die Proben 10 Minuten bei 14 Grad erhitzen.Verursachen Sie das 17.5%Laemmli SDS Polyacrylamid Gel. 15 Mikroliter jeder Probe in die Taschen geben. Führen Sie das Gel im kalten Raum, bis der blaue Farbstoff etwa 65% der Gel-Lymphe erreicht.Färben Sie das Gel mit Kumasi brillant blau und machen Scan oder Foto, die als Ladekontrolle erforderlich ist. Trocknen Sie das Gel im Geltrockner. Bewahren Sie es drei bis fünf Tage lang in der Kassette mit Phosphor-Speicherbildschirm auf.Scannen Sie den Bildschirm auf Phosphor-Imager. Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei Saccharomyces cerevisiae-Stämmen zugewiesen. Der wilde Typ und die mutierte Variantenlöschung des Aim23-Gens, das mitochondriale Translationinitiationsfaktor drei kodiert.Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden bereits aktiv im denaturierenden Polyacrylamid-Gel gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle zweieinhalb Minuten vor der Sättigung gesammelt, um den Zeitverlauf aufzubauen. Das Gel wurde nach der fünftägigen Exposition gebeizt, getrocknet und gesiebt.Bei einem erfolgreichen Experiment zeigt das Bild acht Bänder, die nach dem Standardmuster zugeordnet sind. Die Intensitäten der einzelnen Bänder können jedoch je nach Dehnung und experimentellen Bedingungen sehr variabel sein. Jede Band entspricht einem Übersetzungsprodukt.Die Daten deuten darauf hin, dass der mutierte Stamm in der Lage ist, mitochondriale Proteinsynthese, weil alle Produkte, die in der wilden Art erscheinen, in diesem Mutanten sichtbar sind. Die Intensitäten der Bänder unterscheiden sich jedoch vom Wildtyp, was bedeutet, dass diese Deletion von Aim23 die mitochondriale Genexpression beeinflusst. Kumasi in blauem Fleck gebraut und dient als Ladekontrolle.Ihr Ergebnis in Daten kann quantifiziert werden, um Unterschiede zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen mit Image G oder Image Quan Software zu identifizieren. Für diese wird das Verhältnis des Signals, das jedem Produkt entspricht, zum Gesamtsignal berechnet. Mittelwerte und Standardabweichungen werden in mindestens drei unabhängigen Experimenten berechnet.Die Kinetik des umgedrehten synthetisierten Proteins wird im Experiment des vergangenen Jahres untersucht. Die Proben werden zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt, nachdem die Etikettierungsreaktion durch kaltes Methionin und Borymycin gestoppt wurde. Diese Kontrolle ist notwendig, um die Stabilität des Produkts zu schätzen.Immunfärbung mit Anti-Porin ein Antikörper ist eine Belastungskontrolle. Wir beschrieben die Methode, die oft verwendet wird, um Proteinbiosynthese in Hefe mitochondrien zu studieren. Dieses Protokoll ist relativ einfach und schnell durchzuführen.Gleichzeitig ermöglicht es, wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate von vier Hefe-mitochondrialen mRNAs zu erhalten, was sehr vorteilhaft ist. Es hat jedoch mehrere Einschränkungen, die zusätzliche Experimente erfordern, und liegt in diesem zwischenstaatlichen Niveau von Proteinen und mRNAs. Es kann die Informationen über diese Funktionen in mitochondrialen Übersetzungssystem zur Verfügung stellen, aber fortgeschrittenere Techniken sollten verwendet werden, um den Mechanismus zu entdecken.

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

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Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

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